Sõnastik:

• Polariseeritud valgus on valguslained, mis vibreerivad ühes suunas.

• Valguslaine on elektri- ja magnetkiirgus, mille võnketasand on laine levimistasandiga risti.
• Polarisaator (Nicol I) on seade, mis laseb läbi ainult täielikult või osaliselt polariseeritud valguse. Mõeldud polariseeritud valguse edastamiseks uuritavale läbipaistvale objektile (läbi) ja polariseerimata valguse (loodusliku valguse, tehisvalguse, sh mikroskoobi illuminaatori kiirguse) katkestamiseks (hajutamiseks). Polarisaatorit läbiva valguse intensiivsus langeb võrdeliselt polarisaatori ja analüsaatori polarisatsioonitasandite vahelise nurga koosinuse ruuduga (Maluse seadus):

Kus: I on intensiivsus enne polarisaatori läbimist, I on valguse intensiivsus pärast polarisaatori läbimist, φ on nurk polariseeritud valguse polarisatsioonitasandite ja polarisaatori vahel.

• Analüsaator (Nicol II) - seade, mis sarnaneb polarisaatoriga, kuid on mõeldud polariseeritud valguse analüüsimiseks.

Analüsaatori pööramine polarisaatori suhtes nurga ϕ võrra. Valguse intensiivsust näitab punane nool.

• Kompensaator on seade määramiseks kvantitatiivsed omadused polarisatsioon. Muudab suure kontrastsusega nähtava pildi värviliseks kujutiseks, nõrgendades valges valguses teatud lainepikkusi.
• Lineaarselt polariseeritud valgus on valgus, mille võnketasand on piiratud ühes suunas ja levib ühes tasapinnas.
• Valguslainete võnkumiste faas on matemaatilisest vaatepunktist valguslainefunktsiooni argument, st ωt+φ 0 funktsioonis sin(ωt+φ 0). Füüsiliselt on see teatud elektromagnetiline olek teatud ajahetkel.

• Lainepikkus on kaugus kahe lähima punkti vahel, mis on samas faasis.

• Peegeldus on laine suuna muutus. Täielik peegeldus nimetatakse laine murdumisnurga muutuseks alla 90 °.

• Murdumine on laine suuna muutumine kahe keskkonna piiril. Kahekordne murdumine on ühe valguskiire jagamine anisotroopses keskkonnas kaheks kiireks.

Joonis 4 - Kiirte murdumine Islandi sparni kristallis.

• Dikroism on valguse osaline neeldumine aine poolt, olenevalt selle polarisatsioonist.

• Häired on valguse intensiivsuse muutus, kui kaks või enam valguslainet on üksteise peale asetatud.

• Valguskiirte teekonna erinevus on väärtus, mis iseloomustab valguse kiiruse aeglustumist läbipaistva aine läbimisel. Teede erinevust mõõdetakse vahemaaga, mille valgus läbib vaakumis sama aja jooksul, mis on vajalik uuritavas aines läbimiseks uuritavates ruumipunktides.

• Konoskoopia on meetod anisotroopsete objektide optiliste omaduste uurimiseks polariseeritud valguse koonduvates kiirtes. Konoskoopia ajal jälgitakse analüsaatori pööramisel interferentsi mustri muutusi. Analüsaatorit ja polarisaatorit teineteise suhtes pöörates jälgib uurija mikroskoobis konoskoopilisi kujundeid, mis koosnevad isogüüridest (need on tumedad ribad, mis vastavad valguslainete võnkesuunale polarisaatoris) ja isokroomidest (need on erineva interferentsivärvi ribad mis vastavad sama teevahega kristallis olevate kiirte suundadele).

• Ortoskoopia on meetod anisotroopsete objektide optiliste omaduste uurimiseks paralleelsetes polariseeritud valguskiirtes.

• Pleokroism on mõnede anisotroopsete objektide vaadeldava värvuse muutus koos vaatenurga muutumisega (kristallide värvuse muutumine laua pööramisel).

Polariseeriv mikroskoop on mikroskoop, mis on loodud anisotroopset keskkonda läbiva polariseeritud valguse kaksikmurdumise uurimiseks.

Esimese polariseeriva mikroskoobi kujundas 1863. aastal Henry Clifton Sorby ja see erines meile harjumuspärasest optilisest mikroskoobist kahe optilisele teele paigaldatud Nicoli prisma poolest. Nicoli prisma laseb valgust läbi iseenda ainult ühes suunas ja ühes tasapinnas ehk tasapinnaliselt polariseeritud valgust, ülejäänud valgus, mis neisse prismadesse siseneb, peegeldub täielikult ja hajub. Need prismad ei erine struktuurilt üksteisest ja toimivad polarisaatoritena (analüsaatorina ja polarisaatorina). Kui analüsaatori polarisatsioonitasapinda pööratakse polarisaatori polarisatsioonitasandi suhtes 90º, jälgib uurija kaksikmurdva objekti polarisatsioonimustrit ja kõik objektid, millel kaksikmurduvust ei ole, tumenevad. Kaasaegsetes mikroskoopides saada rohkem Infoks DIC-prismad (reljeefi kombineerimine polarisatsioonimustriga, värvimata proovide uurimiseks), kompensaatorid (kvantitatiivseks polarisatsiooniks), ümarlaud (pleokroismi uurimiseks) ja lihtsad polaroidid lihtsate vaatluste jaoks (näiteks bioloogias ja meditsiinis) saab kasutada.

Polarisatsiooni kasutatakse kõige sagedamini kristallograafiamikroskoopides, kus anisotroopsete objektide omadusi saab määrata konoskoopia ja ortoskoopia abil. Pöörake tähelepanu konoskoopia ja ortoskoopia sarnasustele ja erinevustele: valguskiir läbib polarisaatorit (1), on piiratud ava diafragmaga (2), läbib kondensaatorläätsi (3); analüsaator (mis pöörab uurijat) (8) ja kompensaatorid (7).

Joonis 1 – polariseeriva mikroskoobi skeem: a) ortoskoopia b) konoskoopia

Legend: 1 - polarisaator, 2,6 - membraanid; 3 - kondensaator; 4 - ettevalmistus; 5 - objektiiv; 7 - kompensaator; 8 - analüsaator; 9 - Bertrandi objektiiv; 10 - okulaari fokaaltasand; 11 - okulaar.

Vaadeldav pilt koosneb konoskoopilistest kujunditest. konoskoopilised figuurid - koosnevad isogüüridest (need on tumedad sirged või kumerad triibud, milles vibratsiooni suunad on paralleelsed nikolide põhilõikudega) ja isokroomidest (need on erineva interferentsivärviga maalitud triibud. Iga riba vastab nikoliidi suundadele kaksikmurdmise käigus tekkinud kiired, millel on sama teevahe).

Toome näite: optilise teljega risti lõigatud üheteljelise kristalli plaatidel näeme ristikujulist isogüüri ja kontsentrilisi isokroomrõngaid, vt joonis fig. 5.

Joonis 5 - A) Üheteljelise kaltsiitmineraali konoskoopilised kujundid B) sisestatud kompensaatoriga kaheteljeline flogopiitmineraal.

Saadud interferentsmustri olemuse järgi mõõdetakse kaksikmurde väärtust, polarisatsioonitasandi pöördenurki, ekstinktsiooninurki, optiliste telgede arvu ja muid karakteristikuid. Kõik need omadused teevad selgeks, millist kristalli uurija vaatleb, selle struktuuri. Mikroskoobid, nagu BX53P ja H600P, on loodud mineraloogia ja kristallograafia jaoks. Need on varustatud parima pingevaba optika ja kaasaegsetel seadmetel valmistatud kompensaatoritega, mis kõrvaldavad mikroskoobi paigaldamisel lõtku ja lüngad.

Kahmsusmurdmist ei kasutata mitte ainult kristallograafias, vaid ka meditsiinis, bioloogias, kohtuekspertiisis ja metallograafias, sest teadlaste jaoks on oluline kiiresti ja täpselt eraldada vitamiinid, happed, mineraalid, pinged isotroopsetes objektides, mittemetallilised kandmised algproovis, ja teised. Näiteks histoloogia ja tsütoloogia mikroskoobid on varustatud polarisaatoritega, et tuvastada mitmesuguseid objekte. Ümmargused objektid, mille läbimõõt on umbes 2,4 mikronit, lipoidid ja tilgad, ristuvate polarisaatoritega moodustavad Malta risti interferentsmustri. Kõigil ainetel pole samasuguseid murdumisomadusi erinevad temperatuurid, seega võib näiteks eristada 1) aineid, mis jahutamisel omandavad anisotroopsed omadused ja kaotavad need kuumutamisel: kolesterool ja selle estrid 2) ei kaota kuumutamisel oma anisotroopseid omadusi: tserebrosiidid, fosfatiidid, müeliinid. Selline omaduste varieeruvus on tingitud aine võimest säilitada kristallilist struktuuri, tk. See põhjustab kaksikmurdumise. Vaadeldes anisotroopseid objekte polarisatsioonimikroskoobis ja määrates nende kontsentratsiooni, saab ristuvate polarisaatoritega lipiidide sära järgi diagnoosida selliseid haigusi nagu: artriit, ateroskleroos, lipoiduria, tsilinuuria ja lipidoos, samuti podagra, urolitiaas, selikoos ja asbest karbamiid, ränidioksiid ja asbestkiud. Histoloogia ja tsütoloogia jaoks on välja töötatud mikroskoop BX46, mis on varustatud madala staadiumi, võimsa illuminaatori ja reguleeritava kõrgusega toruga, mis säästab teadlase selja äravoolust.

Polariseeritud valguses isotroopsetest objektidest erinev värvus on: tärklis, tselluloos, mõned happed, C-vitamiin, seetõttu tuleks polarisaatoritega varustada ka farmakoloogia ja farmaatsia mikroskoobid. Farmakoloogiline mikroskoop hõlmab nii CX43 kui ka BX43 ja muid mudeleid, sest iga aastaga on selle valdkonna uuringuid järjest rohkem ja uued uurimisobjektid nõuavad teistsugust lähenemist.

Kohtuekspertiisis on oluline eristada kvartsi ja muude mineraalide terakesi orgaanilistest ja muudest materjalidest, mida võib kuriteopaigal leida, mistõttu peab mikroskoop olema varustatud peegeldunud valgusega, et näha ka läbipaistmatuid objekte. BX53M mikroskoop sobib kohtuekspertiisi jaoks, kuna see on varustatud mitte ainult võimsa läbiva valguse allikaga, vaid ka sama võimsa peegeldunud valguse valgustiga ning mikroskoobi töökaugust suurendavad lisad võimaldavad teil uurida väga suuri objekte. ilma pikema eelneva ettevalmistuseta.

Polariseerivaid mikroskoope kasutatakse ka metallograafias, kuid selliste uuringute jaoks piisab, kui on teada anisotroopsete objektide olemasolu või puudumine, samuti nende ruumiline jaotus. Just selliste objektide klassifitseerimiseks ja loendamiseks saab metallograafias kasutada VHX6000, BX53P mikroskoope, millele on paigaldatud Stream.

Faaskontrastmikroskoopia meetod

Enamik rakulisi struktuure erinevad vähe valguse murdumisnäitaja, üksteisest lähtuvate kiirte neeldumise ja keskkonna poolest. Selliste komponentide uurimiseks tuleb muuta valgustust (koos pildi selguse kadumisega) või kasutada spetsiaalseid meetodeid ja seadmeid. Üks selline meetod on faasikontrastmikroskoopia. Seda kasutatakse laialdaselt rakkude elutähtsas uurimises. Meetodi olemus seisneb selles, et isegi väga väikeste erinevuste korral ravimi erinevate elementide murdumisnäitajates läbib neid läbiv valguslaine erinevaid faasimuutusi. Need faasimuutused, mis ei ole otseselt silmale ega fotoplaadile nähtamatud, muundatakse spetsiaalse optilise seadmega valguslaine amplituudi muutusteks, st heleduse muutusteks, mis on juba silmaga nähtavad või salvestatud pildile. valgustundlik kiht. Saadud nähtaval pildil reprodutseerib heleduse (amplituudide) jaotus faasireljeefi. Saadud pilti nimetatakse faasikontrastiks. Objektid võivad tunduda heledal taustal tumedad (positiivne faasikontrast) või heledad tumedal taustal (negatiivne faasikontrast).

Häirekontrastsuse meetod (interferentsmikroskoopia)

Häirekontrastsuse meetod on sarnane eelmisele - mõlemad põhinevad mikroosakest läbinud ja seda läbinud kiirte interferentsil. Illuminaatorist lähtuv paralleelsete valguskiirte kiir jaguneb kaheks vooluks, sisenedes mikroskoopi. Üks saadud kiirtest suunatakse läbi vaadeldava osakese ja omandab muutused võnkefaasis, teine ​​- mööda objektist mööda sama või täiendavat mikroskoobi optilist haru. Mikroskoobi okulaarses osas ühenduvad mõlemad kiired uuesti ja segavad üksteist. Häire tulemusena ehitatakse üles pilt, millel erineva paksuse või erineva tihedusega raku lõigud kontrasti poolest üksteisest erinevad. Interferentskontrastmeetodit kasutatakse sageli koos teiste mikroskoopiameetoditega, eriti polariseeritud valguses vaatlemisega. Selle kasutamine koos ultraviolettmikroskoopiaga võimaldab näiteks sisu määrata nukleiinhapped objekti kogu kuivmassis.

Polariseeriv mikroskoopia

Polariseeriv mikroskoopia on meetod polariseeritud valguses objektide vaatlemiseks, millel on isotroopsus, s.t. submikroskoopiliste osakeste järjestatud orientatsioon. Polariseeriva mikroskoobi kondensaatori ette asetatakse polarisaator, mis edastab teatud polarisatsioonitasandiga valguslaineid. Peale preparaadi ja läätse paigaldamist asetatakse analüsaator, mis suudab edastada sama polarisatsioonitasandiga valgust. Kui seejärel analüsaatorit esimese suhtes 90o pöörata, siis valgus läbi ei lähe. Juhul, kui selliste ristatud prismade vahel on objekt, millel on võime valgust polariseerida, nähakse seda pimedas väljas helendavana. Polariseeriva mikroskoobi abil saab kontrollida näiteks mitsellide orienteeritud paigutust raku sein taimed.

Polariseeriv mikroskoopia— üks ülitõhusaid morfoloogilise uurimistöö meetodeid, millel on laialdased võimalused bioloogiliste struktuuride tuvastamiseks, mis koos ligipääsetavuse ja suhtelise lihtsusega määrab selle kõrge väärtuse. Meetod võimaldab uurida mitte ainult preparaadi histoloogilist struktuuri, vaid ka mõningaid selle histokeemilisi parameetreid. XX sajandi 40-50ndatel. polarisatsioonimikroskoopiat peeti ultrastruktuurseks meetodiks, kuna see võimaldas näha kudede ultrastruktuurseid võimeid.

Polarisatsioonimikroskoopia eesmärk on uurida histoloogiliste struktuuride omadusi, millel on kahemurde (anisotroopia) võime - valguskiire hargnemine, kui see läbib anisotroopset keskkonda. Valguslaine anisotroopses keskkonnas laguneb kaheks laineks, mille elektromagnetlainete võnketasandid on üksteisega risti. Neid tasapindu nimetatakse polarisatsioonitasanditeks. Polariseeritud valgus erineb tavalisest (polariseerimata) valgusest selle poolest, et viimases toimuvad valguslainete võnked eri tasanditel, polariseeritud valguses aga ainult teatud tasapinnal.

Polariseerivas mikroskoobis polarisatsiooniefekti tekitamiseks kasutatakse kahte polaroidi. Esimene, mida nimetatakse polarisaatoriks, asetatakse mikroskoobi illuminaatori ja histoloogilise preparaadi vahele.Teine polaroid, mis asub histoloogilise preparaadi ja uurija silma vahel, on analüsaator. Nii polarisaator kui analüsaator on optiliselt täpselt samad polariseerivad filtrid, seega saab neid omavahel vahetada (kui mikroskoobi konstruktsioon seda võimaldab). Varem kasutati polariseerivaks mikroskoopiaks Islandi sparest valmistatud Nicoli, Ahrensi või Thomsoni prismasid. Nendel prismadel oli piiratud valguse murdumisnurk. Praegu kasutatakse selle asemel lamedaid polariseerivaid filtreid, mis toodavad laia väljaga polariseeritud valgust.

Polariseerija ja analüsaatori suhteline asend mikroskoobi optilise telje suhtes mängib polariseeritud valguse loomisel otsustavat rolli. Kui need on orienteeritud nii, et mõlemad lasevad polariseeritud valgust läbi samas tasapinnas, s.t. kui nende polarisatsioonitasandid langevad kokku, on mõlemad polarisatsioonifiltrid võimelised edastama polariseeritud valgust; mikroskoobi vaateväli on sel juhul hele (joonis 1a).

Riis. 1 Inimese kopsude ettevalmistus eredas väljas, OlympusCX41, 10x objektiiv

Kui polariseerivate filtrite polarisatsioonitasandid on üksteisega risti (see saavutatakse analüsaatori pööramisega 90° ümber mikroskoobi optilise telje), siis polariseeritud valgus ei lähe läbi ja uurija näeb tumedat vaatevälja (joonis 1). . 2).

Kui polarisaatorit selle pöörlemise ajal 360° pöörata, tumeneb vaateväli kaks korda täielikult ja kaks korda täielikult valgustatud. Varem on kasutatud Bernaueri kompenseerivaid filtreid, milles tumenenud vaateväli on punaka varjundiga ( U-TP530 ). Kui rakendatakse mustad spekulaarsed filtrid, ei tundu pimendatud vaateväli täiesti tume, vaid nõrgalt valgustatud.

Joonis 2 Inimese kopsude ettevalmistus polariseeritud valguses, 10x objektiiv

Juhtudel, kui polariseerivate filtrite ristasendiga (st ortoskoopiates) kohtab polariseeritud valguse teel histoloogilises proovis sisalduvaid anisotroopseid aineid, jagavad need ained polariseeritud valguse kaheks vastastikku risti asetsevate valgustasapindadega kiireks. laine võnkumised. Polarisatsioonitasandiga ühtiva võnketasandiga valguskiired läbivad analüsaatorit ja risti olevaga lõigatakse need ära, mille tulemusena on uurija silma ja kaamerasse siseneva valgusvoo intensiivsus vaid pool intensiivsusest. esialgsest valgusvihust. Kirjeldatud protsesside tulemusena on kahe ristatud polarisaatori vahel paiknevad anisotroopsed ained tumedal taustal nähtavad eredate helendavate objektide kujul. Sel juhul jäävad isotroopsed struktuurid, millel puudub kaksikmurdevõime, tumedaks.

See mõjutab ka valikut polariseeriva mikroskoopia kaamerad. Kuna ülesandeks on jäädvustada väikseid valgussignaale tumedal taustal, ei pruugi ereda väljaga mikroskoopia kaamerast tavaliselt piisata kaamera madala tundlikkuse ja pildistamisel tekkiva suure müra tõttu. Polariseeriva mikroskoopiaga pildistamiseks vajate mikroskoopia jaoks suure tundlikkusega ja täpse värviesitusega kaamerat. Eelistatav on kasutada CCD-maatriksitel ( , VZ-CC50S) põhinevaid kaameraid, kuid praeguses etapis saab kasutada ka Sony IMX-seeria CMOS-maatriksitel ( ) põhinevate kaamerate eelarvevalikuid.

Bioloogilised koed sisaldavad piisaval hulgal anisotroopseid struktuure: lihaste kontraktiilse aparatuuri elemente, amüloidi, kusihapet, kollageeni moodustisi, mõningaid lipiide, mitmeid kristalle jne.

Anisotroopses objektis lõhestunud ja analüsaatorit läbivaid valguskiiri iseloomustab laine ebavõrdne levimiskiirus. Sõltuvalt selle erinevuse suurusest (seda nimetatakse ka valgusvihu viivituse suurus) ja analüsaatori valguse neeldumise erinevuste tõttu võib anisotroopsete objektide kuma olla valge või värviline. Viimasel juhul räägime dikroismi fenomenist ( kahekordne imendumine I). Värviefektid uuringus polarisatsiooni valdkonnas annavad näiteks palju kristalle.

Kahekordse murdumise protsessi saab tõhustada teatud värvainete kasutamisega, mille molekulidel on anisotroopsetele struktuuridele ladestunud võime orienteeruda. Histokeemilisi reaktsioone, mille tulemuseks on anisotroopia mõju, nimetatakse topooptiliseks reaktsiooniks (G. Romhanyi). Selliseid reaktsioone on kahte tüüpi – aditiivsed ja pöördreaktsioonid. Aditiivsete reaktsioonide korral suureneb valguskiire viivitus, mida nimetatakse positiivseks anisotroopiaks, pöördreaktsioonide korral see väheneb - negatiivne anisotroopia.

SEADMED JA SEADMED

Polariseeriv mikroskoopia viiakse läbi spetsiaalsete polariseerivate mikroskoopide abil. Näitena võime nimetada imporditud mikroskoobid,. Enamik kaasaegseid optilisi mikroskoope on varustatud polariseeriva mikroskoopia tarvikutega.

Polariseeriva mikroskoopia jaoks saab kohandada mis tahes labori- ja uurimiskvaliteediga valgusmikroskoopi. Piisab kahest polariseerivast filtrist, millest üks, mis toimib polarisaatorina, asetatakse valgusallika ja proovi vahele ning teine, mis täidab analüsaatori rolli, asetatakse proovi ja uurija silma vahele. Polarisaatori saab sisse ehitada kondensaatorisse või asetada selle alla välja diafragma kohale ning analüsaatori võib asetada revolvri pessa või vahesisendisse.

Joonisel fig. 3 on polariseeriva mikroskoobi skemaatiline diagramm. Lisaks kõikidele valgusmikroskoopidele ühistele komponentidele on polarisatsioonimikroskoobis kaks polariseerivat filtrit (polarisaator, mis tavaliselt asetatakse kondensaatori alla, ja analüsaator, mis asub okulaaris) ning kompensaator. Analüsaator peab tingimata pöörlema ​​ja pöörlemisastme määramiseks on vajalik asjakohane gradueeritud skaala.

Polariseeriv mikroskoop kasutab valgusallikat, mis annab kõrge tihedusega valguskiir. Sellise allikana on soovitatav kasutada 100 W lampi pingega 12 V. Teatud tüüpi uuringute jaoks on vaja monokromaatilist valgust. Sel eesmärgil kasutatakse metallist interferentsifiltrit, mis on kõige parem asetada peegli kohale. Valgust hajutav mattklaas asetatakse polarisaatori ette, st. selle ja valgusallika vahel, kuid mitte mingil juhul pärast polarisaatorit, kuna see rikub polariseeriva filtri funktsiooni.

Varem kasutati polariseeriva mikroskoopia jaoks ilma sisepingeteta akromaatilisi objektiive, kuid nüüd on need haruldased. Praeguseks on polariseerivas mikroskoobis kasutusel ainult plaaniakromaatilised objektiivid, millel puuduvad sisepinged. Apokromaatilisi läätsi saab kasutada ainult juhtudel, kui mikrofotograafia jaoks on vajalik normaalne värvide taasesitamine.

Polariseerivad mikroskoobid on varustatud pöörleva objekti staadiumiga, mille asendit optilise telje suhtes saab muuta. Laua pöördenurka mõõdetakse selle ümbermõõdule märgitud kraadiskaala abil. Üks tagamise eeldusi tõhus rakendus polariseeriv mikroskoopia on pöörleva etapi hoolikas tsentreerimine tsentreerimiskruvide abil.

Polariseeriva mikroskoobi oluline element on objektiivi ja analüsaatori vahele paigutatud kompensaator, tavaliselt mikroskoobi torus. Kompensaator on spetsiaalsetest kipsist, kvartsist või vilgukivist valmistatud plaat. See võimaldab mõõta erinevust jagatud valguskiirte teekonnas, väljendatuna nanomeetrites. Kompensaatori toimimise tagab selle võime muuta valguskiirte teekonna erinevust, vähendades seda nullini või suurendades seda maksimumini. See saavutatakse kompensaatori pööramisega ümber optilise telje.

MIKROSKOPIA MEETOD POLARISEERITUD VALGUSES

Polarisatsioonimikroskoopiat on mugavam teha pimendatud ruumis, kuna uurija silma siseneva valgusvoo intensiivsus väheneb algse omaga võrreldes 2 korda. Pärast mikroskoobi illuminaatori sisselülitamist saavutatakse esmalt polarisaatori või analüsaatori pööramisega võimalikult ereda vaatevälja valgustus. See polariseerivate filtrite asend vastab nende polarisatsioonitasandite kokkulangevusele. Ravim asetatakse objektilauale ja uuritakse kõigepealt heledal väljal. Seejärel polarisaatorit (või analüsaatorit) pöörates tumeneb vaateväli nii palju kui võimalik; see filtri asend vastab polarisatsioonitasandite risti asetsemisele. Anisotroopia mõju paljastamiseks on vaja ühendada anisotroopse objekti polarisatsioonitasand polariseeritud valguse tasandiga. Empiiriliselt saavutatakse see objekti staadiumi pööramisega ümber optilise telje. Kui polariseerivaks mikroskoopiaks kasutatakse valgusmikroskoopi, mis ei ole varustatud pöörleva astmega, siis on vaja histoloogilist proovi käsitsi pöörata. See on vastuvõetav, kuid sel juhul on seda võimatu teostada teatud tüübid polariseeriv mikroskoopia, mis nõuab kvantifitseerimine(kaksikmurdemärgi määramine, valguskiirte teekonna erinevuse suurus).

Kui uuritavas preparaadis on anisotroopsed objektid paigutatud korrapäraselt (näiteks vöötlihaskiudude anisotroopsed kettad), on mugav neid uurida lava fikseeritud asendis, kus need objektid annavad maksimaalse sära pimeda vastu. taustal. Kui aga anisotroopsed struktuurid asetsevad preparaadis juhuslikult (näiteks kristallid), siis nende uurimise ajal on vaja objektitabelit pidevalt pöörata, saavutades ühe või teise objektirühma kuma.

Topooptiliste reaktsioonide põhjalikumaks analüüsiks ja hindamiseks on vaja teada kaksikmurde suhtelise märgi, kiirte teekonna erinevuse suuruse ja murdumisnäitaja (koefitsiendi) määramise meetodit.

Kahemurduvuse märk iseloomustab analüsaatorit läbivate valguskiirte nihke astet ja suunda. Seda nihet põhjustavad topooptilised värvained ja juhul, kui see on suunatud kiirte teekonna erinevuse vähenemisele, räägitakse kahekordse murdumise negatiivsest märgist ( negatiivne anisotroopia), kuid kui see aitab kaasa kiirte teekonna erinevuse suurenemisele, siis tuvastatakse kaksikmurdumise positiivne märk ( positiivne anisotroopia). Kui kiirte teekonna erinevus kaob, tasandatakse anisotroopia mõju.

Kahekordse murdumise märk määratakse kompensaatori abil. Selle kohaldamise kord on järgmine. Uuritav objekt asetatakse asendisse, kus pimedas vaateväljas saavutatakse anisotroopsete struktuuride maksimaalne kuma. RI-kompensaatori plaati pööratakse ümber optilise telje analüsaatori polarisatsioonitasandi suhtes +45° nurga all. Objekt omandab olenevalt valguskiirte teekonna erinevusest, mis võib ulatuda 20–200 nm, kas sinise või kollase värvi. Esimesel juhul on kaksikmurdumise märk positiivne, teisel negatiivne. Tuleb meeles pidada, et juhul, kui kompensaator asub +45° nurga all, on tumendatud vaatevälja üldine taust punane.

Võite kasutada ka λ/4 kompensaatorit (U-TP137). Selle pealekandmise protseduur on sama, ainult vaateväljal on punase asemel hall toon ja objekt helendab positiivse murdumismärgiga ja on negatiivsega tumenenud.

Valguskiirte teekonna erinevuse kvantitatiivne määramine, väljendatuna nanomeetrites, tehakse Köhler Braque kompensaatori abil. Selleks kasutage valemit:

Γ=Γλ×sinφ

kus λ on tootja poolt kompensaatorile pandud konstant, φ on kompensaatori pöördenurk analüsaatori polarisatsioonitasandi suhtes.

Anisotroopse objekti murdumisnäitaja määratakse, võrreldes seda (mikroskoobi all) läheduses asuva katseobjektiga. Katseobjektidena kasutatakse teadaoleva murdumisnäitajaga standardseid vedelikke. Ese ja näidis asetatakse laval kõrvuti. Kui nende murdumisnäitajad ei ühti, on objekti ja proovi vahel nähtav hele joon, mida nimetatakse Becki jooneks. Mikroskoobi toru tõstmine fookusasendi suhtes põhjustab Becki joone nihkumise söötme suunas, mis annab rohkem väljendunud murdumise efekti. Kui objekti ja proovi murdumistegurid langevad kokku, kaob Becki joon. Tavaliselt määratakse spektri naatriumijoone murdumisnäitaja monokromaatilises valguses (lainepikkusel 589 nm ja temperatuuril 20 ° C). Murdumine tuleks määrata kahe vastastikku risti oleva polarisatsioonitasandi jaoks. Selleks eemaldatakse analüsaator ja objekti murdumine registreeritakse selle kahes üksteisega risti asetsevas asendis. Kahe murdumisnäitaja erinevus (ng - nk) iseloomustab murdumisvõimet.

MATERJALI TÖÖTLEMISE OMADUSED JA VALMISTE VALMISTAMINE

Polarisatsioonimikroskoopias kasutatava materjali fikseerimine happelises formaliinis on ebasoovitav, kuna koe hemoglobiini ja happeformaldehüüdi interaktsiooni käigus moodustunud formaliini pigmendil on anisotroopsed omadused ja see raskendab preparaatide uurimist polariseeritud valguses. G. Scheuner ja J. Hutschenreiter (1972) soovitavad selleks kasutada 10% neutraalset formaliini, Bakeri kaltsiumi-formooli lahust, Carnoy vedelikku.

Fikseerimise kestus 10% neutraalses formaliinis on 4°C juures 24-72 tundi, Bakeri järgi kaltsiumformooli lahuses 4°C juures 16-24 tundi. Kaltsiumformoolis fikseerimine on eriti eelistatud lipiid-valguühendite uurimisel. Carnoy vedelik imbub kiiresti kangastesse. 1–2 mm paksused tükid profileeritakse 1 tunni pärast temperatuuril 4 ° C. Lipiidide uurimiseks ei ole fikseerimine Carnoy vedelikus sobiv. Lisaks kasutatakse Zenkeri vedelikku, eriti kulla ja hõbeda sooladega immutamisel. Pärast töötlemist Zenkeri vedeliku ja äädikhappe seguga omandavad erütrotsüüdid kahemurdevõime.

Tihedate kudede (luud, hambad) uurimisel polarisatsioonimikroskoobis on lisaks happelise katlakivi eemaldamisele vajalik täiendav töötlemine kollageenikiudude eemaldamiseks. Sel eesmärgil keedetakse selliste kudede sektsioone mitu minutit glütserooli ja kaaliumhüdroksiidi segus (10 ml glütserooli ja 2 tera kaaliumhüdroksiidi), kuni need on täiesti valged, seejärel kurnatakse leelis ettevaatlikult, pestakse sektsioon vees. ja kantakse pintsettidega mikroskoobi staadiumisse.

Polariseeriva mikroskoopia jaoks kasutatakse parafiin-, külmutatud ja krüostaatlõike. Polariseeritud valguse uurimiseks mõeldud värvimata külmutatud lõigud sisestatakse glütserooli. Fikseerimata krüostaadi sektsioonid sobivad analüüsiks kohe pärast valmistamist. Tänu nende kõrgele tundlikkusele kahjulike mõjude suhtes erinevaid tegureid keskkonnas, soovitatakse need lõigud siiski fikseerida 10% neutraalses formaliini või kaltsium-formooli lahuses.

Polariseeriva mikroskoopia tulemusi mõjutab histoloogiliste lõikude paksus. Paksude lõikude uurimisel luuakse tingimused erinevate anisotroopsete struktuuride üksteise peale asetamiseks. Lisaks võivad uuritavate struktuuride anisotroopsed omadused erinevate viilude paksuste juures muutuda, mistõttu on eriti võrdlusuuringutes väga oluline tagada pidev viilupaksus. Soovitatav maksimaalne viilu paksus ei tohi ületada 10 µm.

Teine eeltingimus on sektsioonide hoolikas deparafiini eemaldamine, kuna eemaldamata parafiinijäägid annavad tugeva anisotroopia efekti, mis muudab uurimise keeruliseks. Parafiin püsib eriti kaua erütrotsüütidel ja raku tuumadel. Parafiini täielikuks eemaldamiseks sektsioonidest on soovitatav läbi viia nende järgmine töötlemine.

• Ksüleen 30 min
• Alkohol 100% 5 min
• Metanooli ja kloroformi segu (1:1) temperatuuril 50 °С 24 tundi
• Alkohol 100% 5 min
• Alkohol 70% 10 min Vesi

Samuti tuleb meeles pidada, et polarisatsioonimikroskoopiaga lõigud ei tohiks kokku puutuda fenoolidega (näiteks ei saa neid puhastada karboksüülhappega).

Lisateavet polariseeriva mikroskoopia ja kompensaatorite kasutamise kohta leiate aadressilt (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).

Kui teil on polariseeriva mikroskoopia kohta küsimusi, võtke ühendust mikroskoopia kooliga.

Kõigist mitmesugustest mikroskoopiaseadmetest on polariseerivad mikroskoobid tehniliselt kõige keerukamad. Selline tähelepanu seadme disainile valmistatavuse osas on tingitud vajadusest saada pilt kõrgeim kvaliteet, mida mõjutab otseselt mikroskoobi optiliste ja valgustusosade konstruktsioon. Mikroskoopia polariseerivate seadmete peamine kasutusvaldkond on mineraalide, kristallide, räbu, anisotroopsete esemete, tekstiil- ja tulekindlate toodete ning muude materjalide uurimine, mida iseloomustavad kahekordne murdumine. Viimane põhimõte on aluseks kujutise moodustamisel sellistes mikroskoopiaseadmetes, kus uuritavat proovi kiiritatakse polarisatsioonikiirtega. Sel juhul ilmnevad proovide anisotroopsed omadused pärast kiire suuna muutmist. Sel eesmärgil on polariseerivad mikroskoobid konstrueeritud nii, et väljafiltrid pöörlevad üksteise suhtes erinevates tasapindades: analüsaator pöörleb 180 kraadi ja polarisaator 360. muud tüüpi mikroskoobid.

Proovi uurimine polariseeriva mikroskoobi all algab polarisaatori paigaldamisega mikroskoobi valgustavasse ossa kondensaatori alla, ava diafragma kõrvale. Samal ajal asub analüsaator okulaari ja läätse vahel - viimase taga mööda valguskiirte teed. Sellise instrumendi õige seadistuse korral mikroskoopia jaoks on pärast filtriväljade ületamist nähtav väli ühtlaselt tume, moodustades nn väljasuremisefekti. Pärast seadme seadistuste lõpetamist kinnitatakse katseproov lavale ja viiakse läbi selle uuring. Polariseerivate mikroskoopide astmed on optilise telje suhtes tsentreeritud ja 360 kraadi pööratavad ning sarnastes labori- ja uurimisotstarbelistes seadmetes on neil ka noonus. Polariseerivate mikroskoopide optika ja valgustussüsteem on kõrgeima kvaliteediga ja sellise täpsusega valmistatud, mis võimaldab saada kõige selgema pildi ilma moonutusteta. Sageli sisaldab polariseeritud valguses proovide uurimiseks mõeldud seadmete komplekt kompensaatorit ja Bertrandi objektiivi. Esimene võimaldab tõhusalt uurida mineraalide struktuuri ja lääts - suurendada ja teravustada vaatlusala, kui pildil ilmnevad muutused pärast lava pööret. Tänapäeval on turul kolm peamist tüüpi selliseid mikroskoopiaseadmeid - need on juba mainitud uurimis- ja laboriseadmed, aga ka töötav polariseeriv mikroskoop.

E. Tumevälja mikroskoopia.

18. Mikroskoop koosneb optilistest ja mehaanilistest osadest. Mis on optilised osad?

A. Toru, okulaar, kondensaator

B. Revolver, makro- ja mikrokruvi, peegel

C. Revolver, okulaar

D. Okulaar, kondensaator, objektiiv

E. Toru, okulaar, revolver

19. Ultraviolettkiirte kasutamisel valgusallikana suureneb mikroskoobi lahutusvõime. Millised mikroskoopilised instrumendid seda valgusallikat kasutavad?

A. Darkfield ja fluorestseeruv

B. Fluorestseeruv, ultraviolett

C. Helendav ja elektrooniline

D. Faasikontrast, ultraviolett

E.Polariseeriv, ultraviolett

20. Mikroskoop koosneb mehaanilistest ja optilistest osadest. Millisel mikroskoobi osal on diafragma?

A. Okulaar ja objektiiv

B. Okulaar ja kondensaator

C. Toru ja okulaar

D. Objektiiv ja kondensaator

E. Toru, lääts, okulaar

21. Katses kasutati elusobjekte, milles on vaja määrata seeria keemilised komponendid kasutades elulist vaatlust. Millist mikroskoopilist uurimismeetodit kasutatakse?

A. Faaskontrastmikroskoopia

B. Elektronmikroskoopia

C. Fluorestsentsmikroskoopia

E Tumevälja mikroskoopia.

22. Rakkude histoloogiliseks uurimiseks kasutati fosforit. Millist tüüpi mikroskoopiat sel juhul kasutati?

A. Valgusmikroskoopia

B. Elektronmikroskoopia

C. Fluorestsentsmikroskoopia

E. Polariseeriv mikroskoopia

E. Tumevälja mikroskoopia.

23. Uurija ülesandeks on saada ruumiline esitus uuritava objekti struktuuride kohta. Millise mikroskoopilise seadmega spetsialist töötab?

A. Ultraviolettmikroskoopia,

B. Faaskontrastmikroskoopia,

C. Transmissioonelektronmikroskoopia,

D. Skaneeriv elektronmikroskoopia,

E. Polariseeriv mikroskoopia

24. Valgusallikana kasutatakse elavhõbe-kvartslampe. Kui suur on selle valgusallikaga mikroskoobi lahutusvõime?

25. Mikroskoobi lahutusvõime sõltub valgusallika lainepikkusest. Mis on valgusmikroskoobi lahutusvõime?

26. Enne histoloogilise preparaadi uurimisega alustamist on vajalik vaateväli ühtlaselt valgustada. Milliseid mikroskoobi osi selleks kasutatakse?

A. Mikro- ja makrovit

B. Kondensaator ja peegel

C. Toru ja toruhoidja

D. Toru ja okulaar

27. Uurija sai ülesandeks uurida erütrotsüütide plasmolemma ultramikroskoopilist struktuuri. Millist mikroskoopilist instrumenti kasutatakse?

A. Valgus

B. Faasikontrast

C. Elektrooniline

D. Polariseerimine

E. Ultraviolett

28. Skeletilihaskoe uurimisel on vaja määrata koe iso- ja anisotroopsed struktuurid. Millist tüüpi mikroskoopiat kasutatakse?

A. Valgus

B. Faasikontrast

C. Elektrooniline

D. Polariseerimine

E. Ultramikroskoopiline

29. Fluorestsentsmikroskoobi eraldusvõime sõltub valgusallika lainepikkusest. Millega see on võrdne?

A. 0,1 µm C. 0,4 µm

H. 0,2 µm D. 0,1 nm

30. Kliinilises laboris kasutatakse üldvereanalüüsi uurimiseks mikroskoopilisi uuringuid. Millist mikroskoopi selleks vaja on?

A. Valgus,

B. Faasikontrast,

C. Elektrooniline,

D. Polariseerimine,

E. Ultraviolett.

31. Uurimiseks esitatakse loodusliku luminestsentsiga elusobjekt. Millist tüüpi mikroskoopiat tuleks selles uuringus kasutada?

A. Valgus

B. Faasikontrast

C. Elektrooniline

D. Polariseerimine

E. Ultraviolett

32. Biopsia tulemusena saadi kasvajarakkude materjal. On vaja uurida nende ultramikroskoopilist struktuuri. Millist tüüpi mikroskoopiat selles uuringus kasutatakse?

A. Valgus

B. Faasikontrast

C. Elektrooniline

D. Polariseerimine

E. Ultraviolett

2. TEEMA: HISTOLOOGILINE TEHNIKA

Valgus- ja elektronmikroskoopia preparaatide valmistamise põhiprintsiibid, materjali võtmine (biopsia, nõelatorkebiopsia, lahkamine). Objektide fikseerimine, dehüdratsioon, tihendamine, lõikude ettevalmistamine mikrotoomidel ja ultramikrotoomidel. Mipreparaatide tüübid - lõige, määrimine, jäljend, kiled, õhuke lõik. Värvimis- ja kontrastainepreparaadid. Histoloogiliste plekkide mõiste.

Mikroskoopiline tehnika.

Tsütoloogilise ja histoloogilise analüüsi peamised etapid:

Õpiobjekti valik

Selle ettevalmistamine mikroskoobi all uurimiseks

Mikroskoopia meetodite rakendamine

Saadud piltide kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüs

Histoloogilises tehnikas kasutatavad meetodid:

1. Eluaeg.

2. Postuumne.

I ELUaegsed MEETODID

Elukestva uurimistöö eesmärk on saada teavet raku eluea kohta: liikumine, jagunemine, kasv, diferentseerumine, rakkude interaktsioon, eluiga, hävimine, reaktiivsed muutused erinevate tegurite mõjul.

Elusrakkude ja kudede uurimine on võimalik väljaspool keha (in vitro) või keha sees (in vivo).

A. Elusrakkude ja kudede uurimine kultuuris (in vitro) –

Kasvatamise meetod

On: a) suspensioonkultuurid (toitekeskkonnas suspendeeritud rakud), b) koed, c) elundid, d) monokiht.

Kõige tavalisem on väljaspool keha kudede kultiveerimise meetod. Kudede kasvatamine toimub spetsiaalsetes läbipaistvates hermeetiliselt suletud kambrites. Steriilsetes tingimustes asetatakse kambrisse tilk toitainekeskkonda. Parim toitainekeskkond on vereplasma, millele lisatakse embrüoekstrakt (ekstrakt embrüo kudedest, mis sisaldab suures koguses kasvu stimuleerivaid aineid). Sinna asetatakse ka tükike elundist või koest (mitte rohkem kui 1 mm3), mida tuleb kasvatada.

Kultiveeritud kude tuleks hoida selle organismi kehatemperatuuril, mille kude uuringuks võeti. Sest sööde muutub kiiresti kasutuskõlbmatuks (koguneb kultiveeritud koest vabanevad lagunemissaadused), siis tuleb seda vahetada iga 3-5 päeva tagant.

Kultiveerimismeetodi kasutamine võimaldas paljastada mitmeid diferentseerumise mustreid, rakkude pahaloomulist transformatsiooni, rakkude omavahelisi koostoimeid, aga ka viiruste ja mikroobidega. Embrüonaalsete kudede kasvatamine võimaldas uurida luu, kõhre, naha jne arengut.

Kultiveerimismeetod on eriti oluline inimese rakkude ja kudede eksperimentaalsete vaatluste läbiviimisel, eelkõige soo, pahaloomulise degeneratsiooni, pärilike haiguste jms määramisel.

Meetodi puudused:

1. Selle meetodi peamine puudus on see, et kude või elundit uuritakse kehast eraldatult. Kogemata keha neurohumoraalset mõju, kaotab see oma loomupärase eristuvuse.

2. Vajadus sagedaste siirdamiste järele (pikaajalise kasvatamisega).

3. Kudede sama murdumiskoefitsient.

Sarnane teave.