поглощение света. Закон Бугера Ламберта, бера

Поглощение света - это явление уменьшения интенсивности света при прохождении его через вещество. Уменьшение интенсивности света происходит в результате того, что энергия света переходит в другие виды энергии: энергию активизации, ионизации молекул, энергию теплового хаотического движения частиц в веществе и др. При прохождении монохроматического света через окрашенные растворы небольшой концентрации (С? 20%) и при условии, что растворитель не поглощает данную длину волны, интенсивность света также убывает по экспоненциальному закону. Закон поглощения света для окрашенных растворов называют законом Бугера-Ламберта-Бера: I= Io* e^- чcd, где С - концентрация раствора; ч - показатель поглощения для раствора единичной концентрации, зависит от природы растворенного вещества и длины волны падающего света.

Спектральные свойства и характеристики хромофоров. Диаграмма Яблонского

Хромофор - молекула, способная поглощать свет определенного диапазона длин волн.

Так, карбонильная группа СО является хромофором, поглощающим в области 280 нм, в то же время кетоны - бесцветные вещества.

Первичными стадиями фотобиофизического процесса являются поглощение света хромофорной группой и образование электронно- возбужденных состояний (ЭВС). При поглощении света молекулы, ионы, атомы, радикалы и другие типы частиц, участвующих в химических превращениях, могут переходить в электронно-возбужденные состояния. В них происходит изменение физических и химических свойств молекул по сравнению с основным состоянием. Меняются дипольный момент, геометрия, распределение электронной плотности, кислотно-основные свойства и т. д., и молекулы в возбужденном состоянии обладают иной реакционной способностью, что проявляется не столько в изменении скорости реакции, сколько в их ином, по сравнению с основным состоянием, направлении. Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским

В основном состоянии все электроны занимают самые низшие электронные уровни и расположены на орбиталях попарно, причем их спины имеют противоположное направление (антипараллельны). Такое состояние молекулы называют синглетным невозбужденным (основным) состоянием и обозначают как S0. Так же обозначают энергетический уровень невозбужденной молекулы

При поглощении света происходит переход одного из электронов на вышележащую орбиталь, но его спин не меняется. Такое состояние молекулы и ее энергетический уровень обозначают как S1 или S2 в зависимости от того, на какой уровень перешел электрон. Это синглетное возбужденное состояние обозначают как S*. Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S0, S1, и S2 соответственно. Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Влияние растворителя в данной схеме во внимание не принимается. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит примерно за 10-15 с - время, слишком короткое для заметного смещения ядер.

Эта работа заняла первое место в номинации «лучшая обзорная статья» конкурса « »-2014.

Как известно, однажды свет был успешно отделен от тьмы . С тем, что такое тьма, еще предстоит разобраться. Пока наметились лишь некоторые перспективы в этом направлении в связи с изучением темной материи и темной энергии . А вот свет человечество давно и успешно изучает и использует, в том числе в качестве исследовательского «инструмента». Одно из направлений использования света в экспериментальных исследованиях связано с явлением флуоресценции. За последние тридцать лет использование различных методов, основанных на регистрации флуоресценции, в биологических и медицинских исследованиях стремительно возросло. Обусловлено это появлением как новых технических возможностей - в первую очередь компьютеров и лазеров, - так и широкого спектра доступных флуоресцирующих молекул и молекулярных комплексов. Словно микроскопические репортеры эти соединения сообщают нам особыми световыми сигналами о свойствах молекулярного мира, в котором они находятся. Флуоресцентная методология обеспечила решение многих принципиальных задач биологии и медицины. Благодаря высокой чувствительности и сравнительной безопасности она вытеснила многие традиционные методы, связанные с применением радиоактивных веществ. Методы флуоресцентного анализа используются как в фундаментальных исследованиях для получения новых знаний о живом, так и в прикладных работах в биотехнологии, медицинской диагностике, криминалистике и многих других областях. Что же представляют собой флуоресцентные репортеры? Какую информацию можно получить с их помощью из глубин микромира? Как эту информацию регистрируют и анализируют? Но прежде всего - что такое флуоресценция?

Флуоресценция: свечение, индуцированное светом

Некоторые вещества после поглощения света в определенном диапазоне длин волн начинают излучать свет в другом, более длинноволновом, диапазоне. Впервые это явление было описано как видимое изменение цвета растворов некоторых органических соединений и минералов при наблюдении не на просвет (в проходящем свете), а под углом к проходящему свету. Так, например, Дэвид Брюстер (Sir David Brewster) в 1833 году заметил, что при освещении белым светом зеленого спиртового раствора хлорофилла от него «отражается» красный свет. Позднее, в 1845 году, Джон Хершель (Sir John Herschel) описал подобные наблюдения - появление голубой окраски у бесцветного раствора сульфата хинина при облучении солнечным светом. В 1852 году Джордж Стокс (George Gabriel Stokes) обнаружил видимое на глаз свечение минерала флуорита при его облучении невидимым ультрафиолетовым излучением. Учитывая источник происхождения наблюдавшегося свечения, он назвал это явление флуор есценцией, как он отметил, по аналогии с термином опал есценция, описывающим явление дихроизма в опале. Важно отметить, что эти термины не только отражают «историю» своего происхождения, но, что более важно, обозначают разные физические явления. Флуоресценция - это излучение , возникающее в молекулах вещества под влияние света. Опалесценция - это рассеяние света, которое иногда сопровождается интерференцией.

По своей сущности флуоресценция является одной из разновидностей люминесценции . Этим термином описывают все явления излучения веществом, вызванного «возбуждением» молекул различными факторами. Так, например, в некоторых химических реакциях возникает хеми люминесценция. Хемилюминесценцию в биологических объектах называют био люминесценцией*. Есть вещества, которые испускают свет при возбуждении электрическим током (электро люминесценция), быстрыми электронами (катодо люминесценция), γ-излучением (радио люминесценция) и другие. В этом контексте флуоресценция относится к категории фото люминесценции.

* - Недавно на «биомолекуле» вышла замечательная статья, описывающая открытие нового типа биолюминесценции: « » . - Ред.

Способные флуоресцировать атомы, молекулы и молекулярные комплексы называют флуорофорами или флуорохромами . Обычно этими терминами пользуются как синонимами. Однако в ряде источников под флуорохромами понимают все виды флуоресцирующих молекул, а под флуорофорами - только флуоресцирующий компонент (группировку) крупной молекулы. В классической монографии Дж. Р. Лаковица используется только один термин - флуорофор, для всех типов флуоресцирующих веществ. С целью единообразия мы будем пользоваться этим термином. Отметим также, что в исследовательской практике ковалентно присоединенный к макромолекуле флуоресцирующий компонент принято называть флуоресцентной меткой , а свободный флуорофор - зондом . Применяемые в микроскопии флуорофоры традиционно именуют флуоресцентными красителями . Наконец, некоторые авторы стали использовать термин биосенсоры в отношение флуорофоров, используемых в биологических исследованиях.

Физическую природу флуоресценции удобно проиллюстрировать, пользуясь диаграммой, которую предложил польский физик Александр Яблонский в 1933 году, и которая носит его имя. На рисунке 1 представлена упрощенная форма этой диаграммы.

Рисунок 1. Диаграмма Яблонского , иллюстрирующая электронные процессы в молекулах-флуорофорах при поглощении квантов света. Горизонтальные линии - энергетические уровни электронов: S 0 - основное, невозбужденное состояние; S 1 - синглетное возбужденное состояние; 0–3 - квантованные подуровни; Т 1 , Т 2 - квантованные уровни триплетного возбужденного состояния. Стрелками показаны переходы электронов в разные энергетические состояния: П - поглощение света, Фл , Фосф - испускание флуоресценции и фосфоресценции, соответственно, ВК - внутренняя конверсия, ИК - интеркомбинационная конверсия, ВР - вибрационная релаксация.

При поглощении фотонов определенной энергии в молекуле флуорофора происходит переход электронов из «основного» (S 0) на один из подуровней «возбужденного» (S 1 , S 2 , ..., S n) состояния с более высокой энергией. Спин электрона при переходе не меняется, и поэтому эти уровни называют синглетными. «Возбужденное» состояние нестабильно, и электроны быстро возвращается на исходный энергетический уровень. Происходить это может несколькими путями. Три из них - безызлучательные квантовые переходы: внутренняя конверсия, интеркомбинационная конверсия и вибрационная релаксация . Два других сопровождаются излучением света - это флуоресценция и фосфоресценция . При внутренней конверсии энергия электрона уменьшается до минимального синглетного уровня. В ходе вибрационной релаксации, которая вызвана преимущественно взаимодействием с окружающими молекулами, поглощенная энергия может «рассеяться» в виде тепла до «основного» уровня. Интеркомбинационная конверсия приводит к уменьшению энергии электронов с изменением спина. Такое энергетическое состояние электрона называется триплетным. Флуоресценция возникает при переходе с нижнего синглетного уровня в «основное» состояние, а фосфоресценция - при переходе в «основное» состояние с триплетного уровня.

Отметим три важных обстоятельства.

• Во-первых, вероятности вышеотмеченных переходов различаются. Представление об этом дает сравнение времени, за которое осуществляется каждый из этих переходов, иными словами, время пребывания электронов в каждом из этих состояний (таблица 1). Чем меньше время, тем более вероятен данный переход. Очевидно, что флуоресценция и тем более фосфоресценция - маловероятные процессы. Это проявляется в сравнительно слабом свечении большинства флуорофоров даже при интенсивном облучении.
• Во-вторых, поскольку флуоресценция возможна при переходе электронов в «основное» состояние только с самого низкого синглетного уровня, то энергия излучения меньше поглощенной энергии. Поэтому спектр флуоресценции флуорофора всегда находится в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения.
• И, наконец, в-третьих, состояние электронов, участвующих в вышеуказанных процессах, зависит как от физических факторов окружающей среды, так и от общей электронной конфигурации молекулы. Именно это обстоятельство и делает флуорохром молекулярным репортером , который «на языке» флуоресценции сообщает о физико-химических условиях своего окружения.

«Язык» флуоресцентных репортеров

Флуоресценция характеризуется рядом параметров, которые меняются в зависимости от физического окружения или химической модификации флуорофора. Эти параметры и являются тем «языком», на котором передается информация от флуоресцентного репортера. Если продолжить аналогию, то сами параметры подобно словам приобретают конкретный смысл только при определенной их комбинации и в контексте. «Контекстом» для параметров флуоресценции являются условия их регистрации. Флуоресценция всех флуорофоров имеет пять ключевых характеристик: спектры поглощения и флуоресценции, а также квантовый выход, время жизни и анизотропия флуоресценции.

Каждый флуорофор имеет индивидуальные спектры поглощения и флуоресценции . Для иллюстрации на рисунке 2 представлены спектры Lyso Tracker TM Blue (Molecular Probes ®) и флуоресцеина. Основными параметрами спектров являются интенсивность флуоресценции, положение максимумов и так называемая полуширина (ширина спектра на уровне половины максимума). Часто именно эти параметры «информируют» об определенных свойствах окружения, в котором находится репортер. Так, в спектре флуоресценции многих флуорохромов возникают характерные изменения при разных рН среды. На рисунке 2 в качестве примера показана рН-зависимость спектра флуоресценции Lyso Sensor TM Yellow/Blue (Molecular Probes ®). Если такие изменения специфические, т.е. могут быть вызваны только сдвигами рН, то данный флуорофор может быть рН-репортером. Lyso Sensor TM Yellow/Blue является одним из таких репортеров.

Квантовый выход флуоресценции - это характеристика эффективности, с которой поглощенная энергия трансформируется в излучение по сравнению с процессами безызлучательной релаксации. Количественно квантовый выход определяется как отношение числа высвеченных фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем больше интенсивность свечения флуорофора. Часто этот показатель является решающим при выборе флуорофора на роль флуоресцентного репортера. Например, флуоресцеин имеет квантовый выход около 0.9, что и обеспечивает его широкое использование как в роли самостоятельного зонда, так и в качестве флуоресцентной метки нефлуоресцирующих молекул. Важно также и то, что этот показатель очень чувствителен к различным физико-химическим взаимодействиям репортера.

Время жизни флуоресценции - это усредненное время, в течение которого молекулы флоурофоров находятся в возбужденном состоянии перед испусканием фотонов флуоресценции. Измеряется этот показатель по затуханию флуоресценции после кратковременного возбуждения. Время жизни флуоресценции, с одной стороны, очень «чувствительно» к физико-химической «обстановке», в которой находится флуоресцентный репортер. С другой стороны, этот показатель является специфической характеристикой флуорофора, что позволяет получать «репортажи» от него в присутствии других флуоресцирующих молекул с похожими спектральными характеристиками.

Анизотропия флуоресценции - это количественная характеристика зависимости поляризации флуоресценции от поляризации возбуждающего света. По анизотропии можно судить о вращательной подвижности репортера и тем самым о вязкости среды в его микроокружении.

Пять вышеуказанных параметров флуоресценции являются непосредственно измеряемыми характеристиками излучения, которое «передают» репортеры. Однако информационные возможности флуоресцентных репортеров этим не ограничиваются. С флуоресценцией связан ряд явлений, которые используются в качестве методических «ухищрений» для получения той или иной информации от флуоресцентных репортеров.

Так, например, существует явление безызлучательной (резонансной) передачи энергии (БПЭ) от одного флуорофора на другой. При этом интенсивность флуоресценции у донора энергии уменьшается, а у акцептора возрастает. Происходить это может между флуорофорами с определенными спектральными свойствами и, что особенно важно, если они находятся на достаточно близком расстоянии. БПЭ лежит в основе многих методических подходов, позволяющих выявлять взаимодействие молекул. Определение эффективности безызлучательной передачи энергии позволяет даже оценивать расстояние между молекулами. В связи с этим БПЭ иногда называют «молекулярной линейкой» (см.: « » ).

Ряд методических возможностей базируется на тушении флуоресценции. Тушение может быть вызвано физическим взаимодействием флуорофора с молекулами-тушителями - такими, как кислород, галогены, амины, а также некоторые «электрон-дефицитные» органическими молекулы. В этом случае флуоресцентный репортер может «сообщать» о присутствии в его окружении определенных «тушителей».

Тушение флуорофора может происходить также за счет фотообесцвечивания под влиянием излучения большой интенсивности. В большинстве случаев с точки зрения регистрации флуоресценции это негативное явление. Однако «в умелых руках» это явление используется как специальный методический прием. Широкое распространение в изучении вязкости и/или диффузионных свойств цитоплазмы клеток получила методика восстановления флуоресценции флуорофора после фотообесцвечивания. Сущность ее заключается в том, что в небольшом участке клетки, содержащей флуорофор, производится его обесцвечивание кратковременной мощной вспышкой лазера. Затем регистрируется восстановление флуоресценции в том же участке, что обусловлено диффундирующими из других областей клетки не обесцвеченными молекулами флуорофора. По динамике этого процесса и характеризуют диффузионные свойства цитоплазмы.

Флуоресцентные репортеры, какие они?

Способностью флуоресцировать обладают многие вещества с определенными конфигурациями электронов. Такие конфигурации складываются в некоторых атомах, молекулах и надмолекулярных комплексах. Однако требуются специальные исследования для выявления потенциальной «способности» флуорофора выступать в роли молекулярного репортера для биологических и медицинских исследований. «Способности» эти оцениваются по специфичности информации, которую они передают, их стабильности, в первую очередь фотостабильности, в ряде случаев учитывается токсичность для отдельных клеток или организма. Особенностью флуоресцентных «корреспондентов» является их высокая индивидуальная «специализация». «Специализация» каждого репортера характеризуется по взаимодействию с определенными компонентами биологической системы, а также по специфичности флуоресцентных сигналов. Условно можно выделить две группы репортеров, созданных на основе органических и неорганических флуорофоров.

Органические молекулы-флуорофоры представляют наиболее многочисленную и разнообразную группу флуоресцентных репортеров. Как велико это разнообразие, можно оценить, заглянув в каталог фирмы Molecular Probes , специализирующейся на разработке и производстве флуорофоров c 1975 года. Это уже одиннадцатое издание (обновление) каталога (на момент написания статьи), что свидетельствует о высоких темпах развития данной области.

Большое разнообразие органических флуоресцентных репортеров обусловлено широким спектром задач и условий их применения. При выборе или при разработке репортеров принимаются во внимание информация, которую нужно получить, спектральные свойства флуорофора, а также специальные условия, связанные с особенностями исследуемой системы. Проиллюстрируем это на примере флуоресцеина и его производных (рис. 4). Как уже отмечалось, этот флуорофор имеет высокий квантовый выход и, соответственно, яркую флуоресценцию. Он может выступать в роли репортера рН. Однако, например, для измерения рН внутри клеток он не подходит, т.к. не проникает через цитоплазматическую мембрану. Его «доставка» в клетки может быть осуществлена с использованием гидрофобного производного - флуоресцеиндиацетата, который утратил способность флуоресцировать, но может проникать через гидрофобный барьер цитоплазматической мембраны. В клетках эстеразы отщепляют ацетильные группировки, и флуоресцеин оказывается в клетках. Аналогичным образом доставляется в клетки дихлорфлуоресцеин, т.е. через эстерифицированное производное. Этот репортер служит для регистрации наличия в клетках активных форм кислорода. Введение изотиоцианата в молекулу флуоресцеина дает возможность присоединять флуорохром к аминогруппам не флуоресцирующих молекул. С использованием флуоресцеинизотиоцианата создаются высокоспецифичные флуоресцирующие белковые репортеры - различные антитела, стрептавидин (реагент на биотин), а также нуклеотиды и олигонуклеотиды. Наконец, 5-карбоксиметокси-2-нитробензиловый эфир флуоресцеина (не показан на рис. 4) представляет собой не флуоресцирующее производное, которое может превращается в обычный флуоресцеин при облучении светом с длиной волны 355 нм. Это пример фотоактивируемых флуорофоров, флуоресцентные свойства которых как бы «спрятаны» (англ. «caged») до облучения.

Рисунок 4. Структурные формулы флуоресцеина и некоторых его производных.

В семидесятых годах ХХ века сотрудник Принстонского университета (США) Осаму Симомура (Osamu Shimomura ) при изучении биолюминесценции медузы Aequorea victoria выделил два белка, участвующих в этом процессе. Он установил, что при взаимодействии ионов кальция с одним из выделенных белков возникает хемилюминесценция голубого цвета. При этом второй белок может поглощать голубой свет и флуоресцировать зеленым светом, что придает зеленоватый оттенок свечения медузы. Первый белок был назван экворином, второй зеленым флуоресцентным белком (ЗФБ). С этого момента начинается история одной из самых успешных разработок молекулярной биологии, а ее основные герои - Осаму Симомура, Мартин Чалфи (Martin Chalfie ) и Роджер Тсьен (Roger Tsien ) в 2008 году были удостоены Нобелевской премии в области химии за открытие и подробное изучение ЗФБ . Чем же так замечателен этот белок?

После открытия ЗФБ начались интенсивные исследования его структуры, был синтезирован и клонирован соответствующий ему ген. Кроме того у некоторых морских беспозвоночных (Hydrozoa и Anthozoa ) были обнаружены аналогичные флуоресцирующие белки, структура которых также была охарактеризована. Все это позволило с помощью методов молекулярной биологии целенаправленно конструировать гены, кодирующие модифицированные формы ЗФБ с широким диапазоном спектральных характеристик, а также такие фоторегулируемые варианты, свечение которых можно «включать и выключать» путем облучения ультрафиолетовым излучением. В настоящее время можно говорить о том, что на основе ЗФБ создана и продолжает увеличиваться целая «армия» разнообразных флуоресцентных белков (ФБ) . Возможность применения ФБ показана в исследованиях многих видов клеток от бактерий до млекопитающих.

Несколько «скромнее» по сравнению с ЗФБ пока выглядит «судьба» экворина. Его структура также была установлена, и синтезирована ДНК, кодирующая этот белок. Изучение зависимости хемилюминесценции экворина от ионов кальция позволило разработать методики измерения концентрации катиона в некоторых клетках. Для измерения содержания ионов кальция внутри клеток существуют и флуоресцентные репортеры, в том числе производные ФБ. Однако достоинством хемилюминесцентного метода с использованием экворина является отсутствие необходимости возбуждающего флуоресценцию облучения, которое не всегда является безвредным для биологической системы, да и для флуорофоров, свечение которых при длительном облучении ослабляется (эффект фотообесцвечивания). Экворин относят к сравнительно большой группе так называемых люциферинов - веществ, ответственных за био(хеми)люминесценцию у некоторых морских и наземных организмов. Изучение люциферинов представляет интерес не только с целью их практического применения. Ведь до сих пор не известно, зачем биологических объектам вообще нужна биолюминесценция.

В последние годы заметно возрос интерес к созданию флуоресцентных репортеров на основе неорганических флуорофоров путем формирования так называемых биоконъюгатов, т.е. их комплексов с некоторыми органическими соединениями и/или с биологическими молекулами. Многие атомы, например, переходные металлы, лантаниды (точнее их ионы, например, Tb 3+ и Eu 3), кластеры из нескольких атомов золота и серебра после образования таких комплексов приобретают способность к сенсибилизированной флуоресценции. Сущность явления заключается в том, что энергия света, поглощенного органическим соединением, передается на атом неорганического элемента, который и излучает флуоресценцию. Важным свойством этого процесса является то, что молекулы-доноры энергии передают ее от электронов, находящихся в триплетном состоянии. Поэтому излучение неорганических флуорофоров в таком комплексе является «замедленным» по сравнению с «обычной» флуоресценцией, поскольку время жизни электронов в триплетном состоянии заметно больше, чем в синглетном (см. табл. 1). Кроме того, спектры флуоресценции неорганических биоконъюгатов имеют небольшую ширину и сильно сдвинуты относительно спектров поглощения. Сенсибилизированная флуоресценция репортеров-биоконъюгатов делает их «полезными» с точки зрения техники регистрации излучения. Так, в частности, они используются в условиях, когда в исследуемой системе имеется «обычная» флуоресценция других компонентов в том же диапазоне длин волн.

Особое место в этой группе занимают репортеры-биоконъюгаты, в которых в качестве флуорофора используются полупроводниковые кристаллы размером 2–10 нм (нанокристаллы), получившие название квантовых точек * (англ. quantum dots ). Квантовые точки, как правило, состоят из пары элементов III/V (например, CdS, CdSe, ZnS) или II/VI групп (например, GaN, InP, InAs). Вследствие малых размеров полупроводниковых кристаллов (в них всего 10–50 атомов!) для их электронов создаются условия квантованных энергетических переходов, подобных тем, что существуют в отдельных атомах. (Квантовые точки иногда даже называют «искусственными атомами»). Причем энергия этих переходов, а тем самым и длина волны флуоресценции, зависят от размера кристалла. Чем меньше кристалл, тем больше энергия излучения, т.е. меньше длина волны флуоресценции (рис. 5). Это свойство открывает возможность создания квантовых точек, имеющих практически любую спектральную конфигурацию. К этому следует добавить, что они, по сравнению с органическими флуорофорами, обладают еще и более высоким квантовым выходом и фотостабильностью. На рис. 6 показаны примерные размеры различных флуорофоров-репортеров.

* - Кого заинтриговало это название, прочтите подробную статью « » . - Ред.

Рисунок 5. Флуоресценция коллоидных растворов квантовых точек разного размера.

Биоконъюгаты на основе квантовых точек состоят из ядра (например, CdSe), покрытого слоем полупроводникового материала (например, ZnS), выполняющего «защитную» функцию, и лиганда - какого-нибудь органического вещества, обеспечивающего растворимость и/или присоединение биологических молекул.

Рисунок 6. Относительные размеры флуоресцентных репортеров. Для сравнения показан также белок иммуноглобулин G (Ig G).

Биоорганическая оболочка биоконъюгата обеспечивает его стабильность как коллоидной частицы и формирует «задание» репортера, его целевое назначение: где и с чем провзаимодействовать, какую «собрать и передать» информацию. При этом, конечно, размеры репортера на основе квантовой точки могут существенно увеличиться (на рис. 6 показаны приблизительные размеры квантовых точек без «снаряжения» биоконъюгата). В биоорганическую оболочку могут быть включены низкомолекулярные соединения - такие как биотин - и высокомолекулярные: одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды) и белки, в том числе ферменты и антитела (Ig G).

Инструменты для «чтения» флуоресцентных репортажей

В списке инструментов для получения и анализа «сообщений» флуоресцентных репортеров исторически первым является наш глаз. С его помощью можно проводить визуальные наблюдения флуоресцентного свечения на макроскопических объектах непосредственно, а на микроскопических - с помощью флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа. Примером макроскопических объектов могут служить колонии микроорганизмов, в которых экспрессированы ФБ, хроматограммы и электрофореграммы с применением флуоресцентных красителей. А в «обычный» флуоресцентный микроскоп (о «необычных» микроскопах чуть дальше) чаще всего заглядывают для выявления иммунологических реакций с использованием меченных флуорофорами антител, а также в некоторых исследованиях на уровне единичных клеток. Однако возможности зрительного анализа существенно ограничены в основном качественной оценкой «сигналов» флуоресцентных репортеров: «есть свечение -нет свечения» в определенной области образца. Гораздо больше информации можно получить, если «читать и расшифровывать» флуоресцентные «репортажи» по количественным характеристикам свечения (см. раздел «Язык» флуоресцентных репортеров ).

Для количественной характеристики флуоресценции необходимы измерения с использованием специальных приборов и определенной методологии. Условно можно выделить две методологии измерений параметров флуоресценции. Первая служит для измерения различных характеристик флуоресценции в сравнительно большой (макроскопической) области объекта, что обеспечивает получение интегральных (усредненных ) характеристик флуоресценции по объекту: раствору, суспензии коллоидных частиц, клеток, субклеточных частиц и т.п. Вторая методология ориентируется на измерения на уровне единичных микроскопических объектов - в первую очередь клеток и субклеточных частиц.

Измерения интегральной флуоресценции проводят с помощью спектрофлуориметров (флуоресцентных спектрофотометров) и планшетных флуориметров (англ . plate readers). Спектрофлуориметры - это, как правило, аналитические приборы, на которых можно получить все основные характеристики флуоресценции. Планшетные флуориметры - это устройства, рассчитанные на массовые анализы большого количества образцов (стандартные планшеты рассчитаны на 96, 384 или 1536 образцов). Измерения в них осуществляются по нескольким фиксированным характеристикам - например, по интенсивности флуоресценции в определенной спектральной области. Недавно появились планшетные флуориметры с возможностью измерения параметров затухания флуоресценции и тем самым оценки времени жизни флуорофоров в возбужденном состоянии. Большинство методик с использованием планшетных флуориметров основано на иммунологических реакциях или на анализе развития культур клеток в монослоях.

Методология измерений флуоресценции единичных микроскопических объектов также имеет два варианта. Первый основан на получении цифровых изображений флуоресцирующих микрообъектов (англ . fluorescence imaging) с последующим их компьютерным анализом (англ . computer image analysis). Второй - на «поштучном» измерении флуоресценции микрообъектов в потоке при прохождении через узкий капилляр специального прибора - проточного цитометра (англ . flow cytometer).

Цифровые изображения флуоресцирующих микрообъектов получают с использованием флуоресцентной микроскопии, которая недавно пережила настоящую техническую революцию. Так, в частности, наряду со стандартными флуоресцентными микроскопами, существенно усовершенствованными цифровыми фотокамерами и компьютерами, разработаны принципиально новые устройства. Это прежде всего так называемые конфокальные микроскопы (рис. 8). В конфокальном микроскопе возбуждение и регистрация флуоресценции осуществляются через микроскопическое отверстие, отсекающее «лишнее» свечение, которое возникает вне фокуса объектива. Путем сканирования этим «оптическим зрачком» в горизонтальной и/или вертикальной плоскости, регистрации сигналов фотоумножителем и обработки компьютером получается пространственное изображение флуоресцирующего объекта. Такая конструкция прежде всего позволяет получать более четкие по сравнению со стандартными микроскопами двумерные и трехмерные изображения. Кроме того, на современные конфокальных микроскопах можно проводить измерения параметров затухания флуоресценции.

Рисунок 7. Конфокальный микроскоп.

Еще один тип «революционных» микроскопов функционирует... вопреки основным физическим принципам флуоресценции. Возбуждение атомов в них осуществляется светом с длиной волны больше длины волны флуоресценции... (см. раздел Флуоресценция: свечение, индуцированное светом ). На самом деле основные законы физики при работе этих микроскопов не нарушаются. Просто при достаточной интенсивности светового потока с длиной волны больше длины волны возможной флуоресценции в один и тот же атом одновременно могут «попасть» два фотона, поглощенная электронами энергия удваивается, и ее оказывается достаточно для возбуждения флуоресценции. Поэтому такие микроскопы называются двухфотонными . Одновременное «попадание» двух фотонов в один атом - явление сравнительно маловероятное, и может происходить только там, где световой поток максимально сконцентрирован, т.е. в фокусе объектива. Это и обеспечивает высокое разрешение флуоресцентных изображений. К достоинствам, отличающим двухфотонные от других микроскопов, относится также их способность регистрировать флуоресценцию в образцах на глубине до 1,5 мм (есть сообщения о проникновении и на большую глубину), а также возможность существенно уменьшить неблагоприятное действие возбуждающего излучения как на исследуемые объекты, так и на флуоресцентные репортеры.

Специальные аналитические приемы (так называемая флуоресцентная корреляционная спектроскопия) позволяют использовать конфокальную и двухфотонную микроскопию для исследования движения единичных (!) флуоресцирующих молекул.

Однако «на вершине» современной оптической микроскопии по разрешающей способности стоят так называемые «наноскопы», то есть микроскопы, позволяющие различать на изображении флуоресцирующие объекты, расстояние между которыми составляет несколько нанометров. Существует два типа таких устройств. Первый основан на сканировании образца двумя узкими пучками лазерного излучения. Оптические свойства их подобраны так, что один возбуждает флуоресценцию в «нужной» области, а другой подавляет ее в рядом лежащей «ненужной» области. Размер же «нужной» области может быть порядка нескольких нанометров. Этот метод получил название STED-микроскопия .

Принцип работы второго типа наноскопов опирается на возможность оптического «включения и выключения» флуоресценции отдельных флуорофоров. Получают изображение одного и того же образца несколько раз, включая то одни, то другие молекулы. Затем компьютер «накладывает» изображения друг на друга, и на суммарном изображении можно увидеть свечение каждой из близлежащих молекул. В «обычном», пусть даже и конфокальном, микроскопе они слились бы одно светящееся пятно. Такой подход назвали PALM-микроскопией .

Флуоресцентные «репортажи», зарегистрированные в виде цифровых изображений, «расшифровывают», то есть извлекают количественную информацию с помощью специальных компьютерных программ анализа изображений. Так можно измерять интенсивность флуоресценции и ее пространственное распределение, оценивать спектральные характеристики излучения (псевдоспектральный анализ), определять количество флуоресцирующих частиц (например, клеток), характеризовать временные и поляризационные параметры флуоресценции.

Следует отметить также и эстетическую информативность флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные репортеры на микрофотографиях открывают нам чарующий мир причудливого сочетания цвета и форм (см. рис. 8). Фирмы-производители микроскопов Nikon и Olympus даже проводят ежегодные конкурсы фоторабот о микромире в свете флуоресценции. С галереями работ-победителей в этих конкурсах можно познакомиться на сайтах Olympus BioScapes и Nikon Small World .

Рисунок 8. Флуоресцентные микрофотографии с галереи ежегодного конкурса Nikon Small World. 1. Фибробласты мыши. 2. Веслоногий рачок Temora longicornis . 3. Митоз в клетках легких тритона. 4. Клетки глии мозжечка мыши in vivo (двухфотонная флуоресцентная микроскопия).

В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Как правило, это суспензии клеток, в которых находятся флуорофоры. Сильная сторона проточных цитометров - скорость регистрации сигналов от единичных объектов. Обычный коммерчески доступный цитометр позволяет измерять флуоресцентные сигналы от клеток со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные - до 25000 клеток в секунду! Стандартный вариант работы предусматривает измерение у каждого объекта от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Измерения на большом массиве объектов позволяют получать статистически достоверные результаты при исследовании гетерогенности клеточных, в частности, микробных популяций.

Наряду с обычными проточными цитометрами существуют приборы, которые способны физически разделять (сортировать) клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции. Это открывает возможность дальнейшего изучения определенных субпопуляций с использованием других методов.

О чем «сообщают» флуоресцентные репортеры

Как уже отмечалось (см. раздел Флуоресцентные репортеры ), все флуоресцентные репортеры имеют «специализацию», т.е. способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».

С помощью ряда флуоресцентных репортеров можно следить за ферментативным катализом . Как правило, это органические флуорофоры. Так, например, создают субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции. Это и служит «сообщением» о ходе ферментативного катализа. Другой прием - использование «профлуорофора», который становится флуоресцентным в результате взаимодействия с продуктом реакции. С помощью флуоресцентных репортеров ферментативных реакций исследуют динамику процессов, а также их локализацию в клетках, тканях, органах и т.п.

Репортеры, сформированные на основе антител, «информируют» о протекании иммунологических реакций . Они представляют собой физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами (иммуноглобулинами). В качестве флуоресцирующего компонента показана возможность использования всех известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. С помощью иммунологических флуоресцентных репортеров выявляют наличие в образцах определенных белков-антигенов, а также их локализацию. Так, например, показанные на рисунке 8 (фото 1) микрофибриллы в фибробластах мышей выявлены с помощью флуоресцентных антител.

Много видов информации можно получать с использованием ФБ. Разработаны методы создания генов гибридных белков, содержащих ФБ в качестве флуоресцирующей метки какого-нибудь естественного белка или даже нуклеиновой кислоты. Введение в клетки генов таких «гибридов» позволяет по флуоресценции определять «адреса» локализации молекулярных компонентов живых клеток , следить за динамикой их синтеза и перемещений. Существует рН-зависимость флуоресценции ФБ-содержащих гибридных белков, что используется для измерения внутриклеточного рН . Преимуществом таких рН-репортеров по сравнению с другими рН-чувствительными органическими флуорофорами является возможность измерений рН внутри различных внутриклеточных отделов (органелл), куда «адресован» основной компонент «гибрида».

Особый интерес вызывает применение различных ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на БПЭ. Для изучения взаимодействия или совместной локализации в клетках каких-нибудь двух белков к ним присоединяют два ФБ, подобранных так, чтобы при их сближении был возможен эффект БПЭ. Похожим образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках. С этой целью соответствующие ФБ присоединяют к разным участкам белковой молекулы. Появление эффекта БПЭ свидетельствует о сближении ФБ и тем самым о конформационных перестройках в исследуемом белке. На этом же принципе работает «конструкция» из трех белков, которая используется как индикатор содержания ионов Са 2+ в живых клетках . В нее входят два ФБ и Са 2+ -связывающий белок кальмодулин между ними. При связывании Са 2+ конформация кальмодулина изменяется, ФБ сближаются и дают сигнал БПЭ. Здесь уместно заметить, что для регистрации ионов Са 2+ внутри клеток существуют и «простые» органические флуоресцентные репортеры. Белковые же репортеры могут быть более точно «адресованы» в определенные внутриклеточные компоненты либо с помощью микроинъекций, либо путем включения в структуру белка с определенной внутриклеточной локализацией.

Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения, в котором находится молекулы флуорофоров, позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. Измерение внутриклеточной вязкости основано на зависимости поляризации флуоресценции от вращательной диффузии репортеров. Благодаря специально отобранным репортерам удалось измерить вязкость цитоплазмы внутри некоторых органелл, а также в гидрофобном слое биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на них. С помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала . Для измерения внутриклеточной температуры разработано несколько вариантов флуоресцентных репортеров на основе лантанидов, квантовых точек, термочувствительных полимеров и органических флуорофоров. Наиболее впечатляющие результаты получены от специально сконструированных органических флуорофоров, которые способны «сообщать» температуру в различных частях клеток, «зашифрованную» в динамических параметрах затухания флуоресценции.

Что нового о микромире мы узнали благодаря флуоресцентным репортерам?

Флуоресцентные репортеры долго и успешно «служат» экспериментальной биологии и медицине. Только перечисление различных вариантов их применения могло бы составить объем не одной статьи. Однако есть такие области, где они сыграли ключевую роль в изучении принципиальных свойств и явлений биологических систем. Отметим некоторые из них для иллюстрации.

С использованием флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран* . Согласно этой модели, при структурной целостности и обеспечении барьера проницаемости для гидрофильных веществ биологическая мембрана достаточно «жидкая», чтобы в ней могли перемещаться «по назначению» ее отдельные компоненты. Такое представление о биологических мембранах позволяет понять основные молекулярные механизмы их функционирования, а также свойства живых клеток в целом.

* - В том числе благодаря флуоресцентным техникам было установлено, что мембрана является не просто пассивным «морем» фосфолипидов, в котором плавают «острова» мембранных белков, а полноправным участником множества важнейших биофизических процессов: « » . - Ред.

Механизмы трансформации энергии в клетках также стали понятны в значительной мере благодаря информации от флуоресцентных репортеров. Особую роль здесь сыграли флуорофоры, позволяющие регистрировать внутриклеточный и внутримитохондиральный рН*, а также разность электрический потенциалов на мембранах. С их помощью прежде всего был выявлен механизм сопряжения энергодонорных реакций окисления с энергозатратным синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) - универсального донора энергии для большинства метаболических процессов. Кроме того, была изучена природа накопления различных веществ в цитополазме и в клеточных органеллах за счет мембранного электрического потенциала и градиента рН.

* - об устройстве флуоресцентного pH-сенсора см. статью « » . - Ред.

Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций. Эта координация осуществляется за счет специфического взаимодействия компонентов так называемых сигнальных систем. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только с появлением подходов, основанных на применении флуоресцентных репортеров, стало возможным получать сведения о пространственно-временной организации сигнальных путей непосредственно в клетках. Так, в частности, можно в реальном времени следить за пространственной динамикой взаимодействия белков-компонентов сигнальных систем. Это позволяет изучать распространение, усиление и интеграцию сигналов в клетках. Более того, стало возможным на уровне единичных клеток оценивать динамику экспрессии генов, что позволяет подойти к развитию концепций клеточной индивидуальности в противовес традиционным статистическим подходам. Следует отметить также и то, что с помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить неизвестные ранее сигнальные компоненты. Например, была выявлена принципиальная роль ионов Са 2+ как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.

Во второй половине прошлого века в микробиологии возникла проблема, которую окрестили «великой аномалией учета микроорганизмов с помощью чашек Петри». «Виновниками» оказались флуоресцентные репортеры, два красителя нуклеиновых кислот - акридиновый оранжевый и 4,6-диамидино-2-фенилиндол. В многочисленных исследованиях природных образцов постоянно обнаруживалось несоответствие между данными о содержании микроорганизмов, полученными путем учета по колониям размножающихся клеток на чашках Петри, и данными прямого подсчета микроорганизмов, прокрашенных флуоресцентными красителями нуклеиновых кислот, с помощью микроскопии. Флуоресцентные репортеры всегда выявляли значительно больше микроорганизмов, чем анализ с чашками Петри. Для объяснения этих данных были выдвинуты две гипотезы. Согласно первой, часть клеток может находиться в некотором состоянии «покоя» и не размножается на чашках Петри. Согласно второй, условия культивирования (состав среды, температура и др.) не соответствуют «потребностям» некоторой части популяции для размножения. Проверка этих гипотез показала, что обе эти возможности могут реализовываться. Более того, был дан толчок к формированию двух новых больших направления исследований.

Первое связано с изучением так называемого «жизнеспособного, но некультивируемого состояния микроорганизмов». Особая значимость этого направления обусловлена наличием такого состояния у многих патогенных для человека микроорганизмов. В этом состоянии они как бы «невидимы» для стандартных методов диагностики. Кроме того, в этом состоянии у них увеличивается устойчивость к лекарственным препаратам.

Второе направление - это выявление и изучение микроорганизмов непосредственно в природных образцах (лат. in situ , буквально - на месте ) путем прямого анализа их нуклеиновых кислот без предварительного получения чистых культур, как это делалось раньше. Это направление даже получило собственное название - метагеномика . Благодаря методам метагеномики, среди которых, кстати, некоторые основаны на использовании флуоресцентных репортеров, появилась возможность по-новому оценить биологическое разнообразие микроорганизмов в отдельных экосистемах и на Земле в целом. Вот так «незатейливые» репортажи двух флуоресцентных репортеров способствовали появлению двух важнейших направлений исследований в современной микробиологии.

Итак, флуоресцентные репортеры сегодня представляют собой большую армию разнообразных «специалистов», которые уже имеют славную историю в экспериментальной биологии и медицине. Их флуоресцентные репортажи позволили лучше «разглядеть» те уголки микромира, куда может проникнуть свет. Причем разглядеть не только визуально, но и с точки зрения понимания физико-химических и биологических закономерностей. И все же исследователи, работающие в области разработки и применения этих «молекулярных помощников» изучения микромира, считают, что это только начало!

Видеозапись 5-го семинара Совета молодых ученых Института биоорганической химии РАН: «Технология акустической фокусировки частиц в проточной цитометрии »;

Липидный фундамент жизни ;

Нано-pH-метр ;

По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014 ;

Пучков Е.О. (2014). Флуоресцентные репортеры и их репортажи . Химия и Жизнь № 9 (2014) , 8–13. .

Люминесценция – свечение атомов, ионов, молекул, возникающее в результате электронного перехода в этих частицах при их возвращении из возбужденного состояния в нормальное. Таким образом молекула преобразует поглощенную энергию в собственное излучение (В. Л. Левшин) Люминесценцию называют холодным свечением Люминесцирующие вещества могут находиться в любом агрегатном состоянии 2

Классификация видов люминесценции 1. По длительности свечения 2. По способу возбуждения 3. По механизму свечения: свечение дискретных центров – поглощающими и излучающими центрами являются одни и те же частицы (атомы, молекулы, ионы) рекомбинационное свечение – процессы поглощения и излучения разделены во времени и в пространстве; в процессе возбуждения происходит разделение частицы вещества на две противоположно заряженные части; последующая их рекомбинация сопровождается выделением энергии А + hv A + + e A + + e A * A * A + hv 3

Классификация люминесценции по длительности свечения флуоресценция (~10 -8 c) При флуоресценции молекула переходит в основное состояние из короткоживущего возбужденного состояния Она наблюдается сразу же после поглощения света, быстро спадает и исчезает в результате столкновений излучающей молекулы с другими молекулами в растворе (тушение флуоресценции) фосфоресценция (>10 -6 с) Фосфоресценция наблюдается при переходе молекулы в основное состояние из относительно долгоживущего возбужденного состояния, так что между поглощением и испусканием света может пройти относительно много времени Для фосфоресценции характерны большая длина волны излучения, меньшая интенсивность и большее влияние матрицы 4 10 -6 с) Фосфоресценция наблюдается при переходе молекулы в основное состояние из относительно долгоживущего возбужденного состояния, так что между поглощением и испусканием света может пройти относительно много времени Для фосфоресценции характерны большая длина волны излучения, меньшая интенсивность и большее влияние матрицы 4">

Классификация люминесценции по способам возбуждения Электромагнитное излучение УФ- и видимого диапазона Фотолюминесценция Поток электронов (катодные лучи) Катодолюминесценция Поток ионов щелочных металлов Ионолюминесценция Рентгеновское излучениеРентгенолюминесценция Радиоактивное излучениеРадиолюминесценция Тепловая энергияТермолюминесценция УльтразвукСонолюминесценция Механическое воздействиеТриболюминесценция Энергия химической реакцииХемилюминесценция 5

В аналитической практике чаще используют фото - и хемилюминесценцию Флуоресцентные измерения более избирательны, чем спектрофотометрические, поскольку зависят от двух длин волн: поглощаемого и испускаемого света По сравнению с молекулярной абсорбционной спектроскопией метод обладает большей чувствительностью Это обусловлено тем, что метод относится к силовым, в котором выходной сигнал увеличивается с увеличением интенсивности излучения Пределы обнаружения для большинства соединений составляют ~ мкг / мл, что на 1-2 порядка ниже, чем в абсорбционной спектроскопии 6

Кроме того, в ряде случаев наблюдается большой диапазон определяемых содержаний – иногда до 4- х порядков величин концентраций – при той же воспроизводимости результатов анализа, что и в молекулярной абсорбционной спектроскопии Все это предопределило развитие люминесцентного метода анализа 7

Молекулярная люминесцентная спектроскопия (флуориметрия) Фотопроцессы в молекулах Электронное возбуждение молекулы связано с переходом электрона из основного состояния в возбужденное с большей энергией Возбужденные молекулы переходят в основное состояние, часто испуская свет Конкурирующие физические процессы могут приводить к образованию нового возбужденного состояния, при этом общая потеря электронной энергии несколько задерживается В конечном счете все же происходит быстрый переход всех возбужденных состояний в основное состояние системы Происхождение люминесцентного излучения поясняется диаграммой Яблонского 8

Рассмотрим процесс возбуждения валентных электронов молекулы На каждый электронный уровень или энергетическое состояние (жирные линии на схеме) накладываются колебательные подуровни с квантовыми числами 0,1,2,3 и т. д. (тонкие линии) При поглощении кванта света электрон переходит с основного уровня на более высокий. Различают синглетное возбужденное состояние (все спины электронов антипараллельны, неспаренные электроны отсутствуют) и триплетное (параллельные спины) Основное состояние не может быть триплетным (по принципу Паули два электрона не могут иметь полный набор одинаковых квантовых чисел) 10

Механизмы возвращения молекулы из возбужденного состояния в основное Избыточная энергия возбужденных молекул может быть потеряна за счет ряда процессов Все эти процессы конкурируют друг с другом и вклад каждого из них в общую потерю энергии зависит от соотношения их скоростей Вернемся к диаграмме Яблонского 11

При комнатной температуре молекулы обычно находятся в основном состоянии S 0, и почти все переходы при поглощении света происходят с нижнего (основного) колебательного подуровня на колебательные подуровни возбужденного синглетного состояния S 1 или S 2 Время жизни электрона в возбужденном синглетном состоянии составляет с Безызлучательные переходы Возбужденная молекула за счет так называемой колебательной релаксации при столкновении с окружающими молекулами очень быстро, за время меньше с, теряет избыточную колебательную энергию и переходит на основной колебательный уровень возбужденного синглетного состояния (переход обозначен волнистыми стрелками) 13

Таким же быстрым является процесс внутренней конверсии в высших электронно - возбужденных состояниях Это безызлучательный переход между колебательными уровнями различных электронных состояний, имеющих одинаковую энергию (горизонтальная волнистая линия) Внутренняя конверсия в нижних электронных состояниях S 1 S 0 процесс более медленный, он может конкурировать с излучательным переходом S 1 S 0 Флуоресценция - процесс излучательного перехода с низшего возбужденного синглетного состояния в основное (S 1 S 0) Время затухания флуоресценции с Флуоресценция протекает в одну стадию 14

Энергия испускаемого фотона ниже, чем энергия поглощенного фотона, поэтому спектр флуоресценции молекулы находится в области более длинных волн по сравнению со спектром поглощения - закон Стокса - Ломмеля h люм

18

Напомним, что кроме синглетного возможно триплетное возбужденное состояние (параллельные спины электронов) Прямой переход из основного состояния в возбужденное триплетное в результате поглощения фотона практически невозможен Молекула может оказаться в триплетном состоянии только в результате переходов с возбужденных синглетных состояний – интеркомбинационная конверсия – S 1Т 1 (безызлучательный переход, обозначен волнистой стрелкой) Время жизни электрона в возбужденном триплетном состоянии – не менее с В триплетном состоянии так же, как и в синглетном происходит колебательная релаксация, и электрон переходит на нижний колебательный уровень Т 1 20

Безызлучательная дезактивация Т 1 S 0 конкурирует с излучательным Т 1 S 0 переходом Фосфоресценция – излучательный переход между состояниями различной мультиплетности Хотя такие переходы теоретически запрещены, они имеют место, хотя и менее вероятны, чем S S и ТТ переходы Это происходит вследствие спин - орбитального взаимодействия, связанного с движением ядер, поэтому с увеличением массы ядра спин - орбитальное взаимодействие резко возрастает (~Z 4) Т. о., эффективность фосфоресценции возрастает при введении в молекулу люминофора (или растворителя) атомов с большими атомными номерами, например, йода или брома – эффект тяжелого атома 21

Излучательное время фосфоресценции с, поэтому триплетные молекулы могут легко терять свою энергию в различных безызлучательных процессах В растворах это происходит при столкновении с молекулами кислорода, имеющими неспаренные электроны Для наблюдения фосфоресценции из растворов удаляют кислород, более эффективно замораживание растворов, либо закрепление люминофоров на поверхности сорбентов 22

24

С участием Т 1 - состояния может осуществляться еще один излучательный процесс – замедленная флуоресценция, который происходит в результате термической активации молекул Т 1 S 1 и последующим излучением из него Условия проявления замедленной флуоресценции довольно специфичны. Этот тип молекулярной люминесценции наблюдается в весьма ограниченных диапазонах температур, вязкостей и концентраций растворов По сравнению с флуоресценцией и фосфоресценцией ее интенсивность невелика (несколько процентов от интенсивности флуоресценции) и достигает максимальных значений при комнатной и более высоких температурах, заметно ослабевая с понижением температуры Спектр замедленной флуоресценции совпадает со спектром быстрой флуоресценции, однако время жизни замедленной флуоресценции равно времени жизни фосфоресценции 25

Характеристики люминесцирующих молекул Спектр возбуждения люминесценции - зависимости интенсивности люминесценции I от частоты (волнового числа) или длины волны возбуждающего света Спектр люминесценции - зависимость интенсивности люминесценции от ее длины волны I = f(λ); I = f(v) Время жизни люминесценции – время, за которое интенсивность излучения уменьшится в е раз, поскольку затухание люминесценции происходит по закону: I t = I 0 e -t/ τ 27

Для возбуждения люминесценции используется УФ - излучение. Источники излучения – газоразрядные лампы, чаще всего ртутно - кварцевые и ксеноновые Измерение люминесцентного излучения чаще всего проводят под прямым углом к падающему лучу света, поэтому кюветы должны быть прозрачны во всех направлениях Высококачественный прибор имеет 2 монохроматора – для регистрации спектра возбуждения и флуоресценции Приемником излучения может служить глаз человека. В современных приборах используются фотоумножители Для регистрации фосфоресценции необходимо устройство для охлаждения пробы и механический или электронный прерыватель, позволяющий облучать пробу короткими импульсами и тем самым отделять длительную фосфоресценцию от кратковременной флуоресценции 31

C пектрофлуориметр фирмы Horiba Fluoromax

В основе количественного анализа лежит зависимость интенсивности люминесценции от концентрации люминесцирующего вещества где К – коэффициент пропорциональности В кв – квантовый выход люминесценции I 0 – интенсивность возбуждающего света ε - молярный коэффициент поглощения l – толщина слоя раствора Это соотношение справедливо, если постоянны: квантовый выход интенсивность возбуждающего света 34

10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции " title="Зависимость линейна в пределах 3-4 порядков величин концентрации (10 -7 -10 -4 М) При концентрациях >10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции " class="link_thumb"> 35 Зависимость линейна в пределах 3-4 порядков величин концентрации (М) При концентрациях >10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества 35 10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции "> 10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества 35"> 10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции " title="Зависимость линейна в пределах 3-4 порядков величин концентрации (10 -7 -10 -4 М) При концентрациях >10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции "> title="Зависимость линейна в пределах 3-4 порядков величин концентрации (10 -7 -10 -4 М) При концентрациях >10 -4 М линейность графика нарушается из - за концентрационного тушения люминесценции, самопоглощения и др. Зависимость интенсивности флуоресценции ">

Тушение люминесценции происходит при столкновении возбужденной молекулы с другими, особенно парамагнитными (растворенный кислород), которые стимулируют процессы интеркомбинационной конверсии Повышение температуры уменьшает выход люминесценции. Это связано с тем, что возрастает частота соударений, при которых происходит безызлучательная дезактивация возбужденных молекул. Поэтому определения проводятся, как правило, при комнатной температуре Присутствие посторонних веществ также понижает выход люминесценции. Наиболее активные тушители люминесценции - катионы и анионы « тяжелых » элементов (I -, Br -, Cs + и др.), парамагнитные ионы и молекулы (Mn 2+, O 2 и др.), молекулы растворителя Самопоглощение – состоит в поглощении части испускаемого света слоем люминесцирующего вещества 36

Применение метода 37 Число флуоресцирующих веществ ограничено. Метод применим для определения веществ, обладающих собственной люминесценцией (соединения U(VI), особенно уранил - иона UO 2 +, РЗЭ и др.) ионов металлов в виде комплексов с органическими реагентами: 8- оксихинолин и его производные (более 25 элементов, в т. ч. Li, Ca, Mg, Ba, Sc, Al, In, Ga) оксиазо - и оксиазометиновые соединения (Al, Ga, Mg и др.) полиоксифлавоны (Zr, Hf, Sn, Th, Al,Be) родаминовые красители (Au, In, Ga, Hg, B, Te и др.) органических веществ - конденсированных полиароматических систем (антрацен, флуорен, флуоресцеин)

38 кристаллофосфоров или твёрдых растворов. Обычно их получают спеканием основного вещества (ZnS, CdS, CaS, SrS и др.) с активатором (соединения Ag, Cu, Mn, Ce и др.) и плавнем (NaCl, NaNO 3, K С l, CaF 2 и др.). В некоторых случаях кристаллофосфор удается получить сокристаллизацией активатора и основного вещества из насыщенного раствора последнего. Спектр люминесценции кристаллофосфора определяется типом активатора Кристаллофосфоры обозначают химическими символами основного вещества, образующего кристаллическую структуру активатора и плавня. Например, запись ZnS × Ag × NaCl означает, что данный кристаллофосфор представляет собой сульфид цинка, активированный атомами серебра, и при синтезе его использован плавень хлорид натрия

Например, уран в количестве 10 –5 мкг можно определить с применением кристаллофосфора на основе NaF, сурьму в количестве 10 –6 мкг – на основе CaO, редкоземельные элементы в количестве 10 –6 мкг – на основе ThO 2 Чувствительность определения сопоставима, а иногда и превосходит атомно - спектроскопические методы: селективность не очень высока 39

Определение органических соединений основано на а) прямых методах по флуо - и фосфоресценции б) эффекте Шпольского в) фосфоресценции при комнатной температуре Эффект Шпольского – возникновение квазилинейчатых спектров люминесценции и поглощения в специально подобранных растворителях, размеры молекул которых совпадают с размерами молекул люминофора при низких температурах При этом молекулы изолированы друг от друга и жестко закреплены в растворителе, вследствие чего спектры представляют собой серию узких спектральных линий и обладают ярко выраженной индивидуальностью 42

Фосфоресценция органических молекул обусловлена дезактивацией возбужденных триплетных состояний. Время жизни триплетных состояний столь велико (до 100 с), что для наблюдения фосфоресценции необходимо зафиксировать молекулу в триплетном состоянии в жесткую матрицу, т. е. иммобилизовать. Иммобилизация уменьшает вероятность безызлучательной дезактивации триплетных молекул посредством соударений и внутренней конверсии Для получения спектров фосфоресценции применяют органические растворители, кристаллизующиеся при низких температурах чаще всего используют смеси: этиловый спирт – диметилформамид; этиловый спирт – изопентан – диэтиловый эфир, которые кристаллизуются в стеклообразную массу при температуре кипения жидкого азота 77 К 44

45 Для измерения фосфоресценции при комнатной температуре люминофор закрепляют на сорбенте, обработанном солями Ag, Tl, Hg, бромидами, иодидами и др. (эффект тяжелого атома) Сорбенты – фильтровальная бумага, оксиды кремния, алюминия интенсивность фосфоресценции выше, поэтому круг определяемых веществ расширяется Кроме того, повышается селективность, т. к. эффект тяжелого атома весьма специфичен

Качественный анализ 46 Спектр люминесценции есть индивидуальная характеристика люминесцирующего вещества. Спектры могут быть использованы для качественного люминесцентного анализа. Обычно такой анализ проводится визуально по цвету излучения. Качественный люминесцентный анализ применяют для исследования минералов, определения марок стёкол, сортов смазочных масел и т. п. Очень чувствительны качественные люминесцентные реакции, используемые для обнаружения ионов Возникновение или исчезновение люминесценции обычно наблюдается визуально при добавлении органических реагентов к растворам неорганических солей Так, ярко - зеленая люминесценция лития с 8- оксихинолином возникает в присутствии 0,1 мкг / мл Li, медь открывают по ярко синей люминесценции ее соединения с салицилалазином при концентрации 0,05 мкг / мл и т. д.

Хемилюминесцентный анализ 47 Хемилюминесцентное излучение наблюдается тогда, когда в ходе химической реакции образуется возбужденная молекула, способная люминесцировать при переходе в основное состояние Возбужденная частица, образующаяся в ходе реакции, может испустить квант света сама (прямая хемилюминесценция) или передать энергию постороннему люминофору, который перейдет в возбужденное состояние и затем испустит квант света (косвенная или сенсибилизированная хемилюминесценция) Для возбуждения хемилюминесценции в видимой области спектра требуется энергия 160 кДж / моль. Это характерно для радикальных, цепных и окислительно - восстановительных реакций, протекающих по свободно - радикальному механизму

48 На практике чаще всего используют реакции окисления ряда органических веществ, таких, как люминол (V), лофин (VI), люцигенин (VII) и др. Неорганический хемилюминесцентный анализ основан на способности элементов с незаполненной d- оболочкой тушить флуоресценцию, катализировать, реже ингибировать хемилюминесцентную реакцию Изменение интенсивности при этом пропорционально концентрации элементов Для выполнения анализа требуется лишь измерить интенсивность возникающего люминесцентного излучения с помощью фотоумножителя Поскольку единственным источником излучения является химическая реакция, разложения света в спектр не требуется, т. е. не требуются ни монохроматор, ни источник излучения

49 Метод хемилюминесценции используется для определения неорганических и органических веществ с пределом обнаружения до 10 –8 %. Разработаны методики определения платиновых металлов, Fe, Co, Ni, Cu, Cr и др. с ПО до мкг / мл, но эти методики не обладают высокой селективностью Более селективны методики газового анализа: определение озона, оксидов азота и аммиака после их перевода в NO. Реакции NO + O 2 NO 2 * + O 2 NO 2 * NO 2 + hv сопровождаются люминесценцией с максимумом при 800 нм Чувствительность определения озона с красителем родамином В составляет до % (1 ppb)

Атомно - флуоресцентная спектроскопия 50 Атомно - флуоресцентный анализ метод элементного анализа по спектрам атомной флуоресценции Анализируемый образец атомизируют, образовавшийся атомный пар для возбуждения флуоресценции облучают потоком света. Испускаемую возбужденными атомами флуоресценцию (как правило, резонансную) регистрируют Если поток света содержит кванты с энергией, соответствующей возбуждению первого уровня, облучаемый атом перейдет в возбужденное состояние, а затем при возвращении будет испускать свет с длиной волны, соответствующей резонансному переходу. Этот процесс также называют резонансной флуоресценцией

51 Схема возбуждения флуоресценции: а и б резонансная флуоресценция с различных уровней; в резонансная и стоксовая флуоресценция; г резонансная и антистоксовая флуоресценция; д каскадная флуоресценция; е ступенчатое возбуждение флуоресценции двумя квантами (ν 12 + ν 23)

52 В зависимости от количества фотонов, приходящихся на один акт возбуждения, механизм возбуждения может быть однофотонным или ступенчатым многофотонным Основные процессы, вызывающие появление спектров атомной флуоресценции, приведены на схеме, которая объясняют появление в спектре наряду с линиями резонансной флуоресценции (а, б) линий нерезонансной флуоресценции (в – е) Нерезонансную флуоресценцию называют стоксовой, если испускаемый фотон меньше поглощенного, и антистоксовой, когда испускаемый фотон больше поглощенного Если переход из возбужденного состояния в основное осуществляется путем последовательных переходов, каждый из которых сопровождается испусканием фотонов, то такой тип флуоресценции называют каскадной флуоресценцией (д) В реальных атомах число электронных энергетических уровней больше трех. Для заселения любого из них существует ряд возможностей с участием ступенчатых и каскадных переходов при столкновительных и излучательных процессах Спектры атомной флуоресценции содержат гораздо меньше линий, чем спектры испускания тех же атомов в газоразрядных источниках возбуждения (лампы с полым катодом, высокочастотные безэлектродные лампы). Как правило, число линий в спектрах атомной флуоресценции не превышает десятка.

53 Для атомизации жидких образцов (растворов) можно использовать любой способ атомизации пламя, аргоновую высокочастотную индуктивно - связанную плазму или электротермические атомизаторы (нагреваемые электрическим током графитовые трубки, нити, стержни, тигли) Атомизацию порошкообразных проб осуществляют электротермическими способом в графитовых тиглях или капсулах, которые иногда вносят в пламя для дополнительного нагрева паров пробы Химический состав пламен выбирают так, чтобы выход флуоресценции (т. е. доля поглощенной энергии, излучаемой в виде флуоресценции) и степень атомизации были максимальны Для предотвращения тушения флуоресценции в пламя добавляют некоторое количество аргона, а электротермический атомизатор обычно помещают в атмосферу аргона с целью увеличения выхода

55 Возбуждение атома происходит под действием внешнего источника излучения Доля возбужденных атомов определяется не температурой атомизатора, как в АЭС, а интенсивностью этого источника Для свободных атомов величины квантовых выходов, как правило, крайне невелики ввиду высокой температуры среды, поэтому в АФС используют мощные источники излучения Для возбуждения флуоресценции используют интенсивные лампы с линейчатым или непрерывным спектром (лампы с полым катодом или безэлектродные), а также лазеры с перестраиваемой длиной волны В последнее время метод АФС развивается исключительно в лазерном варианте – ЛАФС Использование лазеров позволило резко увеличить чувствительность метода

56 Лазеры или оптические квантовые генераторы – это современные источники когерентного излучения Физической основой работы лазера служит явление вынужденного индуцированного излучения Суть явления состоит в том, что возбуждённый атом способен излучить фотон под действием другого фотона без его поглощения, если энергия последнего равняется разности энергий уровней атома до и после излучения При этом излучённый фотон когерентен фотону, вызвавшему излучение (является его « точной копией ») ; чрезвычайно высокая степень его монохроматичности недостижима в излучении нелазерных источников В результате согласованного, кооперативного испускания световых квантов многими атомами рабочего вещества происходит усиление света Этим явление отличается от спонтанного излучения, в котором излучаемые фотоны имеют случайные направления распространения, поляризацию и фазу Мощность излучения лазеров может изменяться в пределах от долей милливатта до –10 13 Вт (в импульсном режиме)

Гелий - неоновый лазер 58 В высоковольтном электрическом разряде вследствие соударений с электронами значительная часть атомов гелия переходит в возбужденное состояние Возбужденные атомы гелия неупруго сталкиваются с атомами неона, находящимися в основном состоянии, и передают им свою энергию При достаточно высоком уровне накачки в смеси гелия и неона начинается лавинообразный процесс размножения идентичных когерентных фотонов. Если кювета со смесью газов помещена между высокоотражающими зеркалами, то возникает лазерная генерация Светящийся луч в центре это не собственно лазерный луч, а электрический разряд, порождающий свечение, подобно тому, как это происходит в неоновых лампах Луч проецируется на экран справа в виде светящейся красной точки

59 Аналитическим сигналом служит излучение в УФ - части спектра, испускаемого возбужденными атомами Интенсивность атомной резонансной флуоресценции в первом приближении пропорциональна концентрации излучающих частиц: I 0 – интенсивность возбуждающего света В кв – квантовый выход флуорес ценции k – коэффициент поглощения l – толщина слоя раствора

60 Основной помехой при атомно - флуоресцентных определениях элементов является рассеянное излучение, которое возникает вследствие рассеяния излучения от источника возбуждения на атомах и молекулах анализируемого образца Рассеянное излучение часто маскирует слабые сигналы резонансной флуоресценции При больших интенсивностях рассеянного света выделение из шума сигнала резонансной флуоресценции затруднено, поскольку длина волны аналитической линии совпадает с длиной волны рассеянного света Во избежание помех, связанных с рассеянным излучением, для измерения используют линии нерезонансной флуоресценции В этом случае эффект возбуждения достигается лишь с помощью лазеров

61 Для регистрации спектра флуоресценции применяют светосильные спектрофотометры с большим углом Измеряют интенсивность излучения, распространяющегося под прямым углом к возбуждающему излучению (в этом направлении интенсивность рассеянного света обычно минимальна)

66

69 Линейчатый характер спектров атомной флуоресценции обеспечивает атомно - флуоресцентному анализу высокую селективность Линии в спектре атомной флуоресценции очень узкие, и это дает возможность определять одновременно несколько элементов. Для этого вокруг атомизатора устанавливают соответствующее число светосильных спектрофотометров Метод АФС легко автоматизируется, стоимость аппаратуры относительно невысока Метод применяется для анализа пород (земных и лунных), почв, природных и сточных вод, сталей, сплавов, нефтей, пищевых продуктов, биологических объектов (крови, мочи), различных химических соединений, для дистанционного определения элементов в верхних слоях атмосферы

Сравнение пределов обнаружения элементов (нг / мл) методами атомной спектроскопии ЭлементААС (пламя) ААС (э/т)АЭС (пламя) АЭС (ППТ) АЭС (ИСП) АФС Al Ba Be B V Bi W Gd Ga Ge Fe Au In Cd K ,5 1 0,01 0,04 0,1 8 0,01 0,1 0,01 0,02 0,0002 0,01 2 0,5 0,3 0,2 0,01 0,003 0,1 0,8 0,4 0,6 0,5 0,09 0,9 0,4 0,2 0,001 0,8 70

Сравнение пределов обнаружения элементов (нг / мл) методами атомной спектроскопии ЭлементААС (пламя) ААС (э/т)АЭС (пламя) АЭС (ППТ) АЭС (ИСП) АФС Mg Mn Cu Mo As Na Ni Sn Hg Pb Se Ag Sb U Zn 0,1 0,02 0,02 0,9 0,1 0,8 0,0002 0,0005 0,005 0,02 0,08 0,004 0,05 0,03 0,2 0,007 0,05 0,001 0,2 0,5 2 0,5 45 0,003 0,01 0,04 0,2 2 0,1 0,2 10 1,5 0,1 0,4 0,06 0,1 0,

ГЛАВА 1.

Введение в флуоресценцию

Люминесценция - испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний - делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояний , В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Гово­рят, что эти электроны спарены *. В триплетном состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние. Флуоресценция - это испускание, происходящее при возвращении спаренно­го электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически "разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них ~10 8 с -1 . Высокие значения скоростей испускания приводят к временам за­тухания флуоресценции~10 -8 с (10 нс). Время жизни - это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Фосфоресценция - это испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности **, как правило, из возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разреше­ны, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции - от миллисекунд до секунд, что главным обра­зом зависит от вклада других процессов дезактивации. В данной книге повсюду мы в первую очередь будем рассматривать более быстрый процесс флуоресценции.

В веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны в основном делокализованы и формально расположены на сопряженных двойных связях.

*Правильнее было бы сказать, что спины этих электронов спарены. Спаренны­ми обычно называют электроны, находящиеся на одной и той же орбитали, - Прим. Ред.

** Мультиплетностью состояния называют величину т= 2s + 1, где s - суммар­ный электронный спин данного состояния. Так, для синглетных состояний т= 1 и s = 0, для триплетных - т= 3 и s = 1 - Прим.ред.

Структуры некоторых типичных флуорофоров представлены на рис. 1.1. Одним из широко распространенных флуорофоров является хинин, который добавляют в тонизирующие напитки. Если посмотреть на стакан тоника, выставленного на солнечный свет , часто можно увидеть слабое го­лубое свечение. Оно наиболее заметно, если на стакан смотреть под прямым углом к направлению солнечного света, а также, если диэлектрическая пос­тоянная уменьшена благодаря присутствию добавок. Хинин, возбуждаемый ультрафиолетовым излучением солнца, при возвращении в основное состоя­ние испускает голубой свет с длиной волны около 450 нм. Явление флуо­ресценции часто может быть обусловлено некоторыми добавками. Напри­мер, зеленое или красно-оранжевое свечение, наблюдаемое иногда в анти­фризе, вероятно, вызвано следовыми количествами флуоресцеина или род­амина соответственно (рис. 1.1). Многоядерные ароматические углеводоро­ды, такие, как антрацен или перилен, также флуоресцируют, чем может частично определяться голубая флуоресценция бензина. И наконец, сильно флуоресцируют такие соединения, как РРО и РОРОР, используемые в "сцинтилляционных" растворах и биохимических исследованиях. Другие примеры будут даны в книге со ссылками на полезные свойства индивиду­альных флуорофоров. В отличие от молекул органических ароматических соединений атомы* в основном не флуоресцируют в конденсированной фазе.

РИС. 1.1. Структуры типичных флуоресцирующих соединений.

РИС. 1.2. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина (по данным ).

Спектры испускания не могут быть правильно изображены одновременно в шка­ле длин волн и в шкале волновых чисел. В данном случае использовано правильное изображение в шкале волновых чисел. Длины волн приведены для удобства (см. гл. 2).

Единственным заметным исключением является группа элементов, обычно называемых лантаноидами [ 1]. Флуоресценция ионов европия и тербия выз­вана переходами электронов между f -орбиталями, которые экранированы от растворителя более высокими заполненными орбиталями.

Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см -1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены на рис , 1.2. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от хими­ческой структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор растворен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, име­ют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уров­нями энергии основного и возбужденного состояний *. Другие соединения, такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры.

*Колебательная структура спектров испускания определяется колебательными подуровнями основного, а не возбужденного электронного состояния (подробнее см„ ниже). - Прим.. peд,

1.1. Диаграмма Яблонского

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уров­ней энергии, предложенная Яблонским [ 3], Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S 0 , S, и S 2 соответственно (рис. 1.3), Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебатель­ных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Влияние раство­рителя во внимание не принимается, оно будет подробнее рассмотрено в гл. 7. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется , чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происхо­дит примерно за 10 -15 с, время, слишком короткое для заметного смеще­ния ядер (принцип Франка - Кондона).

Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена (см. рис. 1.2). Отдельные максимумы испускания (а следовательно, и колебательные уровни энергии) отстоят друг от друга примерно на 1500 см -1 . Относительное число мо­лекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описыва­ется распределением Больцмана:

Отношение R числа молекул в двух сос­тояниях с разностью энергий Е дается выражением

R = e -  E/kT (1.1)

где k - константа Больцмана; Т - абсолютная температура, К. При ком­натной температуре 300 К отношение R равно~0,01. Следовательно, боль­шинство молекул будет находиться в самом нижнем колебательном сос­тоянии; именно такие молекулы и поглощают свет.

РИС. 1.3. Диаграмма Яблонского.

Из-за большой разнос­ти энергий между уровнями S 0 и S 1 по существу, ни у каких флуорофоров состояние S 1 не может быть заселено термическим путем. Интересно от­метить, что даже малое термически активированное заселение первого возбужденного колебательного состояния молекул можно зарегистрировать, используя различие спектров поглощения при разных температурах.

За поглощением света обычно следует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровня состояний (S 1 либо S 2). 3а некоторыми редкими ис­ключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния S 1 . Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10 -12 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10 -8 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до про­цесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному сос­тоянию (рис. 1.3). Термическое равновесие достигается за время порядка 10 -12 с. Интересным следствием из такого рассмотрения является то, что спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбуж­денных электронных состояний, а спектр испускания - колебательную струк­туру основного электронного состояния. В большинстве случаев электрон­ное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в спектрах поглощения и испускания, сходны.

Молекулы в состоянии S 1 могут также подвергаться конверсии в пер­вое триплетное состояние Т 1. Испускание из Т 1 называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S 1 в Т 1 называется интеркомбинационной конверсией . Переход из Т 1 в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На ис­пускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном виде на рис. 1.3: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях. Все они будут рассмотрены детально в последующих разделах книги.
1.2 Характеристики испускания флуоресценции

Для явления флуоресценции известно несколько основных характе­ристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже­ перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения,

1.2.1. Стоксов сдвиг

Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно пог­лощения в сторону больших длин волн, т.е. потеря энергии (исключение - атомы в газовой фазе). Это явление впервые наблюдал Стоке в 1852 г. в Кембридже [ 4], используя при этом аппаратуру , принцип действия которой изображен на рис. 1.4. Источником ультрафиолетового возбуждения слу­жил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла. Пе­ред приемником в качестве желтого фильтра стоял стакан с вином, Флуоресценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невоору­женным глазом. В настоящее время для определения величины стоксова сдвига используют другие методы.

Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблю­даются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S 1 . К тому же обычно происходит переход на возбужденные колебательные уровни состояния S 0 (см. рис. 1.3), что приводит к дополнительной потере колебательной энергии.

РИС. 1.4. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига.

Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влия­ниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа доста­точно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие стол­кновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения про­исходят непрерывно.
1.2.2, Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения

Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния.S 1 . Эта релаксации про­исходит за время порядка 10 -12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азулен), когда испускание может происходить как из S 2 -, так и из S 1 -состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ве­дет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обус­ловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно воз­можно для тех флуорофоров , которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.

1,2.1 Правило зеркальной симметрии

Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зер­кальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу изS 0 в S 1. Это особенно наглядно в случае перилена (см. рис. 1.2). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же перехода­ми, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний S 0 и S 1 . Для многих молекул различное распределение электронов в сос­тояниях S 0 и S 1 существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без из­менения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебатель­ными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис. 1.5).

РИС. 1.5. Правило зеркальной симметрии и факторы Франка - Кондона.

Необходимым условием для зеркальной симметрии является представ­ление спектров поглощения и испускания в соответствующих единицах. Наи­лучшая симметрия должна существовать между модифицированными спек­трами (v)/v и F(v)/v 3 , где  (v) - коэффициент поглощения, соответствую­щий волновому числу v, a F(v) - относительный поток фотонов в интерва­ле волновых чисел Δ v [ 5]. Соответствие между такими спектрами обычно наблюдается для полиядерных ароматических углеводородов.

Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняет­ся, из него существует множество исключений. В качестве примера на рис. 1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила. В спектре испуска­ния видна колебательная структура, которая отсутствует в спектре погло­щения. Такое отклонение от правило зеркальной симметрии обычно указы­вает на различное геометрическое расположение ядер в основном и возбужденном состояниях.

РИС. 1.6. Спектры поглощения и испускания дифенила.

Смешение ядер может произойти до процесса ис­пускания из-за относительно большого времени жизни состояния S 1 . В слу­чае дифенила, вероятно, отдельные кольца становятся более копланарными в возбужденном состоянии, в результате чего спектр испускания становит­ся более структурированным по сравнению со спектром поглощения. Дифенил не только представляет собой пример отклонения от правила зеркаль­ной симметрии, он необычен еще и тем, что его спектр испускания имеет более четко выраженную колебательную структуру, чем спектр поглощения. Обычно наблюдается противоположная картина.

Кроме геометрических перегруппировок отклонение от правила зеркальной симметрии могут вызвать также реакции в возбужденных состояниях. Так, например, для фенола и тирозина наблюдается по две полосы испускания, причем длинноволновое испускание более заметно при высоких концентрациях акцепторов протона (см, рис, 11,18). Величина рК а фенольной гидроксильной группы уменьшается от 11 в основном состоянии до 4 в возбужденном состоянии.

РИС. 1.7. Спектры испускания пирена и его эксимера (по данным ).

Относительная интенсивность в максимуме флуоресценции эксимера (470 нм) уменьшается при понижении концентрации пирена от 6x10 - 3 М (верхняя кривая) до 0,9x10 -1 М (нижняя кривая).
Вслед за возбуждением фенольный протон переходит к акцепторам про­тона в растворе. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята. Примечательно то, что, даже несмотря на отсутствие активных групп, мно­гие полиядерные ароматические углеводороды также вступают в реакции в возбужденных состояниях. Так, например, молекулы пирена в возбужденном состоянии объединяются в комплексы , называемые эксимерами (сокращение от excited dimers - возбужденные димеры). Испускание эксимеров смешено в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, в нем отсутствует колебательная структура (рис.1.7), Такие полиядерные ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с ами­нами комплексы с переносом заряда. Комплексы, образующиеся в возбужден­ном состоянии, называют эксиплексами.
1.3. Времена затухания и квантовые выходы флуоресценции

Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирую­щих соединений. Смысл этих параметров хорошо виден из модифицированной диаграммы Яблонского (рис. 1.8). На этой диаграмме мы не указываем по­дробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию S 1 , а обращаем большое внимание на процессы, которые ответст­венны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной дезактивации в состояние S 0 (k).

Квантовый выход флуоресценции - это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Обе константы скорости Г и k соответствуют процессам уменьшения заселенности возбужденного состояния. Доля молекул флуорофора , которые дезактивируются с испусканием, а следовательно, и квантовый выход определяются выражением

Q = Г/(Г+k) (1.2)

Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испуска­ния, т. е. k « Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь. Для удобства мы сгруппировали все возможные процессы безызлучательной дезактивации в одну константу скорости k.

РИС. 1.8. Модифицированная диаграмма Яблонского.

Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресцен­ции -10 нс, Для флуорофора, описываемого диаграммой Яблонского (рис. 1.8), время затухания равно

τ = 1/(Г +k) (1.3)

Необходимо помнить, что испускание флуоресценции - это случайный про­
цесс и не все молекулы испускают фотоны при t = τ. Время жизни - это
средняя продолжительность пребывания в возбужденном состоянии. В приме­
ре для одноэкспоненциального затухания, приведенном в гл. 3, 63% молекул гибнет за время t = τ, а 37 % - за время t > τ. Время жизни флуорофора в отсутствие безызлучательных процессов, называемое собственным временем жизни *,τ 0 , равно

τ 0 = 1/Г (1.4)

Отсюда вытекает обычное соотношение между квантовым выходом и време­
нем жизни:

Q= τ / τ 0 (1.5)

Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием лю­бых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания. Сцинтилляторы обычно выбира­ют за их высокие квантовые выходы , которые являются результатом боль­ших значений Г. Им обычно соответствуют короткие времена жизни, поряд­ка 1 нс. Флуоресценция ароматических соединений, содержащих группы N0 2 , обычно слаба, в первую очередь из-за большой величины k. Переход триплет- синглет запрещен по симметрии, и константы скорости спонтанного испус­кания составляют ~10 3 с- 1 или меньше **. Поскольку значения k близки к 10 9 с- 1 , квантовые выходы фосфоресценции малы при комнатной температу­ре. Из уравнения (1.2) можно получить квантовые выходы фосфоресценции, равные 10 -6 .

*Правильнее называть его радиационным (излучательным) временем жизни. - Прим. ред.

**Автор приводит слишком большое значение k для внутримолекулярной безызлучательной дезактивации триплетных состояний, которая встречается редко - лишь для молекул, претерпевающих химические превращения (в частности, изомеризацию). Из-за спинового запрета безызлучательный интеркомбинационный переход Т 1 → S 0 для большинства молекул имеет константы скорости k 1.4. Анизотропия флуоресценции

Флуорофоры преимущественно поглощают те фотоны , электрические век­торы которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. Момент перехода имеет определенную ориентацию в молекуле флуорофора. В изотроп­ных растворах молекулы флуорофоров ориентированы случайным образом. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются те моле­кулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего света (см. разд. 5.2.1). Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуоро­форов (фотоселекция) приводит к частично поляризованному испусканию флу­оресценции. Для каждого флуорофора моменты перехода для поглощения и испускания имеют фиксированную ориентацию, и угол между ними определя­ет максимальную измеряемую анизотропию r 0 , см. уравнение (5.20)]. Ани­зотропия (r) и поляризация (Р) флуоресценции выражаются уравнениями

(1.6), (1.7)

гдегде I || и I ┴ интенсивности флуоресценции вертикально (II) и горизонталь­но (┴) поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикаль­но поляризованным светом. Анизотропия и поляризация - это выражения од­ного и того же явления, поэтому их можно взаимозаменять, используя урав­нения (5.3) и (5.4). Некоторые факторы могут уменьшать измеряемую вели­чину анизотропии до значений ниже максимального. Самый распространен­ный из них - вращательная диффузия, которая происходит за время жизни возбужденного состояния и смещает испускающий диполь флуорофора. Из­мерение этого параметра дает информацию об относительном угловом сме­шении флуорофора в интервале между поглощением и испусканием. Перенос энергии возбуждения между флуорофорами также приводит к уменьшению анизотропии.

Предположим, что единственным существенным процессом, приводящим к уменьшению анизотропии, является вращательная диффузия. Тогда измеряемая анизотропия определится выражением

,

где r 0 - анизотропия, которая должна была бы измеряться в отсутствие вра­щательной диффузии, а φ - время корреляции для процесса диффузии, опре­деляемое как

φ =ηV/kТ (1.9)

где η - вязкость раствора ; k - константа Больцмана; Т - абсолютная темпе­ратура; V -объем вращающегося фрагмента. Рассмотрим белок с молеку­лярной массой 50 000. Поскольку удельный объем белков составляет 0,73 мл/г, можно легко подсчитать, что при 25° С в водном растворе (n = 0,00894 П) ожидаемое время корреляции составляет 13 нc для безводной сферы. Поскольку белки гидрагированы, фактическое время корреляции, по-видимому, должно быть больше. Однако существенным является то, что вре­мена вращательной корреляции для большинства белков сравнимы с типич­ными временами затухания флуоресценции. Поэтому результаты измерения анизотропии флуоресценции зависят от всех факторов, влияющих на скорость вращательной диффузии. По этой причине измерения поляризации флуорес­ценции широко используют для изучения гидродинамических свойств макро­молекул.

1.5. Временная шкала молекулярных процессов в растворе

Флуоресцентная спектроскопия - эффективный метод исследования ди­намических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужден­ных состояний. Вследствие принципа Франка - Кондона абсорбционная спек­троскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках основного состояния молекул, поглотивших свет. Поскольку только те мо-иекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектро­скопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболоч­ке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекуляр­ную динамику.

В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов , протекающих за вре­мя жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участ­вовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 А от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 нс - слишком корот­кий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с временем движения малых молекул в жидком растворе. Вращательная диффу­зия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается в этот временной диапазон.

Тушение флуоресценции молекулярным кислородом по механизму стол­кновений является показательным примером размеров пространственного и временного диапазонов, представляемых временем затихания флуоресцен­ции. Если флуорофор, находящийся в возбужденном состоянии, сталкивает­ся с молекулой кислорода, он возвращается в основное состояние без испус­кания фотона. Коэффициент диффузии кислорода в воде при 25°С равен 2,5 10 -3 см 2 /с. Среднее расстояние [(Δх 2) 1/2 ], на которое может диффун­дировать молекула кислорода за 10 -3 с, определяется уравнением Эйнштейна:

Δ x 2 = 2Dτ (1.10)

Расстояние [ (Δх 2) 1/2 ] составляет ~ 70 Å, что сравнимо с толщиной биологи­ческой мембраны или диаметром белка. Для некоторых флуорофоров време­на жизни достигают 400 нc, поэтому можно наблюдать диффузию молекул кислорода на расстояния свыше 450 А. Напротив, измерения поглощения дают сведения лишь о непосредственном окружении флуорофора и, следова­тельно, о мгновенном усредненном окружении.

Влияние молекулярной динамики на спектры флуоресценции также обна­руживается при рассмотрении энергий. Органические молекулы, как правило, поглощают свет в диапазоне длин волн 200 - 500 нм, что соответствует энергиям от 140 до 60 ккал/ моль. Вслед за поглощением у флуорофора из­меняется (обычно возрастает) дипольный момент. Если молекулы растворителя также имеют дипольные моменты, они переориентируются во­круг диполя возбужденного состояния , понижая тем самым его энергию. Этот процесс называется релаксацией растворителя и происходит в жидких растворах за 10 -12 с. Релаксация растворителя может приводить к значи­тельным стоксовым сдвигам. В белках триптофановые остатки поглощают свет с длиной волны 280 нм, а испускают флуоресценцию при -350 нм. Таким образом, за несколько наносекунд, проходящих до процесса испус­кания, расходуется 20 ккал/моль.

В основе любого эксперимента лежат измерение некоторой величины и корреляция полученных результатов с явлением, представляющим интерес для исследователя. Временной диапазон между поглощением света и после­дующим его испусканием достаточен для протекания нескольких процессов, каждый из которых приводит к ослаблению наблюдаемых спектральных ха­рактеристик флуоресценции. К таким процессам относятся столкновения с тушителями, вращательная и поступательная диффузия, образование комп­лексов с растворителями или с растворенными веществами и переориента­ция окружения молекулы в возбужденном состоянии с измененным дипольным моментом. Эти динамические процессы могут влиять на анизотропию флуоресценции, квантовые выходы, времена жизни и спектры испускания. В результате спектральные характеристики флуорофоров могут дать большую информацию о динамических процессах, протекающих за время испускания флуоресценции.

1.6. Флуорофоры

1.6.1 Природные флуорофоры

Из большого числа молекул биологических веществ многие являются природными, или естественными, флуорофорами. Мы кратко суммируем ин­формацию о широко известных флуорофорах , что дает основу для последую­щих глав. Такое конспективное изложение не является исчерпывающим.

БЕЛКИ Триптафан - наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокисло­та в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками. "Этот природный флуорофор крайне чувствителен к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги часто являются след­ствием нескольких явлений, среди которых можно выделить связывание лигандов, ассоциацию белок - белок и денатурацию. Кроме того, максиму­мы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы спектров флуоресценции лежат в области 320 -350 нм. Времена затухания флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1-6 нс.

Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках его флу­оресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно усиливает ис­пускание тирозина. Как и для фенола, рК а тирозина очень сильно уменьшает­ся при возбуждении, и может происходить ионизация в возбужденном состоя­нии.

нуклеиновые кислоты Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. tRNA Phe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как Y-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а вре­мя жизни ~6 нc.

Кофакторы NADH флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. NAD + не флуорес­цирует. Время затухания флуоресценции NADH в водном буфере составля­ет примерно 0,4 нс. Флуоресцирующей группой является восстановленное никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за счет столкновений с остатком аденина. При связывании NADH с белками квантовый выход его флуоресценции увеличивается обычно в четыре раза. Такое увеличение выхода обычно интерпретируют как следствие связывания NADH в вытянутой конформации, что подтверждается изучением дифракции рентгеновских лучей на гидрогеназах.

РИБОФЛАВИН И FAD. Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и FAD (флавинадениндинуклеотид) поглотают свет в видимой области (-450 нм) и испускают в области 515 нм. Типичные времена жизни для FMN и FAD сос­тавляют 4,7 и 2,3 нс соответственно. Как и для NADH, флуоресценция флавина динамически тушится аденином. Далее, FAD также образует комплек-сымссоциаты , в которых флуоресценция флавнна потушена аденином (ста­тическое тушение). Флагопротеины в основном не флуоресцируют, однако опять же существуют исключения.

1.6.2. Искусственные фпуорофоры

Часто естественные флуоресцентные свойства макромолекул не позволя­ют получить из эксперимента желаемую информацию. Так, например, флуо­ресценция белка и даже поляризация этой флуоресценции не отражают явле­ние, которое хотят охарактеризовать количественно, В таком случае выби­рают флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства,

ИЗОЦИАНАТЫ И ИЗОТИОЦИАНАТЫ ФЛУОРЕСЦЕИНА И РОДАМИНА. Эти краси­тели широко используют в качестве меток для белков. Меченные флуоресцеином иммуноглобулины - коммерческие реактивы; их часто используют в флуоресцентной микроскопии. Именно эти вещества выбирают из-за вы­соких квантовых выходов и устойчивости к фото обесцвечиванию. Кроме того, благодаря большим длинам волн поглощения и испускания (рис. 1,9) сведена к минимуму проблема фоновой флуоресценции биологических об­разцов и можно избежать применения кварцевой оптики. Изоцианатная или изотиоцианатная группы находятся либо в мета-, либо в параположении по отношению к карбокси-группе (см. рис, l.l). Коммерческие меченые реа­генты представляют собой смесь изомеров. Эти красители реагируют в первую очередь с лизиновым или цистеиновым участком белков. Времена затухания флуоресценции красителей около 4 нс, а их спектры испускания мало чувствительны к полярности растворителя. Эти красители очень под­ходят для количественного определения степени ассоциации небольших ме­ченых молекул с белками на основании изменения поляризации флуоресценции.

ДАНСИЛХЛОРИД. Дансилхлорид (DNS-C1) широко используют в качестве метки для белков (рис. 1.10), особенно в тех случаях, когда проводят изме­рения поляризации. Это вещество давно известно [ 8] и имеет удобное вре-ся жизни флуоресценции (~ 10 нс). На спектр испускания дансильной груп­пы сильно влияет полярность растворителя.

РИС. 1.9. Спектры возбуждения и испускания бычьего γ-глобулина. меченного зотиоцианатом флуоресцеина (по данным [ 7]).

РИС. 1.10. Часто используемые искусственные флуорофоры.

Нафтиламинсульфоновые кислоты, 1-Анилино-8-нафталинсульфоно-вяя кислота (l,8-AТS или ANS), 2-n-толуидинилнафталин-б-сульфоновая кислота (2,6-TNS или TNS) и их производные часто используют в качестве нековалентно связанных зондов для белков и мембран. Эти зонды почти не флуоресцируют в воде, но интенсивно флуоресцируют либо при растворении в неполярных растворителях, либо когда они связаны с макромолекулами. Низкий квантовый выход в водной фазе позволяет во многих случаях не учитывать эту часть флуорофора , что упрощает эксперименты. Подобные флуорофоры связываются с сывороточными альбуминами, липопротеинами, апомиоглобином, иммуноглобулинами и липидными бислоями. Места связывания имеют, по-видимому, кик полярную, так и неполярную природу.

Гидрофобные мембранные зонды. Липиды обычно не флуоресциру­ют. Мембраны часто метят такими зондами, как перилен, 9-винилантраЦен и 1,6-дифенилгексатриен (DРН) (рис. 1.10). Эти зонды нерастворимы в во­де и встраиваются в гидрофобные участки мембран. Незамещенные много­ядерные ароматические углеводороды и DPH малочувствительны к поляр­ности растворителя. Их используют в первую очередь для оценки внутрен­ней вязкости двойных слоев по измерениям поляризации их флуоресценции (разд. 5.7.1). Путем целенаправленного изменения химического строения зонды могут быть локализованы на избранных участках мембраны. Одним из таких примеров является триметиламмониевая соль DPH (ТМA-DPH). Полагают, что заряженный атом азота приводит к локализации ТМА-DPH в области липидно-водной границы мембран [ 14].

Другие зонды, как, например PATMAN (рис. 1.11), очень чувствитель­ны к фазовому состоянию липидных бислоев [ 9]. При температуре перес­тройки мембран спектр испускания PАTМAN сжигается на 40 нм в длинноволновую область: от 425 до 465 нм. По-видимому, этот зонд реагирует на релаксацию мембраны вокруг диполи возбужденного состояния флуорофора (разд. 8.6). Были предложены и другие зонды. Чувствительность к потенциалу мембраны может быть связана с изменением ориентации зонда или его локальной концентрации в мембране , а также с влиянием электри­ческого поля т электронное распределение в зонде [ 11]. И наконец, можно выделить зонды, которые подвергаются реакциям в возбужденном состоянии. В возбужденном состоянии зонд Р 2 -С 3 , может образовывать внутримоле­кулярный эксимер, и доля образовавшихся эксимеров определяет вязкость в их ближайшем окружении.

Нуклеиновые кислоты. При введении этиленового мостика флуорес­ценция АТР и его производных становится более интенсивной [ 12]. Такие производные ε-АТР (рис. 1.11) чувствительны к вязкости растворителя , имеют высокую предельную поляризацию флуоресценции, и времена затухания их флуоресценции близки к 23 нс. Нуклеотидные аналоги активны во многих реакциях, катализируемых ферментами. Кроме того, были синтези­рованы такие аналоги нуклеотидов с вытянутой конформацией, как лин-бен-зо-АМР, Эти аналоги флуоресцируют [ 13] и сохраняют способность к обра­зованию водородных связей не модифицированных нуклеотидов.

Подводя итоги, можно сказать, что флуоресценцией обладают разнооб­разные молекулы и на спектральные свойства флуорофоров влияет целый ряд факторов и процессов. Как следствие этого, флуоресцентные методы полез­ны для изучения свойств растворов и биологических макромолекул.

РИС. 1.11. Часто используемые искусственные флуорофоры.

Е. О. Пучков,
доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
«Химия и жизнь» №9, 2014

Сразу две статьи этого номера «Химии и жизни» рассказывают о свечении биообъектов. На фото слева - малощетинковый червь Fridericia heliota , открытый учеными из Красноярского университета. О том, как был исследован его люциферин - вещество, которое при окислении ферментом люциферазой испускает голубоватый свет, - читайте в статье «Огоньки под ногами» . На фото справа - синтетический люциферин фридериции в присутствии АТФ и других необходимых компонентов демонстрирует такое же свечение, как и белковый экстракт червя. Это подтверждает, что структура люциферина установлена верно.

В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Их сильная сторона - скорость регистрации сигналов от единичных объектов, например от клеток в суспензии. Обычный коммерчески доступный цитометр работает со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные - до 25 000 клеток в секунду! В стандартном варианте у каждого объекта измеряются от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Таким образом можно получить статистически достоверные результаты по гетерогенности клеточных, в частности микробных, популяций. Существуют также приборы, способные сортировать клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции, чтобы затем изучать субпопуляции с использованием других методов.

...И что из них можно узнать

Итак, все флуоресцентные репортеры имеют специализацию, то есть способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».

С помощью ряда флуоресцентных репортеров (как правило, органических флуорофоров) можно следить за ферментативным катализом - исследовать динамику ферментативных реакций, их локализацию в клетках, тканях, органах и т. п. Это, например, субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции, или «профлуорофоры», становящиеся флуоресцентными при взаимодействии с продуктом реакции.

Репортеры, сформированные на основе антител - физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами, - информируют о протекании иммунологических реакций. Флуоресцирующим компонентом может быть любой из известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. Современные технологии позволяют получить антитела к любому белку (антигену), интересующему исследователя, антитело же с флуоресцентной меткой заставит светиться этот белок или структуру, из него построенную. Например, с помощью флуоресцентных антител выявлены микрофибриллы в фибробластах мышей (см. фото на второй странице обложки).

Очень информативны методы с использованием флуоресцентных белков (ФБ). Мы уже упоминали о том, как полезны методы внедрения в клетку генов гибридных белков, которые заставляют флуоресцировать естественный белок или даже нуклеиновую кислоту. Вдобавок флуоресценция ФБ-содержащих гибридных белков зависит от кислотности среды, что позволяет измерять рН не только внутри клетки, но и внутри отдельных органелл, если такой белок «адресован» в ядро или митохондрию.

Особый интерес вызывает применение ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на безызлучательной передаче энергии. Представьте себе два гибридных белка, один из которых заставляет флуоресцировать другой при сближении. Подобным же образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках, если присоединить ФБ к разным участкам одной белковой молекулы.

Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения флуорофоров позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. В их числе, например, вязкость цитоплазмы, внутреннего содержимого органелл, гидрофобного слоя биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на мембране: с помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала. Существуют даже репортеры для измерения внутриклеточной температуры!

Не только на глаз

Возможности зрительного анализа ограничены в основном качественной оценкой: «есть свечение - нет свечения». Гораздо больше информации дают количественные характеристики (см. главу «Язык флуоресцентных репортеров»).

Для количественной характеристики флуоресценции используют две методологии. Первая служит для измерения различных характеристик флуоресценции в сравнительно большой (макроскопической) области объекта, что обеспечивает получение усредненных характеристик по объекту: раствору, суспензии коллоидных частиц, клеток, субклеточных частиц и т. п. Вторая ориентирована на единичные микроскопические объекты, в первую очередь клетки и субклеточные частицы.

Измерения интегральной флуоресценции проводят с помощью спектрофлуориметров (флуоресцентных спектрофотометров) и планшетных флуориметров (англ. plate readers ). Спектрофлуориметры-это, как правило, аналитические приборы, на которых можно получить все основные характеристики флуоресценции. Планшетные флуориметры - устройства для анализа большого количества образцов (иногда более тысяч), но лишь по нескольким фиксированным характеристикам, например по интенсивности флуоресценции в определенной спектральной области и/ или по времени жизни флуорофоров в возбужденном состоянии. Большинство методик с использованием планшетных флуориметров основано на иммунологических реакциях или на анализе развития культур клеток в монослоях.

Методология измерений флуоресценции единичных микроскопических объектов также имеет два варианта.

Первый основан на получении цифровых изображений объектов с последующим компьютерным анализом. Второй - на «поштучном» измерении флуоресценции микрообъектов в потоке, при прохождении через узкий капилляр специального прибора - проточного цитометра.

Флуоресцентная микроскопия недавно пережила настоящую революцию: разработаны новые устройства, прежде всего конфокальные микроскопы, в которых возбуждение и регистрация флуоресценции осуществляются через микроскопическое отверстие, отсекающее «лишнее» свечение, которое возникает вне фокуса объектива. Этот «зрачок» сканирует изображение в горизонтальной и/или вертикальной плоскости, сигналы регистрирует фотоумножитель, и после их компьютерной обработки получается пространственное изображение объекта. Такая конструкция позволяет получать более четкие по сравнению со стандартными микроскопами двумерные и трехмерные изображения. Кроме того, на современных конфокальных микроскопах можно проводить измерения параметров затухания флуоресценции.

Еще один тип «революционных» микроскопов функционирует, казалось бы, вопреки основным физическим принципам флуоресценции. Атомы в них возбуждаются светом с длиной волны, большей, чем у флуоресценции, а не меньшей. На самом деле никакие законы физики при работе этих микроскопов не нарушаются, просто при достаточной интенсивности светового потока с большей длиной волны в один и тот же атом одновременно могут попасть два фотона, поглощенная электронами энергия удваивается, и ее оказывается достаточно для возбуждения флуоресценции. Поэтому такие микроскопы называются двухфотонными. А поскольку световой поток максимально сконцентрирован в фокусе объектива, обеспечивается условие высокого разрешения изображений. Двухфотонные микроскопы отличает также способность регистрировать флуоресценцию в образцах на глубине до 1,5 мм и возможность существенно уменьшить неблагоприятное действие возбуждающего излучения как на исследуемые объекты, так и на флуоресцентные репортеры.

Количественную информацию из цифровых изображений извлекают с помощью компьютерных программ анализа изображений. Измеряют интенсивность флуоресценции и ее пространственное распределение, оценивают спектральные характеристики излучения, определяют количество флуоресцирующих частиц, например клеток, характеризуют временные и поляризационные параметры флуоресценции. Специальные аналитические приемы (так называемая флуоресцентная корреляционная спектроскопия) позволяют использовать конфокальную и двухфотонную микроскопию для исследования движения даже единичных флуоресцирующих молекул!

Что высветили в микромире флуоресцентные репортеры

Флуоресцентные репортеры долго и успешно служат во многих, если не во всех областях экспериментальной биологии. Однако есть такие области, где они сыграли ключевую роль.

С использованием флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран. Согласно этой модели, при всей ее структурной целостности мембрана достаточно «жидкая», чтобы отдельные ее компоненты могли перемещаться в нужные стороны. Такое представление позволяет понять основные молекулярные механизмы функционирования мембран, а также свойства живых клеток в целом.

В значительной мере благодаря информации от флуоресцентных репортеров прояснились механизмы трансформации энергии в клетках. Особую роль здесь сыграли флуорофоры, позволяющие регистрировать внутриклеточный и внутримитохондриальный рН, а также разность электрических потенциалов на мембранах. С их помощью прежде всего был выявлен механизм сопряжения энергодонорных реакций окисления с энергозатратным синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) - универсального поставщика энергии для большинства метаболических процессов. Кроме того, была изучена природа накопления различных веществ в цитоплазме и в клеточных органеллах за счет мембранного электрического потенциала и градиента рН.

Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций, а за координацию отвечают так называемые сигнальные системы. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только подходы, основанные на применении флуоресцентных репортеров, показали напрямую, где пролегают эти пути и как по ним проходят сигналы, - стало возможным в реальном времени следить за взаимодействиями сигнальных белков или оценивать динамику экспрессии генов в отдельно взятой клетке. С помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить и неизвестные ранее сигнальные компоненты, например выявить роль ионов Са +2 как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.

Во второй половине ХХ века в микробиологии возникла проблема, которую окрестили «великой аномалией учета микроорганизмов с помощью чашек Петри». «Виновниками» оказались флуоресцентные репортеры, два красителя нуклеиновых кислот - акридиновый оранжевый и 4,6-диамидино-2-фенилиндол. Оценить содержание микроорганизмов в природном образце можно, либо подсчитывая колонии, выросшие на чашке Петри (при достаточном разведении «посевного материала» каждую колонию образуют потомки лишь одной клетки), либо напрямую подсчитывая под микроскопом сами микроорганизмы, прокрашенные флуоресцентными красителями нуклеиновых кислот. Так вот, флуоресцентные репортеры всегда выявляли значительно больше микроорганизмов, чем анализ с чашками Петри.

Для объяснения этого противоречия были выдвинуты две гипотезы. Согласно первой, часть клеток, находящихся в состоянии покоя, не размножается на чашках Петри. Согласно второй, условия культивирования (состав среды, температура и др.) не соответствуют потребностям некоторой части популяции. Проверка этих гипотез показала, что возможно и то, и другое. Более того, был дан толчок к формированию двух новых больших направлений исследований. Первое связано с изучением так называемого жизнеспособного, но некультивируемого состояния микроорганизмов. Понятна практическая значимость таких исследований: например, патогены человека в этом состоянии могут быть невидимы для стандартных методов диагностики и более устойчивы к лекарственным препаратам. Второе направление - выявление и изучение микроорганизмов в природных образцах путем прямого анализа их нуклеиновых кислот, без предварительного получения чистых культур, как это делалось раньше. Это направление получило собственное название - метагеномика. Благодаря методам метагеномики (кстати, некоторые из этих методов предполагают использование флуоресцентных репортеров) появилась возможность по-новому увидеть биологическое разнообразие микроорганизмов в отдельных экосистемах и на Земле в целом.

Итак, современные флуоресцентные репортеры - это огромная армия специалистов, и многие из них уже имеют громкую славу в экспериментальной биологии. Их репортажи позволили лучше разглядеть те уголки микромира, куда может заглянуть свет. Однако многие исследователи, работающие в данной области, считают, что все, увиденное нами в свете флуоресценции до сих пор, - это только начало!