Glosář:

• Polarizované světlo jsou světelné vlny, které vibrují jedním směrem.

• Světelná vlna je elektrické a magnetické záření s rovinou kmitání kolmou na rovinu šíření vlny.
• Polarizátor (Nicol I) je zařízení, které propouští pouze plně nebo částečně polarizované světlo. Navrženo pro přenos polarizovaného světla do (přes) studovaného průhledného objektu a odříznutí (rozptylování) nepolarizovaného světla (přirozené světlo, umělé světlo, včetně záření z iluminátoru mikroskopu). Intenzita světla procházejícího polarizátorem klesá úměrně druhé mocnině kosinusu úhlu mezi polarizačními rovinami polarizátoru a analyzátoru (Malusův zákon):

Kde: I je intenzita před průchodem polarizátorem, I je intenzita světla po průchodu polarizátorem, φ je úhel mezi rovinami polarizace polarizovaného světla a polarizátorem.

• Analyzátor (Nicol II) - zařízení podobné polarizátoru, ale určené k analýze polarizovaného světla.

Otočení analyzátoru vzhledem k polarizátoru o úhel ϕ. Intenzita světla je znázorněna červenou šipkou.

• Kompenzátor je zařízení pro určování kvantitativní charakteristiky polarizace. Převádí viditelný obraz s vysokým kontrastem na barevný obraz zeslabením určitých vlnových délek v bílém světle.
• Lineárně polarizované světlo je světlo s rovinou kmitání ohraničenou v jednom směru a šířící se v jedné rovině.
• Fáze oscilací světelné vlny je z matematického hlediska argumentem funkce světelné vlny, tedy ωt+φ 0 ve funkci sin(ωt+φ 0). Fyzikálně se jedná o určitý elektromagnetický stav v určitém okamžiku.

• Vlnová délka je vzdálenost mezi dvěma nejbližšími body, které jsou ve stejné fázi.

• Odraz je změna směru vlny. Plný odraz se nazývá změna úhlu lomu vlny menší než 90°.

• Lom je změna směru vlny na rozhraní dvou prostředí. Dvojlom je rozdělení jednoho paprsku světla v anizotropním prostředí na dva paprsky.

Obrázek 4 - Lom paprsků v krystalu islandského jitrocele.

• Dichroismus je částečná absorpce světla látkou v závislosti na její polarizaci.

• Interference je změna intenzity světla, když jsou dvě nebo více světelných vln superponovány.

• Rozdíl v dráze světelných paprsků je hodnota, která charakterizuje zpomalení rychlosti světla při průchodu průhlednou látkou. Dráhový rozdíl je měřen vzdáleností, kterou urazí světlo ve vakuu za stejnou dobu, která je nezbytná pro průchod ve studované látce ve studovaných bodech prostoru.

• Konoskopie je metoda pro studium optických vlastností anizotropních objektů v konvergujících svazcích polarizovaného světla. Během konoskopie jsou při otáčení analyzátoru sledovány změny v interferenčním vzoru. Vzájemným otáčením analyzátoru a polarizátoru badatel pozoruje v mikroskopu konoskopické obrazce skládající se z izogyrů (jedná se o tmavé pásy odpovídající směru oscilace světelných vln v polarizátoru) a izochromů (jedná se o pásy různých barev interference které odpovídají směrům paprsků v krystalu se stejným rozdílem drah).

• Ortoskopie je metoda pro studium optických vlastností anizotropních objektů v paralelních svazcích polarizovaného světla.

• Pleochroismus je změna pozorované barvy některých anizotropních objektů se změnou úhlu pohledu (změna barvy krystalů při otáčení stolu).

Polarizační mikroskop je mikroskop určený ke studiu dvojlomu polarizovaného světla procházejícího anizotropním prostředím.

První polarizační mikroskop zkonstruoval v roce 1863 Henry Clifton Sorby a od optického mikroskopu, na který jsme zvyklí, se lišil dvěma Nicolovými hranoly instalovanými v optické dráze. Nicolův hranol propouští světlo skrz sebe pouze v jednom směru a v jedné rovině, tedy rovinně polarizované světlo, zbytek světla, který do těchto hranolů vstupuje, se zcela odráží a rozptyluje. Tyto hranoly se od sebe konstrukčně neliší a fungují jako polarizátory (analyzátor a polarizátor). Když je polarizační rovina analyzátoru otočena o 90º vzhledem k polarizační rovině polarizátoru, výzkumník pozoruje polarizační vzor dvojlomného objektu a všechny objekty, které nemají dvojlom, ztmavnou. V moderních mikroskopech získat více Pro informaci hranoly DIC (kombinace reliéfu s polarizačním vzorem, pro studium nebarvených vzorků), kompenzátory (pro kvantitativní polarizaci), kulatý stůl (pro studium pleochroismu) a jednoduché polaroidy pro jednoduchá pozorování (například v biologii a medicíně) může být použito.

Polarizace se nejčastěji používá v krystalografických mikroskopech, kde lze vlastnosti anizotropních objektů určit pomocí konoskopie a ortoskopie. Pozor na podobnosti a rozdíly mezi konoskopií a ortoskopií: světelný paprsek prochází polarizátorem (1), je omezen aperturní clonou (2), prochází kondenzorovými čočkami (3); analyzátor (který otáčí výzkumníka) (8) a kompenzátory (7).

Obrázek 1 - Schéma polarizačního mikroskopu pro: a) Ortoskopii b) Konoskopii

Legenda: 1 - polarizátor, 2,6 - membrány; 3 - kondenzátor; 4 - droga; 5 - čočka; 7 - kompenzátor; 8 - analyzátor; 9 - Bertrandova čočka; 10 - ohnisková rovina okuláru; 11 - okulár.

Pozorovaný obraz se skládá z konoskopických obrazců. konoskopické obrazce - skládají se z izogyrů (jedná se o tmavé rovné nebo zakřivené pruhy, ve kterých jsou směry vibrací rovnoběžné s hlavními úseky nicolů) a izochromů (jedná se o pruhy natřené různými interferenčními barvami. Každý pás odpovídá směrům paprsky vznikající při dvojlomu a mající stejný rozdíl v dráze).

Uveďme příklad: v deskách jednoosého krystalu vybroušeného kolmo k optické ose uvidíme izogyru v podobě kříže a soustředných izochromových prstenců, viz Obr. 5.

Obrázek 5 - A) Konoskopické obrazce jednoosého kalcitového minerálu B) Biaxiální flogopitový minerál s vloženým kompenzátorem.

Podle povahy získaného interferenčního obrazce se měří hodnota dvojlomu, úhly natočení polarizační roviny, úhly extinkce, počet optických os a další charakteristiky. Všechny tyto charakteristiky dávají jasně najevo, který krystal badatel pozoruje, jeho strukturu. Mikroskopy jako BX53P a H600P byly navrženy pro mineralogii a krystalografii. Jsou vybaveny nejlepší beznapěťovou optikou a kompenzátory vyrobenými na moderním zařízení, které eliminují vůle a mezery, když jsou instalovány v mikroskopu.

Dvojlom se využívá nejen v krystalografii, ale také v medicíně, biologii, forenzní vědě a metalografii, protože pro výzkumníky je důležité rychle a přesně izolovat vitamíny, kyseliny, minerály, napětí v izotropních předmětech, nekovové inkluze v původním vzorku, a další. Například mikroskopy pro histologii a cytologii jsou vybaveny polarizátory pro detekci různých druhů objektů. Kulaté předměty o průměru asi 2,4 mikronu, lipoidy a kapky, se zkříženými polarizátory tvoří interferenční obrazec maltézského kříže. Ne všechny látky mají stejné vlastnosti lomu při různé teploty, takže lze např. rozlišit 1) látky, které při ochlazení získávají anizotropní vlastnosti a při zahřátí je ztrácejí: cholesterol a jeho estery 2) při zahřívání neztrácejí anizotropní vlastnosti: cerebrosidy, fosfatidy, myeliny. Taková variabilita vlastností je dána schopností látky udržet si krystalickou strukturu, tk. To je příčinou dvojlomu. Pozorováním anizotropních objektů v polarizačním mikroskopu a stanovením jejich koncentrace lze diagnostikovat taková onemocnění jako: artritidu, aterosklerózu, lipoidurii, cilinurii a lipidózu pomocí záře lipidů se zkříženými polarizátory, dále dnu, urolitiázu, selikózu a azbest krystaly močovina, oxid křemičitý a azbestová vlákna. Pro histologii a cytologii byl vyvinut mikroskop BX46, který je vybaven nízkým stolkem, výkonným osvětlovačem a výškově stavitelným tubusem, který ušetří badatelova záda od vzlínání.

Zbarvení odlišné od izotropních objektů v polarizovaném světle je: škrob, celulóza, některé kyseliny, vitamín C, proto by i mikroskopy pro farmakologii a farmacii měly být vybaveny polarizátory. Farmakologický mikroskop zahrnuje jak CX43, tak BX43 a další modely, protože v této oblasti je každým rokem více a více výzkumů a nové výzkumné objekty vyžadují jiný přístup.

Ve forenzní vědě je důležité odlišit inkluze zrn křemene a dalších minerálů od organických a jiných materiálů, které lze nalézt na místě činu, takže mikroskop musí být vybaven odraženým světlem, aby bylo možné pozorovat i neprůhledné předměty. Mikroskop BX53M je vhodný pro kriminalistiku, protože je vybaven nejen výkonným zdrojem procházejícího světla, ale také stejně výkonným osvětlovačem odraženého světla a vložky pro zvýšení pracovní vzdálenosti mikroskopu vám umožní studovat velmi velké objekty bez dlouhé předběžné přípravy.

Polarizační mikroskopy se používají i v metalografii, ale pro takové studium stačí znát přítomnost či nepřítomnost anizotropních objektů a také jejich prostorové rozložení. Právě pro klasifikaci a počítání takových objektů lze v metalografii použít mikroskopy VHX6000, BX53P s nainstalovaným Streamem.

Metoda fázové kontrastní mikroskopie

Většina buněčných struktur se málo liší indexem lomu světla, pohlcováním paprsků mezi sebou a prostředím. Aby bylo možné tyto komponenty studovat, je třeba změnit osvětlení (se ztrátou jasnosti obrazu) nebo použít speciální metody a zařízení. Jednou z takových metod je mikroskopie s fázovým kontrastem. Je široce používán při vitálním studiu buněk. Podstata metody spočívá v tom, že i při velmi malých rozdílech v indexech lomu různých prvků drogy prochází světelná vlna jimi procházející různými fázovými změnami. Tyto fázové změny, které jsou přímo neviditelné ani okem, ani pro fotografickou desku, se speciálním optickým zařízením převádějí na změny amplitudy světelné vlny, tedy na změny jasu, které jsou již viditelné okem nebo jsou zaznamenány na fotocitlivá vrstva. Ve výsledném viditelném obrazu distribuce jasu (amplitud) reprodukuje fázový reliéf. Výsledný obraz se nazývá fázový kontrast. Objekty se mohou jevit jako tmavé na světlém pozadí (kladný fázový kontrast) nebo světlé na tmavém pozadí (negativní fázový kontrast).

Metoda interferenčního kontrastu (interferenční mikroskopie)

Metoda interferenčního kontrastu je podobná předchozí – obě jsou založeny na interferenci paprsků, které prošly mikročásticí a prošly ji. Paprsek paralelních světelných paprsků z iluminátoru se rozdělí na dva proudy a vstoupí do mikroskopu. Jeden ze získaných paprsků je nasměrován přes pozorovanou částici a získává změny ve fázi oscilace, druhý - obchází objekt podél stejné nebo další optické větve mikroskopu. V oční části mikroskopu se oba paprsky znovu spojí a vzájemně se ruší. V důsledku interference se vytvoří obraz, na kterém se budou kontrastně lišit úseky buňky s různou tloušťkou nebo různou hustotou. Metoda interferenčního kontrastu se často používá ve spojení s jinými mikroskopickými metodami, zejména pozorováním v polarizovaném světle. Jeho použití v kombinaci s ultrafialovou mikroskopií umožňuje např. stanovení obsahu nukleové kyseliny v celkové suché hmotnosti předmětu.

Polarizační mikroskopie

Polarizační mikroskopie je metoda pozorování v polarizovaném světle objektů, které mají izotropii, tzn. uspořádaná orientace submikroskopických částic. Před kondenzorem polarizačního mikroskopu je umístěn polarizátor, který propouští světelné vlny s určitou rovinou polarizace. Po preparaci a čočce je umístěn analyzátor, který může propouštět světlo se stejnou rovinou polarizace. Pokud se pak analyzátor otočí o 90o vzhledem k prvnímu, neprojde skrz něj žádné světlo. V případě, že se mezi takto zkříženými hranoly nachází předmět, který má schopnost polarizovat světlo, bude vidět jako zářící v tmavém poli. Pomocí polarizačního mikroskopu lze ověřit například orientované uspořádání micel v buněčná stěna rostliny.

Polarizační mikroskopie— jedna z vysoce účinných metod morfologického výzkumu, která má široké možnosti identifikace biologických struktur, což ve spojení s dostupností a relativní jednoduchostí určuje její vysokou hodnotu. Metoda umožňuje studovat nejen histologickou strukturu preparátu, ale i některé jeho histochemické parametry. Ve 40-50 letech XX století. polarizační mikroskopie byla považována za ultrastrukturální metodu, protože umožňovala vidět ultrastrukturální schopnosti tkání.

Polarizační mikroskopie je určena ke studiu vlastností histologických struktur, které mají schopnost dvojlomu (anizotropie) - bifurkace světelného paprsku při jeho průchodu anizotropním prostředím. Světelná vlna se v anizotropním prostředí rozpadá na dvě vlny se vzájemně kolmými rovinami kmitů elektromagnetických vln. Tyto roviny se nazývají roviny polarizace. Polarizované světlo se od běžného (nepolarizovaného) světla liší tím, že v druhém jmenovaném dochází ke kmitání světelných vln v různých rovinách, zatímco v polarizovaném světle pouze v určité rovině.

Pro vytvoření efektu polarizace v polarizačním mikroskopu se používají dva polaroidy. První, který se nazývá polarizátor, je umístěn mezi iluminátor mikroskopu a histologický preparát, druhý polaroid, který se nachází mezi histologickým preparátem a okem výzkumníka, je analyzátor. Polarizátor i analyzátor jsou opticky úplně stejné polarizační filtry, takže je lze zaměnit (pokud to konstrukce mikroskopu umožňuje). Dříve se pro polarizační mikroskopii používaly hranoly Nicol, Ahrens nebo Thomson vyrobené z islandského nosníku. Tyto hranoly měly omezený úhel lomu světla. V současné době se místo toho používají ploché polarizační filtry, které produkují širokoúhlé polarizované světlo.

Relativní poloha polarizátoru a analyzátoru vzhledem k optické ose mikroskopu hraje rozhodující roli při tvorbě polarizovaného světla. Pokud jsou orientovány tak, že oba propouštějí polarizované světlo ve stejné rovině, tzn. když se jejich polarizační roviny shodují, oba polarizační filtry jsou schopny propouštět polarizované světlo; zorné pole mikroskopu je v tomto případě světlé (obr. 1a).

Rýže. 1 Preparace lidských plic ve světlém poli, OlympusCX41, objektiv 10x

Pokud jsou roviny polarizace polarizačních filtrů vzájemně kolmé (toho dosáhneme otočením analyzátoru o 90° kolem optické osy mikroskopu), pak polarizované světlo neprojde a výzkumník vidí tmavé zorné pole (obr. 2).

Když se polarizátor během jeho otáčení otočí o 360°, zorné pole se dvakrát úplně ztmaví a dvakrát se úplně rozsvítí. V minulosti se používaly Bernauerovy kompenzační filtry, u kterých má ztmavené zorné pole načervenalý odstín ( U-TP530 ). Při použití černých zrcadlových filtrů se ztmavené zorné pole nejeví úplně tmavé, ale slabě osvětlené.

Obr. 2 Preparace lidských plic v polarizovaném světle, objektiv 10x

V případech, kdy se při zkřížené poloze polarizačních filtrů (tj. u ortoskopií) setkají v dráze polarizovaného světla anizotropní látky obsažené v histologickém preparátu, tyto látky rozdělí polarizované světlo na dva paprsky se vzájemně kolmými rovinami světla. vlnové oscilace. Světelné paprsky s rovinou kmitání shodující se s rovinou polarizace procházejí analyzátorem a s kolmou jsou odříznuty, v důsledku čehož je intenzita světelného toku vstupujícího do oka výzkumníka a do kamery pouze poloviční. počátečního světelného paprsku. V důsledku popsaných procesů jsou anizotropní látky umístěné mezi dvěma zkříženými polarizátory viditelné na tmavém pozadí v podobě jasných svítících objektů. V tomto případě izotropní struktury, které nemají schopnost dvojlomu, zůstávají tmavé.

To také ovlivňuje výběr kamery pro polarizační mikroskopii. Vzhledem k tomu, že úkolem je zachytit malé světelné signály na tmavém pozadí, nemusí být kamera pro mikroskopii ve světlém poli obvykle dostačující kvůli nízké citlivosti kamery a velkému množství šumu, který vzniká při fotografování. Pro fotografování v polarizační mikroskopii potřebujete kameru pro mikroskopii s vysokou citlivostí a přesnou reprodukcí barev. Je vhodnější používat kamery založené na maticích CCD ( , VZ-CC50S), avšak v současné fázi můžete také využít možnosti rozpočtu pro kamery založené na maticích CMOS řady Sony IMX ().

Biologické tkáně obsahují dostatečné množství anizotropních struktur: prvky kontraktilního aparátu svalů, amyloid, kyselinu močovou, kolagenové útvary, některé lipidy, řadu krystalů atd.

Světelné paprsky rozštěpené v anizotropním objektu a procházející analyzátorem se vyznačují nestejnou rychlostí šíření vln. V závislosti na velikosti tohoto rozdílu (tzv velikost zpoždění světelného paprsku) az rozdílů v absorpci světla v analyzátoru může být záře anizotropních objektů bílá nebo barevná. V druhém případě hovoříme o fenoménu dichroismu ( dvojitá absorpce já). Barevné efekty ve studiu v oblasti polarizace dávají například mnoho krystalů.

Proces dvojlomu může být podpořen použitím určitých barviv, jejichž molekuly mají schopnost orientace nanesené na anizotropních strukturách. Histochemické reakce, jejichž výsledkem je efekt anizotropie, se nazývají topooptické reakce (G. Romhanyi). Existují dva typy takových reakcí – aditivní a inverzní. U aditivních reakcí se zvyšuje zpoždění světelného paprsku, které se nazývá pozitivní anizotropie, u inverzních reakcí se snižuje - negativní anizotropie.

PŘÍSTROJE A VYBAVENÍ

Polarizační mikroskopie se provádí pomocí speciálních polarizačních mikroskopů. Jako příklad můžeme jmenovat importované mikroskopy,. Většina moderních optických mikroskopů je vybavena příslušenstvím pro polarizační mikroskopii.

Pro polarizační mikroskopii lze přizpůsobit jakýkoli světelný mikroskop laboratorní a výzkumné kvality. Stačí mít dva polarizační filtry, z nichž jeden jako polarizátor je umístěn mezi zdrojem světla a preparátem a druhý, který plní roli analyzátoru, je umístěn mezi preparátem a okem výzkumníka. Polarizátor lze zabudovat do kondenzátoru nebo umístit pod něj nad clonu pole a analyzátor lze umístit do revolverové štěrbiny nebo mezivložky.

Na Obr. 3 je schematický diagram polarizačního mikroskopu. Kromě součástí společných pro všechny světelné mikroskopy má polarizační mikroskop dva polarizační filtry (polarizační, obvykle umístěný pod kondenzorem a analyzátor, umístěný v okuláru), a také kompenzátor. Analyzátor se musí nutně otáčet a k určení stupně rotace je nezbytná vhodná stupnice.

Polarizační mikroskop využívá světelný zdroj, který poskytuje vysoká hustota paprsek světla. Jako takový zdroj se doporučuje 100 W lampa s napětím 12 V. Pro některé typy výzkumu je vyžadováno monochromatické světlo. K tomuto účelu slouží kovový interferenční filtr, který je nejlépe umístěn nad zrcadlem. Matné sklo rozptylující světlo je umístěno před polarizátorem, tzn. mezi ním a zdrojem světla, ale v žádném případě za polarizátorem, protože to narušuje funkci polarizačního filtru.

V minulosti se pro polarizační mikroskopii používaly achromatické objektivy bez vnitřního napětí, ale ty jsou nyní vzácné. Dosud se v polarizačním mikroskopu používají pouze planární achromatické objektivy, které nemají vnitřní napětí. Apochromatické čočky lze použít pouze v případech, kdy je pro mikrofotografii vyžadována normální reprodukce barev.

Polarizační mikroskopy jsou vybaveny otočným objektovým stolkem, jehož polohu vzhledem k optické ose lze měnit. Úhel natočení stolu se měří pomocí stupňové stupnice vyznačené na jeho obvodu. Jedním z předpokladů zajištění efektivní aplikace polarizační mikroskopie, je pečlivé centrování rotačního stolku pomocí centrovacích šroubů.

Důležitým prvkem polarizačního mikroskopu je kompenzátor umístěný mezi objektivem a analyzátorem, obvykle v tubusu mikroskopu. Kompenzátor je deska vyrobená ze speciálních odrůd sádry, křemene nebo slídy. Umožňuje měřit rozdíl v dráze dělených světelných paprsků, vyjádřený v nanometrech. Funkčnost kompenzátoru je zajištěna jeho schopností měnit rozdíl v dráze světelných paprsků, snižovat jej na nulu nebo zvyšovat na maximum. Toho je dosaženo otáčením kompenzátoru kolem optické osy.

METODA MIKROSKOPIE V POLARIZOVANÉM SVĚTLE

Je vhodnější provádět polarizační mikroskopii v zatemněné místnosti, protože intenzita světelného toku vstupujícího do oka výzkumníka se oproti původnímu snižuje 2krát. Po zapnutí iluminátoru mikroskopu se nejprve otáčením polarizátoru nebo analyzátoru dosáhne nejjasnějšího možného osvětlení zorného pole. Tato poloha polarizačních filtrů odpovídá shodě jejich polarizačních rovin. Droga je umístěna na stole a studována nejprve ve světlém poli. Potom otáčením polarizátoru (nebo analyzátoru) se zorné pole co nejvíce ztmaví; tato poloha filtru odpovídá kolmému uspořádání rovin polarizace. Abychom odhalili efekt anizotropie, je nutné spojit rovinu polarizace anizotropního objektu s rovinou polarizovaného světla. Empiricky je toho dosaženo otáčením stolku objektu kolem optické osy. Pokud je pro polarizační mikroskopii použit světelný mikroskop, který není vybaven otočným stolkem, pak je nutné histologický preparát otočit ručně. To je přijatelné, ale v tomto případě to nelze provést určité typy polarizační mikroskopie, vyžadující kvantifikace(stanovení znaménka dvojlomu, velikosti rozdílu dráhy světelných paprsků).

Pokud jsou anizotropní objekty ve studovaném preparátu uspořádány uspořádaně (například anizotropní disky příčně pruhovaných svalových vláken), je vhodné je studovat v pevné poloze jeviště, při které tyto objekty dávají maximální záři proti tmě. Pozadí. Pokud jsou však anizotropní struktury v přípravku uspořádány náhodně (například krystaly), pak je při jejich studiu nutné neustále otáčet objektovým stolem, čímž se dosáhne záře jedné nebo druhé skupiny objektů.

Pro hlubší analýzu a vyhodnocení topooptických reakcí je nutné znát metodu stanovení relativního znaménka dvojlomu, velikosti rozdílu v dráze paprsků a indexu (koeficientu) lomu.

Znak dvojlomu charakterizuje stupeň a směr posunu světelných paprsků procházejících analyzátorem. Tento posun je způsoben topooptickými barvivy a v případě, že směřuje ke snížení rozdílu v dráze paprsků, hovoří se o negativním znaku dvojlomu ( negativní anizotropie), ale pokud přispívá ke zvýšení rozdílu v dráze paprsků, pak je zjištěn kladný znak dvojlomu ( pozitivní anizotropie). Pokud zmizí rozdíl v dráze paprsků, pak se účinek anizotropie vyrovná.

Znak dvojlomu se zjišťuje pomocí kompenzátoru. Postup při jeho aplikaci je následující. Zkoumaný objekt je umístěn do polohy, ve které je v tmavém zorném poli dosaženo maximální záře anizotropních struktur. Deska RI-kompenzátoru se otáčí kolem optické osy pod úhlem +45° vzhledem k rovině polarizace analyzátoru. Objekt v závislosti na rozdílu v dráze světelných paprsků, který se může pohybovat od 20 do 200 nm, získává buď modrou nebo žlutou barvu. V prvním případě je znak dvojlomu kladný, ve druhém záporný. Je třeba mít na paměti, že v případě, že je kompenzátor umístěn pod úhlem +45 °, má obecné pozadí ztmaveného zorného pole červený odstín.

Můžete také použít kompenzátor λ/4 (U-TP137). Postup při jeho aplikaci je stejný, pouze zorné pole má místo červeně šedý nádech a objekt svítí pozitivním znakem lomu a je ztmavený negativním.

Kvantitativní stanovení rozdílu v dráze světelných paprsků, vyjádřené v nanometrech, se provádí pomocí kompenzátoru Köhler Braque. Chcete-li to provést, použijte vzorec:

Γ=Γλ×sinφ

kde λ je konstanta nasazená na kompenzátor výrobcem, φ je úhel natočení kompenzátoru vzhledem k rovině polarizace analyzátoru.

Index lomu anizotropního objektu je určen jeho porovnáním (pod mikroskopem) s testovaným objektem umístěným poblíž. Jako zkušební objekty se používají standardní kapaliny se známým indexem lomu. Předmět a vzorek jsou umístěny vedle sebe na scéně. Pokud se jejich indexy lomu neshodují, je mezi objektem a vzorkem viditelná jasná čára, nazývaná Beckova čára. Zvednutí tubusu mikroskopu vzhledem k zaostřené poloze způsobí posun Beckovy linie směrem k médiu, což dává výraznější efekt lomu. Když se koeficienty lomu předmětu a vzorku shodují, Beckova čára zmizí. Obvykle se index lomu stanovuje v monochromatickém světle pro sodíkovou čáru spektra (při vlnové délce 589 nm a teplotě 20 °C). Lom by měl být stanoven pro dvě vzájemně kolmé roviny polarizace. Za tímto účelem se analyzátor vyjme a lom objektu se zaznamená v jeho dvou vzájemně kolmých polohách. Rozdíl mezi dvěma indexy lomu (ng - nk) charakterizuje sílu lomu.

VLASTNOSTI ZPRACOVÁNÍ MATERIÁLU A PŘÍPRAVY PŘÍPRAVKŮ

Fixace materiálu pro polarizační mikroskopii v kyselém formalínu je nežádoucí, protože formalínový pigment vznikající při interakci tkáňového hemoglobinu s kyselým formaldehydem má anizotropní vlastnosti a znesnadňuje studium preparátů v polarizovaném světle. G. Scheuner a J. Hutschenreiter (1972) doporučují pro tento účel použít 10% neutrální formalín, Bakerův kalcium-formolový roztok, Carnoyovu kapalinu.

Doba fixace v 10% neutrálním formalínu je 24-72 hodin při 4°C, v kalcium-formolovém roztoku dle Bakera - 16-24 hodin při 4°C. Fixace ve formolu vápenatém je zvláště výhodná při studiu lipid-proteinových sloučenin. Carnoyova tekutina rychle proniká tkaninou. Díly o tloušťce 1 - 2 mm se profilují po 1 hodině při teplotě 4 °C. Pro studium lipidů je fixace v Carnoyově tekutině nevhodná. Kromě toho se používá Zenkerova kapalina, zejména při impregnaci solemi zlata a stříbra. Po ošetření směsí Zenkerovy kapaliny a kyseliny octové získávají erytrocyty schopnost dvojlomu.

Při zkoumání hustých tkání (kosti, zuby) v polarizačním mikroskopu je kromě kyselého odvápnění nutné další zpracování k odstranění kolagenových vláken. Za tímto účelem se řezy takových tkání několik minut vaří ve směsi glycerolu a hydroxidu draselného (10 ml glycerolu a 2 zrnka hydroxidu draselného), dokud nejsou zcela bílé, poté se alkálie opatrně slije, řez se promyje vodou a přeneseny pomocí pinzety na stolek mikroskopu.

Pro polarizační mikroskopii se používají parafínové, zmrazené a kryostatické řezy. Neobarvené zmrazené řezy pro vyšetření polarizovaným světlem jsou uloženy v glycerolu. Nefixované kryostatické řezy jsou vhodné pro polarizační mikroskopickou analýzu ihned po přípravě. Kvůli jejich vysoké citlivosti na škodlivé účinky různé faktory prostředí se tyto řezy stále doporučuje fixovat v 10% neutrálním formalínu nebo kalcium-formolovém roztoku.

Výsledky polarizační mikroskopie jsou ovlivněny tloušťkou histologických řezů. Při studiu tlustých řezů jsou vytvořeny podmínky pro superponování různých anizotropních struktur na sebe. Navíc anizotropní vlastnosti studovaných struktur se mohou měnit při různých tloušťkách řezu, proto je velmi důležité, zejména ve srovnávacích studiích, zajistit konstantní tloušťku řezu. Doporučená maximální tloušťka řezu by neměla přesáhnout 10 µm.

Dalším předpokladem je pečlivá deparafinizace řezů, protože neodstraněné zbytky parafinu poskytují výrazný anizotropní efekt, což ztěžuje studium. Parafín setrvává zvláště dlouho na erytrocytech a buněčných jádrech. Pro úplné odstranění parafínu z řezů se doporučuje provést jejich následné zpracování.

• Xylen 30 min
• Alkohol 100% 5 min
• Směs methanolu a chloroformu (1:1) při 50 °C 24 hodin
• Alkohol 100% 5 min
• Alkohol 70% 10 min Voda

Je také třeba mít na paměti, že řezy, které jsou podrobeny polarizační mikroskopii, by neměly přijít do kontaktu s fenoly (např. nemohou být vyčištěny v karboxylové kyselině).

Více informací o polarizační mikroskopii a použití kompenzátorů lze nalézt na (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).

Máte-li jakékoli dotazy týkající se polarizační mikroskopie, kontaktujte prosím Školu mikroskopie.

Polarizační mikroskopy jsou ze všech různých přístrojů pro mikroskopování technicky nejsložitější. Taková pozornost věnovaná návrhu zařízení z hlediska vyrobitelnosti je dána potřebou získat obrázek nejvyšší kvalita, který je přímo ovlivněn konstrukcí optické a osvětlovací části mikroskopu. Hlavní oblastí použití polarizačních přístrojů pro mikroskopii je studium minerálů, krystalů, strusek, anizotropních předmětů, textilních a žáruvzdorných výrobků, jakož i dalších materiálů, které se vyznačují tzv. dvojlom. Posledně jmenovaný princip je základem pro tvorbu obrazu u takových přístrojů pro mikroskopii, ve kterých je studovaný vzorek ozařován polarizačními paprsky. V tomto případě se anizotropní vlastnosti vzorků projeví po změně směru paprsku. Pro tyto účely jsou polarizační mikroskopy navrženy s filtry pole otáčejícími se v různých rovinách vůči sobě navzájem: analyzátor se otáčí o 180 stupňů a polarizátor se otáčí o 360. jiné typy mikroskopů.

Studium vzorku pod polarizačním mikroskopem začíná instalací polarizátoru do osvětlovací části mikroskopu pod kondenzorem, vedle aperturní clony. Současně je analyzátor umístěn mezi okulárem a čočkou - za ní podél dráhy světelných paprsků. Při správném nastavení takového přístroje pro mikroskopii bude po protnutí filtračních polí viditelné pole rovnoměrně tmavé, tvořící tzv. extinkční efekt. Po dokončení nastavení zařízení se zkušební vzorek upevní na stolek a provede se jeho studie. Stolky polarizačních mikroskopů jsou vystředěny vzhledem k optické ose a lze je otáčet o 360 stupňů a v podobných zařízeních pro laboratorní a výzkumné účely mají i nonius. Optika a osvětlovací systém polarizačních mikroskopů jsou nejvyšší kvality a tak přesné výroby, která umožňuje získat nejčistší obraz bez zkreslení. Sada zařízení pro studium vzorků v polarizovaném světle často obsahuje kompenzátor a Bertrandovu čočku. První z nich umožňuje efektivně studovat strukturu minerálů a čočky - zvětšit a zaostřit oblast pozorování, když se po otočení jeviště objeví změny v obrazu. Dnes jsou na trhu tři hlavní typy takových přístrojů pro mikroskopii - jde o již zmíněné výzkumné a laboratorní a také pracovní polarizační mikroskop.

E. Mikroskopie v temném poli.

18. Mikroskop se skládá z optické a mechanické části. Co jsou optické části?

A. Tubus, okulár, kondenzor

B. Revolver, makro a mikro šroub, zrcadlo

C. Revolver, okulár

D. Okulár, kondenzor, objektiv

E. Tubus, okulár, revolver

19. Při použití ultrafialových paprsků jako zdroje světla se zvyšuje rozlišovací schopnost mikroskopu. Jaké mikroskopické přístroje používají tento zdroj světla?

A. Tmavé pole a fluorescenční

B. Fluorescenční, ultrafialové

C. Světelné a elektronické

D. Fázový kontrast, ultrafialový

E.Polarizační, ultrafialové

20. Mikroskop se skládá z mechanické a optické části. Jaká část mikroskopu má clonu?

A. Okulár a čočka

B. Okulár a kondenzor

C. Tubus a okulár

D. Objektiv a kondenzor

E. Tubus, čočka, okulár

21. V experimentu byly použity živé předměty, u kterých je nutné určit řadu chemické složky pomocí vitálního pozorování. Jaká mikroskopická vyšetřovací metoda bude použita?

A. Fázová kontrastní mikroskopie

B. Elektronová mikroskopie

C. Fluorescenční mikroskopie

E Mikroskopie v temném poli.

22. K histologickému vyšetření buněk byly použity fosfory. Jaký typ mikroskopie byl v tomto případě použit?

A. Světelná mikroskopie

B. Elektronová mikroskopie

C. Fluorescenční mikroskopie

E. Polarizační mikroskopie

E. Mikroskopie v temném poli.

23. Badatel má za úkol získat prostorová reprezentace o strukturách zkoumaného objektu. S jakým mikroskopickým přístrojem bude specialista pracovat?

A. Ultrafialová mikroskopie,

B. Fázová kontrastní mikroskopie,

C. Transmisní elektronová mikroskopie,

D. Rastrovací elektronová mikroskopie,

E. Polarizační mikroskopie

24. Jako zdroj světla se používají rtuťové křemenné výbojky. Jaká je rozlišovací schopnost mikroskopu s tímto světelným zdrojem?

25. Rozlišení mikroskopu závisí na vlnové délce světelného zdroje. Jaká je rozlišovací schopnost světelného mikroskopu?

26. Před zahájením studia histologického preparátu je nutné rovnoměrně osvětlit zorné pole. Jaké části mikroskopu se k tomu používají?

A. Mikro- a makrovit

B. Kondenzátor a zrcadlo

C. Trubka a držák trubice

D. Tubus a okulár

27. Výzkumník měl za úkol studovat ultramikroskopickou strukturu plazmolemy erytrocytů. Jaký mikroskopický přístroj bude použit?

A. Světlo

B. Fázový kontrast

C. Elektronické

D. Polarizační

E. Ultrafialové

28. Při studiu tkáně kosterního svalstva je nutné určit izo- a anizotropní struktury tkáně. Jaký typ mikroskopie bude použit?

A. Světlo

B. Fázový kontrast

C. Elektronické

D. Polarizační

E. Ultramikroskopické

29. Rozlišení fluorescenčního mikroskopu závisí na vlnové délce světelného zdroje. čemu se to rovná?

A. 0,1 um C. 0,4 um

H. 0,2 um D. 0,1 nm

30. V klinické laboratoři se ke studiu obecného krevního testu používá mikroskopické vyšetření. Jaký mikroskop je k tomu potřeba?

A. Světlo,

B. Fázový kontrast,

C. Elektronické,

D. Polarizační,

E. Ultrafialové.

31. K výzkumu je předložen živý objekt s přirozenou luminiscencí. Jaký typ mikroskopie by měl být v této studii použit?

A. Světlo

B. Fázový kontrast

C. Elektronické

D. Polarizační

E. Ultrafialové

32. Jako výsledek biopsie byl získán materiál nádorových buněk. Je nutné studovat jejich ultramikroskopickou strukturu. Jaký typ mikroskopie se v této studii používá?

A. Světlo

B. Fázový kontrast

C. Elektronické

D. Polarizační

E. Ultrafialové

TÉMA 2: HISTOLOGICKÁ TECHNIKA

Základní principy přípravy preparátů pro světelnou a elektronovou mikroskopii, odběr materiálu (biopsie, jehlová biopsie, pitva). Fixace, dehydratace, zhutňování předmětů, příprava řezů na mikrotomech a ultramikrotomech. Druhy mipreparací - řez, stěr, otisk, filmy, tenký řez. Barvící a kontrastní přípravky. Koncept histologických skvrn.

Mikroskopická technika.

Hlavní fáze cytologické a histologické analýzy:

Volba předmětu studia

Příprava na vyšetření pod mikroskopem

Aplikace mikroskopických metod

Kvalitativní a kvantitativní analýza získaných snímků

Metody používané v histologické technice:

1. Životnost.

2. Posmrtný.

I CELOŽIVOTNÍ METODY

Smyslem celoživotního výzkumu je získat informace o životě buňky: pohyb, dělení, růst, diferenciace, buněčná interakce, délka života, destrukce, reaktivní změny pod vlivem různých faktorů.

Studium živých buněk a tkání je možné mimo tělo (in vitro) nebo uvnitř těla (in vivo).

A. Studium živých buněk a tkání v kultuře (in vitro) –

Kultivační metoda

Rozlišují se: a) suspenzní kultury (buňky suspendované v živném médiu), b) tkáňové, c) orgánové, d) jednovrstvé.

Metoda kultivace tkáně mimo tělo je nejčastější. Tkáň lze kultivovat ve speciálních průhledných hermeticky uzavřených komorách. Za sterilních podmínek se do komory umístí kapka živného média. Nejlepší živnou půdou je krevní plazma, do které se přidává embryonální extrakt (extrakt z tkání embrya, obsahující velké množství látek stimulujících růst). Tam se také umístí kousek orgánu nebo tkáně (ne více než 1 mm3), který se musí kultivovat.

Kultivovaná tkáň by měla být udržována při tělesné teplotě organismu, jehož tkáň byla odebrána k výzkumu. Protože kultivační médium rychle se stává nepoužitelným (hromadí produkty rozpadu uvolněné kultivovanou tkání), pak je třeba každých 3-5 dní vyměnit.

Použití kultivační metody umožnilo odhalit řadu vzorců diferenciace, maligní transformace buněk, interakcí buněk mezi sebou, ale i s viry a mikroby. Kultivace embryonálních tkání umožnila studovat vývoj kostí, chrupavek, kůže atd.

Kultivační metoda je zvláště důležitá pro provádění experimentálních pozorování na lidských buňkách a tkáních, zejména pro určení pohlaví, maligní degenerace, dědičných chorob atd.

Nevýhody metody:

1. Hlavní nevýhodou této metody je, že tkáň nebo orgán se vyšetřují izolovaně od těla. Bez prožívání neurohumorálního vlivu těla ztrácí tělo svou vlastní diferenciaci.

2. Potřeba častých transplantací (s dlouhodobou kultivací).

3. Stejný koeficient lomu tkání.

Podobné informace.