Glosārijs:

• Polarizētā gaisma ir gaismas viļņi, kas vibrē vienā virzienā.

• Gaismas vilnis ir elektrisks un magnētisks starojums, kura svārstību plakne ir perpendikulāra viļņa izplatīšanās plaknei.
• Polarizators (Nicol I) ir ierīce, kas ļauj iziet cauri tikai pilnībā vai daļēji polarizētai gaismai. Izstrādāts, lai pārraidītu polarizētu gaismu uz (caur) pētāmo caurspīdīgo objektu un nogrieztu (izkliedētu) nepolarizēto gaismu (dabisko gaismu, mākslīgo gaismu, ieskaitot mikroskopa apgaismotāja starojumu). Gaismas intensitāte, kas iet caur polarizatoru, samazinās proporcionāli leņķa kosinusa kvadrātam starp polarizatora un analizatora polarizācijas plaknēm (Malus likums):

Kur: I ir intensitāte pirms iziešanas caur polarizatoru, I ir gaismas intensitāte pēc polarizatora iziešanas, φ ir leņķis starp polarizētās gaismas polarizācijas plaknēm un polarizatoru.

• Analizators (Nicol II) - ierīce, kas līdzīga polarizatoram, bet paredzēta polarizētas gaismas analīzei.

Analizatora pagriešana attiecībā pret polarizatoru par leņķi ϕ. Gaismas intensitāti parāda sarkanā bultiņa.

• Kompensators ir ierīce noteikšanai kvantitatīvās īpašības polarizācija. Pārvērš augsta kontrasta redzamu attēlu krāsainā attēlā, baltā gaismā vājinot noteiktus viļņu garumus.
• Lineāri polarizēta gaisma ir gaisma, kuras svārstību plakne ir ierobežota vienā virzienā un izplatās vienā plaknē.
• Gaismas viļņu svārstību fāze no matemātiskā viedokļa ir gaismas viļņu funkcijas arguments, tas ir, ωt+φ 0 sin(ωt+φ 0) funkcijā. Fiziski tas ir noteikts elektromagnētiskais stāvoklis noteiktā laika brīdī.

• Viļņa garums ir attālums starp diviem tuvākajiem punktiem, kas atrodas vienā fāzē.

• Atspulgs ir viļņa virziena maiņa. Pilnīga pārdoma sauc par viļņa laušanas leņķa maiņu, kas ir mazāka par 90 °.

• Refrakcija ir viļņa virziena maiņa uz divu vidiņu robežas. Divkāršā laušana ir viena gaismas stara sadalīšana anizotropā vidē divos staros.

4. attēls. Staru refrakcija Islandes spara kristālā.

• Dihroisms ir gaismas daļēja absorbcija vielai atkarībā no tās polarizācijas.

• Interference ir gaismas intensitātes izmaiņas, kad tiek uzklāti divi vai vairāki gaismas viļņi.

• Gaismas staru ceļa atšķirība ir vērtība, kas raksturo gaismas ātruma palēninājumu, ejot cauri caurspīdīgai vielai. Ceļa starpību mēra ar attālumu, ko gaisma nobrauc vakuumā tik ilgi, cik nepieciešams pētāmās vielas caurlaidībai pētāmajos telpas punktos.

• Konoskopija ir metode anizotropu objektu optisko īpašību izpētei saplūstošos polarizētās gaismas staros. Konoskopijas laikā tiek novērotas izmaiņas traucējumu modelī, kad analizators tiek pagriezts. Pagriežot analizatoru un polarizatoru viens pret otru, pētnieks mikroskopā novēro konoskopiskas figūras, kas sastāv no izogīriem (tās ir tumšas joslas, kas atbilst gaismas viļņu svārstību virzienam polarizatorā) un izohromiem (tās ir dažādu traucējumu krāsu joslas kas atbilst staru virzieniem kristālā ar vienādu ceļa starpību).

• Ortoskopija ir metode anizotropu objektu optisko īpašību izpētei paralēlos polarizētās gaismas staros.

• Pleohroisms ir dažu anizotropu objektu novērotās krāsas izmaiņas, mainoties skata leņķim (kristālu krāsas maiņa, pagriežot galdu).

Polarizējošais mikroskops ir mikroskops, kas paredzēts, lai pētītu polarizētās gaismas, kas iet cauri anizotropai videi, divkāršu lūzumu.

Pirmo polarizējošo mikroskopu 1863. gadā izstrādāja Henrijs Kliftons Sorbijs, un tas atšķīrās no mums ierastā optiskā mikroskopa ar divām Nicol prizmām, kas uzstādītas optiskajā ceļā. Nicol prizma caur sevi raida gaismu tikai vienā virzienā un vienā plaknē, tas ir, plaknes polarizētā gaismā, pārējā gaisma, kas nonāk šajās prizmās, ir pilnībā atstarota un izkliedēta. Šīs prizmas strukturāli neatšķiras viena no otras un darbojas kā polarizatori (analizators un polarizators). Kad analizatora polarizācijas plakne tiek pagriezta par 90º attiecībā pret polarizatora polarizācijas plakni, pētnieks novēro divkāršās laušanas objekta polarizācijas modeli, un visi objekti, kuriem nav dubultlaušanas, tiek aptumšoti. Mūsdienu mikroskopos, lai iegūtu vairāk Informācijai DIC prizmas (reljefa apvienošana ar polarizācijas rakstu, nekrāsotu paraugu pētīšanai), kompensatori (kvantitatīvās polarizācijas), apaļais galds (pleohroisma pētīšanai) un vienkārši polaroīdi vienkāršiem novērojumiem (piemēram, bioloģijā un medicīnā) Var izmantot.

Polarizāciju visbiežāk izmanto kristalogrāfijas mikroskopos, kur anizotropo objektu īpašības var noteikt, izmantojot konoskopiju un ortoskopiju. Pievērsiet uzmanību konoskopijas un ortoskopijas līdzībām un atšķirībām: gaismas stars iet cauri polarizatoram (1), to ierobežo diafragmas diafragma (2), iziet cauri kondensatora lēcām (3); analizators (kas pagriež pētnieku) (8) un kompensatori (7).

1. attēls - polarizējošā mikroskopa shēma: a) ortoskopijai b) konoskopijai

Leģenda: 1 - polarizators, 2.6 - diafragmas; 3 - kondensators; 4 - sagatavošana; 5 - objektīvs; 7 - kompensators; 8 - analizators; 9 - Bertrāna objektīvs; 10 - okulāra fokusa plakne; 11 - okulārs.

Novērotais attēls sastāv no konoskopiskām figūrām. konoskopiskas figūras - sastāv no izogīriem (tās ir tumšas taisnas vai izliektas svītras, kurās vibrācijas virzieni ir paralēli galvenajām nikolu sekcijām) un izohromiem (tās ir svītras, kas krāsotas dažādās interferences krāsās. Katra josla atbilst sloksnes virzieniem). stari, kas veidojas divkāršās laušanas laikā un kuriem ir tāda pati ceļu atšķirība).

Sniegsim piemēru: perpendikulāri optiskajai asij izgrieztā vienpusējā kristāla plāksnēs redzēsim izogiru krusta un koncentrisku izohroma gredzenu formā, sk. 5.

5. attēls - A) Vienass kalcīta minerāla konoskopiskās figūras B) Divasu flogopīta minerāls ar ievietotu kompensatoru.

Pēc iegūtā interferences modeļa rakstura tiek mērīta divkāršās laušanas vērtība, polarizācijas plaknes griešanās leņķi, ekstinkcijas leņķi, optisko asu skaits un citi raksturlielumi. Visas šīs īpašības ļauj skaidri saprast, kuru kristālu pētnieks novēro, tā struktūru. Mikroskopi, piemēram, BX53P un H600P, ir paredzēti mineraloģijai un kristalogrāfijai. Tie ir aprīkoti ar labāko bezsprieguma optiku un kompensatoriem, kas izgatavoti uz modernām iekārtām, novēršot brīvību un spraugas, kad tie tiek uzstādīti mikroskopā.

Divpusējo laušanu izmanto ne tikai kristalogrāfijā, bet arī medicīnā, bioloģijā, kriminālistikā un metalogrāfijā, jo pētniekiem ir svarīgi ātri un precīzi izolēt vitamīnus, skābes, minerālvielas, spriegumus izotropos objektos, nemetāliskus ieslēgumus oriģinālajā paraugā, un citi. Piemēram, histoloģijas un citoloģijas mikroskopi ir aprīkoti ar polarizatoriem, lai noteiktu dažāda veida objektus. Apaļi priekšmeti, kuru diametrs ir aptuveni 2,4 mikroni, lipoīdi un pilieni, ar krustotiem polarizatoriem veido Maltas krusta interferences modeli. Ne visām vielām ir vienādas refrakcijas īpašības dažādas temperatūras, tā, piemēram, var izšķirt 1) vielas, kuras atdzesējot iegūst anizotropās īpašības un karsējot tās zaudē: holesterīns un tā esteri 2) karsējot nezaudē savas anizotropās īpašības: cerebrozīdi, fosfatīdi, mielīni. Šāda īpašību mainība ir saistīta ar vielas spēju saglabāt kristālisku struktūru, tk. Tas ir tas, kas izraisa divkāršo laušanu. Vērojot anizotropos objektus polarizējošā mikroskopā un nosakot to koncentrāciju, pēc lipīdu mirdzuma ar krusteniskiem polarizatoriem var diagnosticēt tādas slimības kā: artrīts, ateroskleroze, lipoidūrija, cilinūrija un lipidoze, kā arī podagra, urolitiāze, selikoze un azbests pēc kristāliem. attiecīgi urīnviela, silīcija dioksīds un azbesta šķiedras. Histoloģijai un citoloģijai ir izstrādāts BX46 mikroskops, kas aprīkots ar zemo skatuvi, jaudīgu apgaismotāju un regulējamu augstumu cauruli, kas glābs pētnieka muguru no nosūkšanās.

Krāsas, kas atšķiras no izotropiem objektiem polarizētā gaismā, ir: ciete, celuloze, dažas skābes, C vitamīns, tāpēc arī farmakoloģijas un farmācijas mikroskopus vajadzētu aprīkot ar polarizatoriem. Farmakoloģiskais mikroskops ietver gan CX43 un BX43, gan citus modeļus, jo ar katru gadu šajā jomā notiek arvien vairāk pētījumu, un jauniem izpētes objektiem nepieciešama cita pieeja.

Tiesu ekspertīzē ir svarīgi atšķirt kvarca un citu minerālu graudu ieslēgumus no organiskiem un citiem materiāliem, kas atrodami nozieguma vietā, tāpēc mikroskopam jābūt aprīkotam ar atstarotu gaismu, lai varētu aplūkot arī necaurspīdīgus objektus. Mikroskops BX53M ir piemērots kriminālistikai, jo ir aprīkots ne tikai ar jaudīgu caurlaidīgās gaismas avotu, bet arī ar tādu pašu jaudīgu atstarotās gaismas izgaismotāju, un ieliktņi mikroskopa darba attāluma palielināšanai ļaus pētīt ļoti lielus objektus. bez ilgstošas ​​iepriekšējas sagatavošanās.

Polarizējošie mikroskopi tiek izmantoti arī metalogrāfijā, taču šādiem pētījumiem pietiek zināt anizotropo objektu esamību vai neesamību, kā arī to telpisko sadalījumu. Tieši šādu objektu klasifikācijai un uzskaitei metalogrāfijā var izmantot mikroskopus VHX6000, BX53P ar uzstādītu Stream.

Fāzes kontrasta mikroskopijas metode

Lielākā daļa šūnu struktūru maz atšķiras pēc gaismas refrakcijas indeksa, staru absorbcijas viena no otras un vides. Lai pētītu šādas sastāvdaļas, ir jāmaina apgaismojums (ar attēla skaidrības zudumu) vai jāizmanto īpašas metodes un ierīces. Viena no šādām metodēm ir fāzes kontrasta mikroskopija. To plaši izmanto šūnu dzīvībai svarīgos pētījumos. Metodes būtība ir tāda, ka pat ar ļoti nelielām dažādu zāļu elementu refrakcijas indeksu atšķirībām gaismas vilnis, kas iet caur tiem, iziet dažādas fāzes izmaiņas. Šīs fāzes izmaiņas, kas nav tieši neredzamas ne acij, ne fotoplatei, ar speciālu optisko ierīci pārvērš gaismas viļņa amplitūdas izmaiņās, t.i., spilgtuma izmaiņās, kas jau ir redzamas acij vai ir ierakstītas uz acs. gaismjutīgs slānis. Iegūtajā redzamajā attēlā spilgtuma (amplitūdu) sadalījums atveido fāzes reljefu. Iegūto attēlu sauc par fāzes kontrastu. Objekti var izskatīties tumši uz gaiša fona (pozitīvs fāzes kontrasts) vai gaiši uz tumša fona (negatīvs fāzes kontrasts).

Interferences kontrasta metode (interferences mikroskopija)

Interferences kontrasta metode ir līdzīga iepriekšējai - tās abas ir balstītas uz staru traucējumiem, kas ir izgājuši cauri mikrodaļiņai un palaiduši to garām. Paralēlu gaismas staru kūlis no apgaismotāja sadalās divās plūsmās, nonākot mikroskopā. Viens no iegūtajiem stariem tiek virzīts caur novēroto daļiņu un iegūst izmaiņas svārstību fāzē, otrs - apejot objektu pa to pašu vai papildu mikroskopa optisko atzaru. Mikroskopa okulārajā daļā abi stari atkal savienojas un traucē viens otru. Interferences rezultātā tiks uzbūvēts attēls, uz kura kontrasta ziņā atšķirsies viena no otras šūnas posmi ar dažādu biezumu vai dažādu blīvumu. Interferences kontrasta metodi bieži izmanto kopā ar citām mikroskopijas metodēm, jo ​​īpaši ar novērošanu polarizētā gaismā. Tā lietošana kopā ar ultravioleto mikroskopiju ļauj, piemēram, noteikt saturu nukleīnskābes objekta kopējā saussvarā.

Polarizējošā mikroskopija

Polarizējošā mikroskopija ir metode, kā polarizētā gaismā novērot objektus, kuriem ir izotropija, t.i. Submikroskopisko daļiņu sakārtota orientācija. Polarizējošā mikroskopa kondensatora priekšā ir novietots polarizators, kas pārraida gaismas viļņus ar noteiktu polarizācijas plakni. Pēc sagatavošanas un lēcas tiek ievietots analizators, kas var pārraidīt gaismu ar tādu pašu polarizācijas plakni. Ja pēc tam analizatoru pagriež par 90o attiecībā pret pirmo, gaisma netiks cauri. Gadījumā, ja starp šādām krustotām prizmām atrodas objekts, kuram ir spēja polarizēt gaismu, tas tiks uzskatīts par spīdošu tumšā laukā. Izmantojot polarizējošo mikroskopu, var pārbaudīt, piemēram, micellu orientēto izvietojumu šūnapvalki augi.

Polarizējošā mikroskopija— viena no ļoti efektīvām morfoloģiskās izpētes metodēm, kurai ir plašas bioloģisko struktūru noteikšanas iespējas, kas apvienojumā ar pieejamību un relatīvo vienkāršību nosaka tās augsto vērtību. Metode ļauj pētīt ne tikai preparāta histoloģisko struktūru, bet arī dažus tā histoķīmiskos parametrus. XX gadsimta 40-50 gados. polarizācijas mikroskopija tika uzskatīta par ultrastrukturālu metodi, jo tā ļāva redzēt audu ultrastrukturālās spējas.

Polarizācijas mikroskopija ir paredzēta, lai pētītu histoloģisko struktūru īpašības, kurām piemīt divkāršās laušanas (anizotropijas) spēja - gaismas stara bifurkācija, kad tas iet caur anizotropu vidi. Gaismas vilnis anizotropā vidē sadalās divos viļņos ar savstarpēji perpendikulārām elektromagnētisko viļņu svārstību plaknēm. Šīs plaknes sauc par polarizācijas plaknēm. Polarizētā gaisma atšķiras no parastās (nepolarizētās) gaismas ar to, ka pēdējā gaismas viļņu svārstības notiek dažādās plaknēs, savukārt polarizētā gaismā tās notiek tikai noteiktā plaknē.

Lai radītu polarizācijas efektu polarizējošā mikroskopā, tiek izmantoti divi polaroīdi. Pirmais, ko sauc par polarizatoru, atrodas starp mikroskopa apgaismotāju un histoloģisko preparātu, bet otrs polaroīds, kas atrodas starp histoloģisko preparātu un pētnieka aci, ir analizators. Gan polarizators, gan analizators ir optiski tieši tādi paši polarizācijas filtri, tāpēc tos var apmainīt (ja mikroskopa konstrukcija to atļauj). Iepriekš polarizācijas mikroskopijai tika izmantotas no Islandes špaga izgatavotas Nicol, Ahrens vai Thomson prizmas. Šīm prizmām bija ierobežots gaismas laušanas leņķis. Pašlaik tā vietā tiek izmantoti plakanie polarizācijas filtri, kas rada plaša lauka polarizētu gaismu.

Polarizatora un analizatora relatīvajam stāvoklim attiecībā pret mikroskopa optisko asi ir izšķiroša nozīme polarizētās gaismas radīšanā. Ja tie ir orientēti tā, lai abi polarizēto gaismu raidītu vienā plaknē, t.i. kad to polarizācijas plaknes sakrīt, abi polarizācijas filtri spēj pārraidīt polarizētu gaismu; mikroskopa redzes lauks šajā gadījumā ir spilgts (1.a att.).

Rīsi. 1 Cilvēka plaušu sagatavošana spilgtā laukā, OlympusCX41, 10x objektīvs

Ja polarizējošo filtru polarizācijas plaknes ir savstarpēji perpendikulāras (to panāk, analizatoru pagriežot par 90° ap mikroskopa optisko asi), tad polarizētā gaisma neiet cauri un pētnieks redz tumšu redzes lauku (att. . 2).

Kad polarizators tā rotācijas laikā tiek pagriezts par 360°, redzes lauks tiek divreiz pilnībā aptumšots un divreiz pilnībā izgaismots. Agrāk tika izmantoti Bernauera kompensējošie filtri, kuros aptumšotajam redzes laukam ir sarkanīga nokrāsa ( U-TP530 ). Lietojot melnus spoguļfiltrus, aptumšotais skata lauks nešķiet pilnīgi tumšs, bet gan vāji izgaismots.

2. att. Cilvēka plaušu sagatavošana polarizētā gaismā, 10x objektīvs

Gadījumos, kad ar polarizējošo filtru krustojuma stāvokli (t.i., ortoskopijās) polarizētās gaismas ceļā tiek sastaptas histoloģiskā paraugā esošās anizotropās vielas, šīs vielas polarizēto gaismu sadala divos staros ar savstarpēji perpendikulārām gaismas plaknēm. viļņu svārstības. Gaismas stari ar svārstību plakni, kas sakrīt ar polarizācijas plakni, iziet cauri analizatoram, un ar perpendikulāru tie tiek nogriezti, kā rezultātā gaismas plūsmas intensitāte, kas nonāk pētnieka acī un kamerā, ir tikai puse no intensitātes. sākotnējā gaismas stara. Aprakstīto procesu rezultātā anizotropās vielas, kas atrodas starp diviem krustojošiem polarizatoriem, ir redzamas uz tumša fona spilgti gaismas objektu veidā. Šajā gadījumā izotropās struktūras, kurām nav divkāršās laušanas spējas, paliek tumšas.

Tas ietekmē arī izvēli polarizācijas mikroskopijas kameras. Tā kā uzdevums ir tvert nelielus gaismas signālus uz tumša fona, ar spilgta lauka mikroskopijas kameru parasti var nepietikt kameras zemās jutības un lielā trokšņa daudzuma dēļ, kas rodas uzņemšanas laikā. Fotografēšanai polarizējošā mikroskopijā mikroskopijai nepieciešama kamera ar augstu jutību un precīzu krāsu atveidi. Vēlams izmantot kameras, kuru pamatā ir CCD matricas ( , VZ-CC50S), tomēr pašreizējā posmā varat izmantot arī budžeta iespējas kamerām, kuru pamatā ir Sony IMX sērijas CMOS matricas ().

Bioloģiskie audi satur pietiekamu skaitu anizotropu struktūru: muskuļu kontraktilās aparāta elementus, amiloīdu, urīnskābi, kolagēna veidojumus, dažus lipīdus, vairākus kristālus utt.

Gaismas stari, kas sadalās anizotropā objektā un iet cauri analizatoram, raksturo nevienlīdzīgu viļņu izplatīšanās ātrumu. Atkarībā no šīs atšķirības lieluma (to sauc arī gaismas stara aizkaves lielums) un no gaismas absorbcijas atšķirībām analizatorā anizotropo objektu mirdzums var būt balts vai krāsains. Pēdējā gadījumā mēs runājam par dihroisma fenomenu ( dubultā absorbcija I). Krāsu efekti pētījumā polarizācijas jomā dod, piemēram, daudzus kristālus.

Divkāršās laušanas procesu var uzlabot, izmantojot noteiktas krāsvielas, kuru molekulām ir spēja orientēties, nogulsnējot uz anizotropām struktūrām. Histoķīmiskās reakcijas, kuru rezultātā rodas anizotropijas efekts, sauc par topooptiskām reakcijām (G. Romhani). Ir divu veidu šādas reakcijas – aditīvās un apgrieztās. Ar aditīvām reakcijām palielinās gaismas stara aizkave, ko sauc par pozitīvo anizotropiju, ar apgrieztām reakcijām tā samazinās - negatīva anizotropija.

IEKĀRTAS UN IEKĀRTAS

Polarizējošā mikroskopija tiek veikta, izmantojot īpašus polarizējošos mikroskopus. Kā piemēru varam nosaukt importētos mikroskopus,. Lielākā daļa mūsdienu optisko mikroskopu ir aprīkoti ar polarizācijas mikroskopijas piederumiem.

Polarizējošai mikroskopijai var pielāgot jebkuru laboratorijas un pētniecības līmeņa gaismas mikroskopu. Pietiek ar diviem polarizācijas filtriem, no kuriem viens, kas darbojas kā polarizators, atrodas starp gaismas avotu un paraugu, bet otrs, kas pilda analizatora lomu, atrodas starp paraugu un pētnieka aci. Polarizatoru var iebūvēt kondensatorā vai novietot zem tā virs lauka diafragmas, un analizatoru var ievietot revolvera slotā vai starpposma ieliktnī.

Uz att. 3 ir polarizējošā mikroskopa shematiska diagramma. Papildus komponentiem, kas ir kopīgi visiem gaismas mikroskopiem, polarizējošajam mikroskopam ir divi polarizācijas filtri (polarizators, kas parasti atrodas zem kondensatora, un analizators, kas atrodas okulārā), kā arī kompensators. Analizatoram obligāti jāgriežas, un, lai noteiktu rotācijas pakāpi, ir nepieciešama atbilstoša graduēta skala.

Polarizējošais mikroskops izmanto gaismas avotu, kas nodrošina liels blīvums gaismas stars. Kā šādu avotu ieteicams izmantot 100 W lampu ar spriegumu 12 V. Dažiem pētījumu veidiem ir nepieciešama monohromatiska gaisma. Šim nolūkam tiek izmantots metāla traucējumu filtrs, kuru vislabāk novietot virs spoguļa. Gaismu izkliedējošais matētais stikls ir novietots polarizatora priekšā, t.i. starp to un gaismas avotu, bet nekādā gadījumā pēc polarizatora, jo tas pārkāpj polarizējošā filtra funkciju.

Agrāk polarizācijas mikroskopijā izmantoja ahromatiskus objektīvus bez iekšējiem spriegumiem, taču tagad tie ir reti sastopami. Līdz šim polarizējošā mikroskopā tiek izmantoti tikai plāna ahromatiskie objektīvi, kuriem nav iekšējas spriedzes. Apohromatiskās lēcas var izmantot tikai gadījumos, kad mikrofotografēšanai nepieciešama normāla krāsu atveide.

Polarizējošie mikroskopi ir aprīkoti ar rotējošu objekta stadiju, kuras novietojums attiecībā pret optisko asi ir maināms. Galda griešanās leņķi mēra, izmantojot grādu skalu, kas atzīmēta uz tā apkārtmēra. Viens no priekšnoteikumiem, lai nodrošinātu efektīva pielietošana polarizējošā mikroskopija ir rūpīga rotējošās stadijas centrēšana, izmantojot centrēšanas skrūves.

Svarīgs polarizējošā mikroskopa elements ir kompensators, kas atrodas starp objektīvu un analizatoru, parasti mikroskopa caurulē. Kompensators ir plāksne, kas izgatavota no īpašām ģipša, kvarca vai vizlas šķirnēm. Tas ļauj izmērīt atšķirību sadalīto gaismas staru ceļā, kas izteikts nanometros. Kompensatora darbību nodrošina tā spēja mainīt gaismas staru ceļa starpību, samazinot to līdz nullei vai palielinot līdz maksimumam. To panāk, pagriežot kompensatoru ap optisko asi.

MIKROSKOPIJAS METODE POLARIZĒTĀ GAISMĀ

Polarizācijas mikroskopiju ir ērtāk veikt aptumšotā telpā, jo gaismas plūsmas intensitāte, kas nonāk pētnieka acī, samazinās 2 reizes, salīdzinot ar sākotnējo. Pēc mikroskopa apgaismotāja ieslēgšanas vispirms tiek panākts spilgtākais iespējamais redzes lauka apgaismojums, pagriežot polarizatoru vai analizatoru. Šis polarizācijas filtru novietojums atbilst to polarizācijas plakņu sakritībai. Zāles novieto uz objekta galda un vispirms izpēta gaišā laukā. Pēc tam, pagriežot polarizatoru (vai analizatoru), redzes lauks tiek pēc iespējas tumšāks; šī filtra pozīcija atbilst polarizācijas plakņu perpendikulārajam izvietojumam. Lai atklātu anizotropijas efektu, ir nepieciešams apvienot anizotropā objekta polarizācijas plakni ar polarizētās gaismas plakni. Empīriski tas tiek panākts, pagriežot objekta stadiju ap optisko asi. Ja polarizējošajai mikroskopijai izmanto gaismas mikroskopu, kas nav aprīkots ar rotējošu stadiju, tad histoloģisko paraugu nepieciešams pagriezt manuāli. Tas ir pieņemami, taču šajā gadījumā to nav iespējams veikt noteikti veidi polarizējošā mikroskopija, nepieciešama kvantitatīvā noteikšana(dubultā laušanas zīmes noteikšana, gaismas staru ceļa atšķirības lielums).

Ja anizotropie objekti pētāmajā preparātā ir sakārtoti (piemēram, šķērssvītrotu muskuļu šķiedru anizotropie diski), ir ērti tos pētīt fiksētā skatuves pozīcijā, kurā šie objekti sniedz maksimālu spīdumu pret tumsu. fons. Ja tomēr preparātā anizotropās struktūras ir izkārtotas nejauši (piemēram, kristāli), tad to izpētes laikā ir nepieciešams nepārtraukti grozīt objektu tabulu, panākot vienas vai otras objektu grupas mirdzumu.

Lai veiktu padziļinātu topooptisko reakciju analīzi un novērtēšanu, ir jāzina divkāršās laušanas relatīvās zīmes, staru ceļa atšķirības lieluma un laušanas indeksa (koeficienta) noteikšanas metode.

Divkāršās laušanas zīme raksturo caur analizatoru ejošo gaismas staru pārvietošanās pakāpi un virzienu. Šo nobīdi izraisa topooptiskās krāsvielas, un gadījumā, ja tā ir vērsta uz staru ceļa atšķirības samazināšanos, tiek runāts par negatīvu divkāršās laušanas pazīmi ( negatīva anizotropija), bet, ja tas veicina staru ceļa starpības palielināšanos, tad tiek konstatēta pozitīvā dubultlaušanas pazīme ( pozitīva anizotropija). Ja staru ceļa atšķirība pazūd, tad anizotropijas efekts tiek izlīdzināts.

Divkāršās laušanas zīmi nosaka, izmantojot kompensatoru. Tās piemērošanas procedūra ir šāda. Pētāmais objekts tiek novietots tādā stāvoklī, kurā tiek sasniegts maksimālais anizotropo struktūru spīdums tumšajā redzes laukā. RI-kompensatora plāksne tiek pagriezta ap optisko asi +45° leņķī attiecībā pret analizatora polarizācijas plakni. Objekts, atkarībā no gaismas staru ceļa atšķirības, kas var svārstīties no 20 līdz 200 nm, iegūst vai nu zilu vai dzeltenu krāsu. Pirmajā gadījumā divkāršās laušanas pazīme ir pozitīva, otrajā - negatīva. Jāpatur prātā, ka gadījumā, ja kompensators atrodas +45° leņķī, vispārējam aptumšotā redzes lauka fonam ir sarkana nokrāsa.

Varat arī izmantot λ/4 kompensatoru (U-TP137). Tās piemērošanas procedūra ir vienāda, tikai redzes laukam ir pelēka nokrāsa, nevis sarkana, un objekts spīd ar pozitīvu refrakcijas zīmi un ir aptumšots ar negatīvu.

Gaismas staru ceļa atšķirības, kas izteiktas nanometros, kvantitatīvā noteikšana tiek veikta, izmantojot Köhler Braque kompensatoru. Lai to izdarītu, izmantojiet formulu:

Γ=Γλ×sinφ

kur λ ir konstante, ko ražotājs uzliek kompensatoram, φ ir kompensatora griešanās leņķis attiecībā pret analizatora polarizācijas plakni.

Anizotropa objekta refrakcijas indeksu nosaka, salīdzinot to (zem mikroskopa) ar tuvumā novietotu testa objektu. Kā testa objekti tiek izmantoti standarta šķidrumi ar zināmu refrakcijas koeficientu. Priekšmets un paraugs uz skatuves novietoti blakus. Ja to refrakcijas rādītāji nesakrīt, starp objektu un paraugu ir redzama spilgta līnija, ko sauc par Beka līniju. Mikroskopa caurules pacelšana attiecībā pret fokusēto pozīciju izraisa Beka līnijas nobīdi pret vidi, kas dod izteiktāku refrakcijas efektu. Kad objekta un parauga laušanas koeficienti sakrīt, Beka līnija pazūd. Parasti refrakcijas indeksu nosaka monohromatiskā gaismā spektra nātrija līnijai (pie viļņa garuma 589 nm un temperatūrā 20 ° C). Refrakcija jānosaka divām savstarpēji perpendikulārām polarizācijas plaknēm. Šim nolūkam analizators tiek noņemts un objekta refrakcija tiek reģistrēta abās savstarpēji perpendikulārajās pozīcijās. Atšķirība starp diviem refrakcijas rādītājiem (ng - nk) raksturo laušanas jaudu.

MATERIĀLA APSTRĀDES ĪPAŠĪBAS UN PREPARĀTU SAGATAVOŠANA

Polarizācijas mikroskopijas materiāla fiksācija skābā formalīnā nav vēlama, jo formalīna pigmentam, kas veidojas audu hemoglobīna mijiedarbības laikā ar skābo formaldehīdu, ir anizotropas īpašības un tas apgrūtina preparātu izpēti polarizētā gaismā. G. Scheuner un J. Hutschenreiter (1972) iesaka šim nolūkam izmantot 10% neitrālu formalīnu, Beikera kalcija-formola šķīdumu, Carnoy šķidrumu.

Fiksācijas ilgums 10% neitrālā formalīnā ir 24-72 stundas 4°C, kalcija-formola šķīdumā pēc Beikera - 16-24 stundas 4°C temperatūrā. Fiksācija kalcija formolā ir īpaši ieteicama lipīdu-olbaltumvielu savienojumu pētījumos. Carnoy šķidrums ātri iesūcas audumos. Gabali ar biezumu 1 - 2 mm tiek profilēti pēc 1 stundas 4 ° C temperatūrā. Lipīdu izpētei fiksācija Carnoy šķidrumā nav piemērota. Turklāt tiek izmantots Zenker šķidrums, īpaši piesūcinot ar zelta un sudraba sāļiem. Pēc apstrādes ar Zenkera šķidruma un etiķskābes maisījumu eritrocīti iegūst divkāršās laušanas spēju.

Pārbaudot blīvos audus (kaulus, zobus) polarizējošā mikroskopā, papildus skābes atkaļķošanai ir nepieciešama papildu apstrāde, lai noņemtu kolagēna šķiedras. Šim nolūkam šādu audu sekcijas vairākas minūtes vāra glicerīna un kālija hidroksīda maisījumā (10 ml glicerīna un 2 graudi kālija hidroksīda), līdz tie kļūst pilnīgi balti, pēc tam rūpīgi notecina sārmu, sekciju mazgā ūdenī. un ar pinceti pārnes uz mikroskopa stadiju.

Polarizācijas mikroskopijai izmanto parafīna, saldētās un kriostata sekcijas. Nekrāsotas saldētas sekcijas polarizētās gaismas pārbaudei ir iestrādātas glicerīnā. Nefiksētas kriostata sekcijas ir piemērotas polarizācijas mikroskopiskai analīzei tūlīt pēc sagatavošanas. Pateicoties to augstajai jutībai pret kaitīgām sekām dažādi faktori vidē, šīs sekcijas joprojām ir ieteicams fiksēt 10% neitrālā formalīna vai kalcija-formola šķīdumā.

Polarizējošās mikroskopijas rezultātus ietekmē histoloģisko griezumu biezums. Pētot biezus posmus, tiek radīti apstākļi dažādu anizotropu struktūru uzlikšanai vienu virs otras. Turklāt pētāmo konstrukciju anizotropās īpašības var mainīties pie dažādiem slāņu biezumiem, tāpēc īpaši salīdzinošajos pētījumos ir ļoti svarīgi nodrošināt nemainīgu šķēles biezumu. Ieteicamais maksimālais šķēles biezums nedrīkst pārsniegt 10 µm.

Vēl viens priekšnoteikums ir rūpīga sekciju deparafinēšana, jo nenoņemtie parafīna atlikumi rada izteiktu anizotropijas efektu, apgrūtinot izpēti. Parafīns īpaši ilgi uzkavējas uz eritrocītiem un šūnu kodoliem. Lai pilnībā noņemtu parafīnu no sekcijām, ieteicams veikt to turpmāko apstrādi.

• Ksilols 30 min
• Alkohols 100% 5 min
• Metanola un hloroforma maisījums (1:1) 50 °С 24 h
• Alkohols 100% 5 min
• Alkohols 70% 10 min Ūdens

Jāpatur prātā arī tas, ka sekcijas, kas pakļautas polarizācijas mikroskopijai, nedrīkst nonākt saskarē ar fenoliem (piemēram, tās nevar iztīrīt karbonskābē).

Plašāku informāciju par polarizējošo mikroskopiju un kompensatoru izmantošanu var atrast (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).

Ja jums ir kādi jautājumi par polarizējošo mikroskopiju, lūdzu, sazinieties ar Mikroskopijas skolu.

No visām dažādajām mikroskopijas ierīcēm polarizējošie mikroskopi ir tehniski vissarežģītākie. Šāda uzmanība ierīces dizainam attiecībā uz izgatavojamību ir saistīta ar nepieciešamību iegūt attēlu augstākā kvalitāte, ko tieši ietekmē mikroskopa optisko un apgaismojuma daļu dizains. Mikroskopijas polarizācijas ierīču galvenā pielietojuma joma ir minerālu, kristālu, sārņu, anizotropu priekšmetu, tekstilizstrādājumu un ugunsizturīgo izstrādājumu, kā arī citu materiālu, kas raksturojas ar divkāršā laušana. Pēdējais princips ir pamats attēla veidošanai tādās mikroskopijas ierīcēs, kurās pētāmais paraugs tiek apstarots ar polarizācijas stariem. Šajā gadījumā paraugu anizotropās īpašības parādās pēc staru kūļa virziena maiņas. Šiem nolūkiem polarizējošie mikroskopi ir izstrādāti ar lauka filtriem, kas rotē dažādās plaknēs viens pret otru: analizators griežas par 180 grādiem, bet polarizators griežas par 360. cita veida mikroskopiem.

Parauga izpēte zem polarizējošā mikroskopa sākas ar polarizatora uzstādīšanu mikroskopa apgaismojošajā daļā zem kondensatora, blakus diafragmas diafragmai. Tajā pašā laikā analizators atrodas starp okulāru un objektīvu - aiz pēdējā pa gaismas staru ceļu. Pareizi uzstādot šādu instrumentu mikroskopijai, pēc filtra lauku šķērsošanas redzamais lauks būs vienmērīgi tumšs, veidojot tā saukto ekstinkcijas efektu. Pabeidzot ierīces iestatījumus, testa paraugs tiek fiksēts uz skatuves un tiek veikta tā izpēte. Polarizējošo mikroskopu posmi ir centrēti attiecībā pret optisko asi un ir pagriežami par 360 grādiem, un līdzīgās ierīcēs laboratorijas un pētniecības vajadzībām tiem ir arī nonija. Polarizējošo mikroskopu optika un apgaismojuma sistēma ir augstākās kvalitātes un ar tādu precizitāti, kas ļauj iegūt skaidrāko attēlu bez kropļojumiem. Bieži vien ierīču komplekts paraugu pētīšanai polarizētā gaismā ietver kompensatoru un Bertrāna objektīvu. Pirmais ļauj efektīvi izpētīt minerālu struktūru, bet objektīvs - palielināt un fokusēt novērošanas zonu, kad pēc skatuves pagrieziena parādās izmaiņas attēlā. Mūsdienās tirgū ir trīs galvenie šādu ierīču veidi mikroskopijai - tie ir jau minētie pētnieciskie un laboratorijas, kā arī darba polarizējošais mikroskops.

E. Tumšā lauka mikroskopija.

18. Mikroskops sastāv no optiskām un mehāniskām daļām. Kas ir optiskās daļas?

A. Caurule, okulārs, kondensators

B. Revolveris, makro un mikro skrūve, spogulis

C. Revolveris, okulārs

D. Okulārs, kondensators, objektīvs

E. Caurule, okulārs, revolveris

19. Izmantojot ultravioletos starus kā gaismas avotu, palielinās mikroskopa izšķirtspēja. Kādi mikroskopiskie instrumenti izmanto šo gaismas avotu?

A. Darkfield un fluorescējoša

B. Fluorescējošs, ultravioletais

C. Gaismas un elektroniskas

D. Fāzes kontrasts, ultravioletais

E.Polarizējošs, ultravioletais

20. Mikroskops sastāv no mehāniskām un optiskām daļām. Kurai mikroskopa daļai ir diafragma?

A. Okulārs un objektīvs

B. Okulārs un kondensators

C. Caurule un okulārs

D. Lēca un kondensators

E. Caurule, lēca, okulārs

21. Eksperimentā tika izmantoti dzīvi objekti, kuros nepieciešams noteikt virkni ķīmiskās sastāvdaļas izmantojot svarīgu novērošanu. Kāda mikroskopiskās izmeklēšanas metode tiks izmantota?

A. Fāzes kontrasta mikroskopija

B. Elektronu mikroskopija

C. Fluorescences mikroskopija

E Tumšā lauka mikroskopija.

22. Šūnu histoloģiskai izmeklēšanai izmantoti fosfori. Kāda veida mikroskopija tika izmantota šajā gadījumā?

A. Gaismas mikroskopija

B. Elektronu mikroskopija

C. Fluorescences mikroskopija

E. Polarizējošā mikroskopija

E. Tumšā lauka mikroskopija.

23. Pētniekam uzdots iegūt telpiskais attēlojums par pētāmā objekta struktūrām. Ar kādu mikroskopisku ierīci speciālists strādās?

A. Ultravioletā mikroskopija,

B. Fāzes kontrasta mikroskopija,

C. Transmisijas elektronu mikroskopija,

D. Skenējošā elektronu mikroskopija,

E. Polarizējošā mikroskopija

24. Kā gaismas avotu izmanto dzīvsudraba-kvarca lampas. Kāda ir mikroskopa izšķirtspēja ar šo gaismas avotu?

25. Mikroskopa izšķirtspēja ir atkarīga no gaismas avota viļņa garuma. Kāda ir gaismas mikroskopa izšķirtspēja?

26. Pirms histoloģiskā preparāta izpētes uzsākšanas nepieciešams vienmērīgi apgaismot redzes lauku. Kādas mikroskopa daļas tiek izmantotas šim nolūkam?

A. Mikro- un makrovit

B. Kondensators un spogulis

C. Caurule un caurules turētājs

D. Caurule un okulārs

27. Pētniekam tika uzdots izpētīt eritrocītu plazmolemmas ultramikroskopisko struktūru. Kāds mikroskopiskais instruments tiks izmantots?

A. Gaisma

B. Fāzes kontrasts

C. Elektroniskā

D. Polarizēšana

E. Ultravioletais

28. Pētot skeleta muskuļu audus, nepieciešams noteikt audu izo- un anizotropās struktūras. Kāda veida mikroskopija tiks izmantota?

A. Gaisma

B. Fāzes kontrasts

C. Elektroniskā

D. Polarizēšana

E. Ultramikroskopisks

29. Fluorescējošā mikroskopa izšķirtspēja ir atkarīga no gaismas avota viļņa garuma. Ar ko tas ir vienāds?

A. 0,1 µm C. 0,4 µm

H. 0,2 µm D. 0,1 nm

30. Klīniskajā laboratorijā mikroskopiskos izmeklējumus izmanto vispārējās asins analīzes pētīšanai. Kāds mikroskops tam vajadzīgs?

A. Gaisma,

B. Fāzes kontrasts,

C. Elektroniska,

D. Polarizēšana,

E. Ultravioletais.

31. Pētījumam tiek piedāvāts dzīvs objekts ar dabisku luminiscenci. Kāda veida mikroskopija jāizmanto šajā pētījumā?

A. Gaisma

B. Fāzes kontrasts

C. Elektroniskā

D. Polarizēšana

E. Ultravioletais

32. Biopsijas rezultātā iegūts audzēja šūnu materiāls. Ir nepieciešams izpētīt to ultramikroskopisko struktūru. Kāda veida mikroskopija tiek izmantota šajā pētījumā?

A. Gaisma

B. Fāzes kontrasts

C. Elektroniskā

D. Polarizēšana

E. Ultravioletais

2. TĒMA: HISTOLOĢISKĀ TEHNIKA

Gaismas un elektronu mikroskopijas preparātu sagatavošanas pamatprincipi, materiāla ņemšana (biopsija, adatas punkcijas biopsija, autopsija). Objektu fiksācija, dehidratācija, blīvēšana, griezumu sagatavošana uz mikrotomiem un ultramikrotomiem. Mipreparātu veidi - griezums, smērējums, nospiedums, plēves, plāns griezums. Krāsošanas un kontrasta preparāti. Histoloģisko traipu jēdziens.

Mikroskopiskā tehnika.

Galvenie citoloģiskās un histoloģiskās analīzes posmi:

Pētījuma objekta izvēle

Sagatavošana pārbaudei mikroskopā

Mikroskopijas metožu pielietojums

Iegūto attēlu kvalitatīvā un kvantitatīvā analīze

Histoloģiskajā tehnikā izmantotās metodes:

1. Visu mūžu.

2. Pēcnāves.

I MŪŽA METODES

Mūža pētījumu mērķis ir iegūt informāciju par šūnas dzīvi: kustību, dalīšanos, augšanu, diferenciāciju, šūnu mijiedarbību, dzīves ilgumu, iznīcināšanu, reaktīvām izmaiņām dažādu faktoru ietekmē.

Dzīvo šūnu un audu izpēte ir iespējama ārpus ķermeņa (in vitro) vai ķermeņa iekšienē (in vivo).

A. Dzīvu šūnu un audu izpēte kultūrā (in vitro) –

Audzēšanas metode

Ir: a) suspensijas kultūras (barības barotnē suspendētas šūnas), b) audi, c) orgāns, d) vienslānis.

Visizplatītākā ir audu kultivēšanas metode ārpus ķermeņa. Audus var kultivēt īpašās caurspīdīgās hermētiski noslēgtās kamerās. Sterilos apstākļos kamerā ievieto pilienu barotnes. Labākā uzturvielu barotne ir asins plazma, kurai pievieno embriju ekstraktu (ekstrakts no embrija audiem, kas satur lielu daudzumu vielu, kas stimulē augšanu). Tur ievieto arī orgāna vai audu gabalu (ne vairāk kā 1 mm3), kas jākultivē.

Kultivētie audi jāuzglabā tā organisma ķermeņa temperatūrā, kura audi ņemti izpētei. Jo barotneātri kļūst nelietojams (tajā uzkrājas sabrukšanas produkti, ko izdala kultivētie audi), tad ik pēc 3-5 dienām tas jāmaina.

Kultivēšanas metodes izmantošana ļāva atklāt vairākus diferenciācijas modeļus, šūnu ļaundabīgu transformāciju, šūnu mijiedarbību savā starpā, kā arī ar vīrusiem un mikrobiem. Embrionālo audu kultivēšana ļāva pētīt kaulu, skrimšļu, ādas u.c. attīstību.

Kultivēšanas metodei ir īpaša nozīme, veicot eksperimentālus novērojumus ar cilvēka šūnām un audiem, jo ​​īpaši, lai noteiktu dzimumu, ļaundabīgu deģenerāciju, iedzimtas slimības utt.

Metodes trūkumi:

1. Šīs metodes galvenais trūkums ir tas, ka audi vai orgāns tiek izmeklēti izolēti no ķermeņa. Neizjūtot ķermeņa neirohumorālo ietekmi, tas zaudē tai raksturīgo diferenciāciju.

2. Nepieciešamība pēc biežas transplantācijas (ar ilgstošu audzēšanu).

3. Tas pats audu refrakcijas koeficients.

Līdzīga informācija.