záhlaví
2
2
Izolace a čištění proteinů se provádí po etapách.
1. Homogenizace- jedná se o důkladné rozmělnění předmětů biochemického výzkumu do homogenního, tedy homogenního stavu, to znamená, že proteiny procházejí důkladným rozpadem až po destrukci buněčné stěny.
Přitom používají:
A) Nožové homogenizátory válečného typu;
b) tloučkové homogenizátory Potter - Elveheim;
PROTI) kulové a válcové mlýny - pro hustší předměty;
G) metoda střídavého zmrazování a rozmrazování, přičemž k prasknutí buněčné stěny dochází působením ledových krystalků;
E) metoda "dusíkové bomby" - pod vysokým tlakem se články nasytí dusíkem, pak se tlak prudce uvolní, uvolní se plynný dusík, který jakoby exploduje článek zevnitř;
E) Ultrazvuk, různé lisovací metody, trávení buněčných stěn enzymy. Ve většině případů se při homogenizaci uvolňuje teplo, přičemž mnoho proteinů může být inaktivováno, takže všechny postupy probíhají v chladírnách při t 0 nebo se suroviny chladí ledem. Současně je pečlivě kontrolován objem a doba destrukce buněk a také provozní tlak. Ideální homogenizát je takový, který lze dále extrahovat.
2. Extrakce bílkovin, tedy jejich převedení do rozpuštěného stavu; nejčastěji se extrakce provádí současně s mletím.
Extrakce se provádí:
A) rozpuštění v 8-10% solných roztocích;
b) použití tlumivých roztoků s pH od kyselého po slabě alkalické (boritanový, fosfátový, citrátový, tris - pufr: směs trisaminomethanu s NH2 - CH3 + HCl;
PROTI) precipitace proteinů organickými rozpouštědly (ethanol, methanol, butanol, aceton a jejich kombinace), za současného štěpení protein-lipidové a protein-proteinové složky, tedy destrukce HSB.
3. Purifikace a frakcionace proteinů. Po extrakci se směs separuje nebo frakcionuje na jednotlivé proteiny a dále se čistí:
a) vysolování- jedná se o proces srážení bílkovin neutrálními solnými roztoky alkalických a kovy alkalických zemin.
vysolovací mechanismus– přidané anionty a kationty ničí hydratovaný proteinový obal proteinů, což je jeden z faktorů stability proteinových roztoků. Nejčastěji se používají roztoky Na a síranů amonných. Mnoho proteinů se liší velikostí hydratačního obalu a velikostí náboje. Každý protein má svou vlastní vysolovací zónu. Po odstranění vysolovacího činidla si protein zachovává svou biologickou aktivitu a fyzikálně chemické vlastnosti. V klinické praxi se metoda vysolování používá k separaci globulinů (s přídavkem 50% roztoku síranu amonného (NH 4) 2SO 4 vzniká sraženina) a albuminů (s přídavkem 100% roztoku síranu amonného (NH 4) 2SO 4 vzniká sraženina).
Vysolování je ovlivněno:
1) povaha a koncentrace soli;
2) pH prostředí;
3) teplota.
Hlavní roli hrají valence iontů. Účinek soli se proto hodnotí iontovou silou roztoku μ:
, to znamená, že iontová síla roztoku (μ) je rovna součinu ½ koncentrace každého iontu (C) a druhé mocniny jeho mocenství (V).
Kohnova metoda je druh vysolování. Současně probíhá extrakce a vysrážení složek. Postupnou změnou teploty (obvykle nízká t o -0 + 8 o C), pH roztoku a koncentrovaného etanolu se postupně izoluje z krevní plazmy až 18 proteinových frakcí.
Kohnova metoda používá se ve farmaceutické výrobě při výrobě krevních náhražek;
b) chromatografické metody. Za zakladatele vývoje chromatografických metod analýzy je považován ruský vědec Michail Tsvet (1903). V současné době existuje mnoho jeho odrůd. Metoda je založena na schopnosti látek specificky se adsorbovat na adsorbent uzavřený v koloně nebo umístěný na nějakém nosiči. Když k tomu dojde, separace analyzovaných látek a jejich koncentrace v přesně definované adsorpční vrstvě. Poté kolonou procházejí příslušné eluenty (rozpouštědla), které oslabují adsorpční síly a vymývají adsorbované látky z kolony. Látky se shromažďují ve sběrači frakcí.
Základem chromatografie je distribuční poměr, což se rovná poměru koncentrace látky v Mobilní fáze na koncentraci látky v stacionární fáze(nebo stacionární fáze).
Stacionární stacionární fáze– může být pevná nebo kapalná nebo směs pevné a kapalné látky.
Mobilní fáze- kapalný nebo plynný, protéká stacionárním nebo jím prochází.
V závislosti na typu stacionární a mobilní fáze existují různé modifikace chromatografické analýzy.
Adsorpce- je založena na různém stupni adsorpce proteinů adsorbentem a jejich rozpustnosti v odpovídajícím rozpouštědle.
Použité adsorbenty jsou kyselina křemičitá, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, dřevěné uhlí. Adsorbent ve formě suspenze s rozpouštědlem (obvykle s tlumivým roztokem) je plněn do kolony (skleněná vertikální trubice). Vzorek je nanesen na kolonu, poté přes ni prochází rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel.
Separace je založena na tom, že látky s vyšší distribucí K. (B) pohybující se podél kolony vyšší rychlostí. Frakce se odebírají pomocí sběrače frakcí.
Rozdělovací chromatografie- na základě rozdělení směsi bílkovin mezi dvě kapalné fáze. Separace může probíhat na speciálním chromatografickém papíru, stejně jako v kolonách, jako při adsorpci. Pevná fáze v tomto případě slouží pouze jako nosič pro kapalnou stacionární fázi. Chromatografický papír má tu vlastnost, že zadržuje vodu mezi svými celulózovými vlákny. Tato voda je stacionární stacionární fáze. Když se nevodné rozpouštědlo (mobilní fáze) pohybuje papírem působením kapilárních sil, molekuly látky uložené na papíru se rozdělí mezi dvě fáze v souladu s jejich distribučním koeficientem. Čím vyšší je rozpustnost látky v mobilní fázi, tím dále se bude pohybovat podél papíru spolu s rozpouštědlem.
V případě distribuce chromatografie na koloně jsou nosiči celulóza, škrob, silikagel atd., stacionární fáze je voda. Při aplikaci na kolonu se látky směsi pohybují po koloně různými rychlostmi, přičemž se bere v úvahu Krasp.
Rf pro každou sloučeninu za standardních podmínek je konstantní hodnota.
Iontoměničová chromatografie – založená na přitahování opačně nabitých částic. K tomu se používají různé iontoměničové pryskyřice: katexové pryskyřice obsahují záporně nabité skupiny - sulfonované styreny a CMC, které přitahují kladně nabité ionty studovaných látek. Říká se jim také kyselé iontoměniče.
Aniontoměničové pryskyřice nebo bazické iontoměniče obsahují kladně nabité skupiny, které přitahují záporně nabité proteinové molekuly.
Trimethylaminostyren je derivátem styrenů a celulózy.
V závislosti na q proteinů, které mají být separovány, se používají vhodné iontoměniče, se kterými určité proteiny interagují, zatímco jiné volně opouštějí kolonu. Proteiny „vysrážené“ na koloně se odstraní pomocí koncentrovanějších solných roztoků nebo změnou pH eluentu.
Afinitní chromatografie (neboli afinitní chromatografie) je založena na principu selektivní interakce proteinů nebo jiných makromolekul se specifickými látkami imobilizovanými na nosičích - ligandech (tím může být koenzym, pokud je izolován enzym, protilátka, antigen apod. Vzhledem k vysoké specifitě proteinů se na imobilizované ligandy váže pouze jeden protein ze směsi. Při změně pH směsi se mění nebo vymývá pufrem.
Výhodou je možnost izolovat danou látku vysokého stupně čistoty v jednom kroku.
Metoda gelové filtrace nebo metoda molekulárního síta je typem permeační chromatografie.
Separace molekul podle velikosti a tvaru je založena na vlastnostech molekulového síta, které má mnoho porézních materiálů, jako jsou organické polymery s trojrozměrnou síťovou strukturou, která jim dává vlastnosti gelů. Gelová filtrace je separace látek pomocí gelů na základě rozdílů ve velikosti molekul (sepharose, sephadex, sephacryl, biogels atd.). Působením epichlorhydrinu se polysacharidové řetězce dextranu (syntetizované mikroorganismy) zesíťují do síťové struktury, stávají se nerozpustnými ve vodě, ale zachovávají si k ní vysokou afinitu. Díky této hydrofilitě výsledná zrna (nazývaná Sephadex) silně nabobtnají a vytvoří gel, který se naplní do kolony. Metoda je založena na tom, že velké molekuly neproniknou do vnitřní vodné fáze a menší molekuly nejprve proniknou do pórů „síta“, jako by v nich uvízly, a proto se pohybují nižší rychlostí. V souladu s tím jsou proteiny s vyšším Mr jako první do přijímače. V poslední době se jako molekulární síto v permeační chromatografii stále více používají porézní skleněné kuličky.
Elektroforetická metoda v biochemii je založena na rozdílu v rychlosti pohybu molekul v elektrickém poli (aminokyseliny, peptidy, proteiny, nukleové kyseliny).
Rozdíl rychlosti závisí na:
1. na q molekuly: čím větší je pohyblivost molekul, tím větší je celkové q. Hodnota q závisí na pH;
2. na velikosti molekul: čím větší molekuly, tím menší je jejich pohyblivost. To je způsobeno nárůstem třecích sil a elektrostatických interakcí velkých molekul s prostředím;
3. o tvaru molekul: molekuly stejné velikosti, ale různých tvarů, například fibrily a proteinové globule mají různé rychlosti. To je způsobeno rozdíly ve třecích silách a elektrostatické interakci.
Typy elektroforézy
a) Izoelektrická fokusace. K separaci dochází na svislém sloupci ve stupních. jak pH, tak napětí. Pomocí speciálních nosičů amfolytů se v koloně zakládají kroupy. pH od 0 do 14. Do kolony se umístí směs látek a připojí se elektrický proud. Každá ze složek se přesune do té části kolony, kde hodnota pH odpovídá jejímu izoelektrickému bodu, a tam se zastaví, to znamená, že je zaostřena.
Výhoda: odděluje, čistí a identifikuje proteiny v jednom kroku. Metoda má vysoké rozlišení (0,02 pí).
b) Izotachoforéza je elektroforéza na podpůrném médiu. Po zapnutí elektrického proudu se ionty s nejvyšší pohyblivostí přesunou k odpovídající elektrodě jako první, přičemž nejnižší - poslední, mající střední pohyblivost - jsou umístěny uprostřed.
c) Disková elektroforéza - přístroj se skládá ze dvou nádob s pufrem - horní a spodní, spojených vertikálními trubičkami obsahujícími gel s různými póry. Jak se ionizované částice pohybují působením elektrického proudu. Vyšší poréznost je v horní části gelu.
d) Imunoelektroforéza - metoda kombinující elektroforézu s imunodifuzí (k průkazu antigenů v komplexních fyziologických směsích). Směs antigenů a směs protilátek jsou umístěny kolmo na sebe na speciální nosič. Po zapnutí elektrického proudu se rozdělí na jednotlivé látky a difundují na gelovém nosiči. V místě setkání antigenu s odpovídající protilátkou nastává specifická precipitační reakce ve formě oblouku. Počet vytvořených oblouků odpovídá počtu antigenů.
Metody stanovení Mr proteinů
Na velký počet proteinů, chemické složení a sekvence aminokyselin nebyly stanoveny (1010–1012 proteinů), proto Mr. Používají se k tomu různé metody.
a) Sedimentační metoda - stanovení Mr se provádí ve speciálních odstředivkách (první odstředivku navrhl švédský biochemik Svedberg), ve kterých je možné vytvořit odstředivé zrychlení, které je více než 200 tisíc i vícenásobkem zrychlení zemské gravitace. Mr je určeno z V sedimentace molekul. Jak se molekuly pohybují ze středu na periferii, ostrá hranice rozpouštědlový protein. Rychlost sedimentace je vyjádřena pomocí sedimentační konstanty (S):
kde V je rychlost pohybu rozhraní protein-rozpouštědlo (cm/s);
je úhlová rychlost rotoru (rad/s);
je vzdálenost od středu rotoru ke středu buňky s roztokem proteinu (cm).
Hodnota sedimentační konstanty S, která je rovna 110–13 C, je podmíněně brána jako 1 a nazývá se 1 Svedberg (S). S pro proteiny se pohybuje od 1-50 S, někdy až 100 S.
Mr proteinů je určen Svedbergovou rovnicí:
kde R je univerzální plynová konstanta;
T - absolutní teplota od Kelvina;
S je sedimentační konstanta;
D je difúzní koeficient;
je hustota rozpouštědla;
V je částečný měrný objem plynu.
Tato metoda je drahá kvůli použití zařízení.
Jednodušší a levnější:
b) Gelová filtrace v tenké vrstvě Sephadexu.
Délka proteinové dráhy (v mm) je logaritmická k Mr.
X - Mr požadovaného proteinu na kalibračním grafu.
c) Disková elektroforéza v polyakrylamidové vrstvě - existuje také vztah mezi logaritmem Mr kalibračních proteinů a délkou jejich dráhy.
Metody stanovení homogenity proteinů
Stupeň čistoty izolovaného proteinu je určen:
- ultracentrifugace;
- metoda diskové elektroforézy;
- různé imunochemické metody;
- stanovení rozpustnosti bílkovin (metoda Northrop) je založeno na fázovém pravidle, podle kterého rozpustnost čisté látky za daných experimentálních podmínek závisí pouze na teplotě, nezávisí však na koncentraci látky v pevné fázi.
Pokud je protein homogenní, získáme jednu inflexi na grafu (a), pokud jsou přítomny proteinové nečistoty (b, c), dostaneme několik inflexí saturační křivky. Všechny proteiny mají své vlastní individuální křivky rozpustnosti.
480 rublů. | 150 UAH | $7,5", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Práce - 480 rublů, doprava 10 minut 24 hodin denně, sedm dní v týdnu a svátky
Kaisheva Anna Leonidovna Hmotnostně spektrometrická identifikace proteinů a proteinových komplexů na čipech mikroskopu atomárních sil: disertační práce... kandidát biologických věd: 03.01.04 / Kaisheva Anna Leonidovna; [Místo ochrany: Nauch.-issled. in-t biomed. chemii je. V.N. Orechovich RAMS].- Moskva, 2010.- 104 s.: nemocný. RSL OD, 61 10-3/1308
Úvod
Kapitola 1 Přehled literatury 10
1.1. Analýza vědeckých a technických podkladů v oblasti vysoce citlivých proteomických technologií
1.2 Charakterizace viru hepatitidy C 20
1.2.1 Metody diagnostiky hepatitidy C 22
1.2.2 Sérologické proteinové markery hepatitidy C 25
Kapitola 2. Materiály a metody 28
2.1 ACM čipy 28
2.2 Proteinové přípravky a činidla 29
2.3 Analýza AFM 30
2.4 Příprava vzorku pro hmotnostní spektrometrickou analýzu 31
2.5 Hmotnostní spektrometrická analýza 33
2.5.1 MALDI-MS analýza proteinů na povrchu AFM čipu 33
2.5.2 ESI-MS analýza proteinů na povrchu AFM čipu 34
Kapitola 3 Výsledky a diskuse 35
3.1 MS - identifikace proteinů zachycených "chemickým rybolovem" na povrchu AFM čipu z roztoku analytu
3.2 MS identifikace proteinů biospecificky zachycených na povrchu AFM čipu z roztoku analytu
3.3 MS identifikace proteinů na povrchu AFM čipu biospecificky izolovaného ze vzorků krevního séra
Závěr 83
Literatura
Úvod do práce
Relevance práce.
Jednou z prioritních oblastí moderní biochemie je vytvoření efektivních analytických metod pro proteomickou analýzu, jejímž hlavním úkolem je detekce a inventarizace proteinů v těle, studium jejich struktury a funkcí a identifikace proteinových interakcí. Řešení tohoto problému umožní vytvořit nové systémy pro diagnostiku nemocí a jejich léčbu. Standardní metody moderní proteomické analýzy jsou založeny na separaci vícesložkových proteinových směsí pomocí chromatografie, elektroforéze v kombinaci s hmotnostními spektrometrickými metodami (MS) pro identifikaci proteinů. Navzdory nesporné výhodě standardní MS analýzy, pokud jde o rychlost a spolehlivost identifikace proteinových molekul, má značná aplikační omezení kvůli nízké
koncentrační citlivost analýzy na úrovni 10" "10" M a vysoký dynamický rozsah obsahu bílkovin v biologickém materiálu. Přitom naprostá většina funkčních proteinů, včetně biomarkerů tak společensky významných onemocnění, jako jsou virové hepatitidy B a C, nádorové markery apod., je v krevní plazmě přítomna v koncentračním rozmezí 10" Mi méně.
Jedním ze způsobů, jak překonat toto metodologické omezení koncentrační citlivosti analýzy, je použití biomolekulárních detektorů, které umožňují detekci jednotlivých molekul a jejich komplexů a teoreticky nemají žádná omezení koncentrační citlivosti. Biomolekulární detektory zahrnují detektory založené na nanotechnologických zařízeních, jako jsou mikroskopy atomárních sil (AFM), nanodrátové detektory, nanopóry a řada dalších detektorů. Jedinečná citlivost AFM detektorů umožňuje vizualizovat jednotlivé molekuly proteinů a počítat jejich počet. Při použití AFM jako biomolekulárního detektoru je nutné použít speciální čipy, které umožňují koncentraci makromolekul biologického analytu z velkého objemu inkubačního roztoku na omezený povrch čipu. Studované proteinové objekty mohou být koncentrovány na povrchu čipu jak díky fyzikální nebo chemické adsorpci, tak díky biospecifickým interakcím (AFM-biospecific fishing).
V praxi je však omezením použití nanodetektorů na bázi AFM to, že i přes možnost vizualizace jednotlivých molekul proteinů na povrchu čipu je takové detektory nejsou schopny identifikovat, což je důležité zejména při studiu komplexních proteinových směsí včetně biologického materiálu. Proto se vývoj metody analýzy, která doplní možnosti metody AFM, jeví jako naléhavý úkol. Dosud jedinou proteomickou metodou, která umožňuje jednoznačnou a spolehlivou identifikaci proteinových molekul, je MS analýza. V disertační práci byl vyvinut přístup, který kombinuje vysokou citlivost metody AFM a spolehlivou MS identifikaci pro detekci proteinů a jejich komplexů z roztoku analytu.
Účel a cíle studie.
Účelem této práce byla hmotnostně spektrometrická identifikace proteinů a proteinových komplexů detekovaných v biomateriálu pomocí mikroskopie atomárních sil.
K dosažení tohoto cíle byly vyřešeny následující úkoly:
Bylo vyvinuto schéma MS identifikace proteinů zachycených na povrchu čipu AFM pomocí chemického nebo biospecifického rybolovu;
Byly vyvinuty podmínky pro enzymatickou hydrolýzu proteinů na povrchu AFM čipu pro následnou identifikaci MS;
Byla provedena MS-identifikace modelových proteinů na povrchu AFM čipu;
Byla provedena MS-identifikace proteinů na povrchu AFM čipu biospecificky izolovaného z vícesložkové směsi (séra).
Vědecká novinka díla .
V disertační práci bylo vyvinuto schéma, které umožňuje MS identifikaci proteinů a proteinových komplexů zachycených z roztoku nebo vícesložkové směsi na povrchu AFM čipu. K tomu byly zvoleny optimální podmínky pro přípravu vzorku, včetně způsobu hydrolýzy (teplota, vlhkost, složení trypsinolytické směsi, doba trypsinolýzy) proteinových molekul kovalentně a nekovalentně imobilizovaných na povrchu AFM čipu. Zvláštností této práce bylo, že ve srovnání se standardními proteomickými protokoly enzymatické hydrolýzy se příprava vzorků pro MS analýzu neprováděla v roztoku, ale na omezené ploše.
povrch čipu. Vyvinuté schéma umožnilo efektivně provádět MS analýzu a identifikovat jak jednotlivé proteiny, tak proteinové komplexy na povrchu AFM čipu. MS analýza proteotypových peptidů studovaných proteinů byla provedena pomocí dvou typů ionizace (MALDI A EST) a dva typy detektorů (TOF a iontová past). Vyvinuté schéma pro spojení AFM-biospecific fishing a MS bylo také úspěšně testováno pro detekci proteinových markerů virové hepatitidy C (HCV) (HCVcoreAg a E2) ve vzorcích krevního séra.
Praktický význam práce .
Výsledky této práce umožňují vytvořit vysoce citlivé proteomické metody bez použití značek a dalších postupů přípravy vzorků pro detekci proteinů nacházejících se v nízkých koncentracích v biologickém materiálu, včetně krevního séra. Byl navržen přístup založený na mikroskopii atomárních sil a hmotnostní spektrometrii, který umožní detekovat a identifikovat proteinové markery viru hepatitidy C v lidském krevním séru.
Přístup lze využít při vývoji zaměřeném na vytváření nových diagnostických čipů, hledání biomarkerů širokého spektra společensky významných onemocnění.
Schválení práce.
Hlavní výsledky studie byly prezentovány na „1., 2. a 3. mezinárodním nanotechnologickém fóru“ (Moskva, 2008-2010); „IV. kongres Ruské společnosti biochemiků a molekulární biologové“, Novosibirsk, 2008; na mezinárodním kongresu „Human Proteome“, Amsterdam, 2008; na mezinárodním kongresu „Human Proteome“, Sydney, 2010.
Publikace.
Struktura a rozsah disertační práce.
Disertační práce se skládá z úvodu, literární rešerše, popisu výzkumných materiálů a metod, výsledků výzkumu a jejich diskuse, závěru, závěrů a seznamu literatury. Práce je prezentována na 104 stranách, ilustrována 33 obrázky a 4 tabulkami, seznam literatury tvoří 159 titulů.
Analýza vědeckých a technických podkladů v oblasti vysoce citlivých proteomických technologií
Jedna z prioritních oblastí v moderní věda je objevit a objasnit roli různých typů proteinů v těle, stejně jako pochopení molekulárních mechanismů, které vedou ke vzniku nemocí.
I přes neustálé zlepšování proteomických metod zůstává počet nově objevených biomarkerů onemocnění téměř/nezměněn poslední dekáda. Důvodem je skutečnost, že koncentrační limit detekce tradičních proteomických metod nepřesahuje 10"9 M. Zároveň je pro proteomiku důležité vyvíjet nové analytické přístupy pro identifikaci proteinů v nižším koncentračním rozsahu, zejména molekul proteinů s nízkou kopií (s koncentrací 10"13 M nebo méně), včetně biomarkerů v biologickém materiálu. Protože lze předpokládat, že právě v těchto koncentračních rozmezích se nacházejí proteinové markery většiny onemocnění.
Jednou z aktivně se rozvíjejících oblastí, která umožňuje poněkud zvýšit koncentrační citlivost analýzy, je vytváření analytických komplexů na bázi nanochromatografických a nanoelektroforetických systémů kompatibilních s hmotnostními spektrometry.
Nanochromatografický systém v kombinaci s hmotnostní spektrometrií a ionizací typu elektrosprej umožnil zvýšit citlivost detekce proteinů o dva řády oproti chromatografii vysoké rozlišení(HPLC). Limit koncentrační citlivosti takových konjugovaných systémů je omezen citlivostí fáze elektroforézy/chromatografie a nepřesahuje 10-12 M pro jednotlivé proteiny (například pro cytochrom C a bradykinin).
V současné době se chromatografické metody rozvinuly do samostatných nezávislých oblastí - SELDI MS analýza (povrchová laserová desorpce a ionizace/hmotnostní spektrometrie s časem letu), metody lovu proteinů pomocí magnetických mikročástic. V těchto technologiích jsou hydrofobní nebo nabité povrchy SELDI-čipů. nebo magnetické mikročástice, kombinace s hmotnostní spektrometrickou analýzou, se úspěšně používají: pro? detekce a identifikace jako samostatné typy; proteiny a pro profilování proteinů/peptidů krevního séra [c, 8; \b, 15]. SEbDIi МЄ je: výkonný přístup, který vám umožní studovat biomateriál prostřednictvím adsorpce biomolekul (proteinů, peptidů) na chemicky aktivované? povrchu (kationtové/aniontoměničové čipy) s následnou hmotnostní spektrometrickou analýzou adsorbovaných: molekul:. je použit přístup SEEDPMЄ; pro proteinové profilování biomateriálu; a v poslední době: používá se jako „diagnostika pomocí proteomických čárových kódů“ [17].. Podstatou takové „diagnostiky čárových kódů“ je identifikovat? vlastnosti proteinového profilu biologického vzorku; spojené s konkrétní nemocí: Ano, známo; co d na. rakovinných onemocnění, „proteomický čárový kód“ biomateriálu je výrazně odlišný od toho u zdravých1 skupin“ jedinců: Proto kontrola nad změnami v proteinu; složení biomateriálu se může stát základem pro včasnou diagnostiku onemocnění. Na; dnes pomocí přístupu SELDI? Značky МЄ byly identifikovány. rakoviny žaludku, vaječníků, prostaty a prsu: Omezením této metody5 je neschopnost identifikovat proteiny s vysokým rozlišením a přesností, což je zvláště důležité u; analýza vícesložkových směsí, jako je biologický materiál.
Kromě problému nízké koncentrační citlivosti stávajících analytických systémů se kamenem úrazu proteomické analýzy biologického materiálu stal široký dynamický rozsah koncentrací proteinů, zejména v krevním séru, který se pohybuje od 1 (GM M) až po jednotlivé molekuly proteinů. Proteiny s vysokou kopií (hlavní) v takových systémech brání detekci a identifikaci proteinů s nízkou kopií (minoritních) v takových systémech.
Problém širokého koncentračního rozmezí proteinů v biomateriálu lze řešit aplikací metod pro ochuzování krevního séra z hlavních proteinových frakcí, metod separace vícesložkových směsí a nanotechnologických metod založených na biospecifickém a chemickém lovu proteinových molekul analytu z komplexních směsí na povrchu čipů do různých biosenzorů nebo na aktivovaném povrchu magnetických mikrokuliček.
Tradičně se k separaci vícesložkových proteinových směsí používá jednorozměrná, častěji dvourozměrná gelová elektroforéza. Princip separace proteinů pomocí dvourozměrné gelové elektroforézy je založen na rozdílu mezi proteiny podle hodnot jejich izoelektrických bodů Hf molekulových hmotností. V proteomice se tyto přístupy využívají pro proteinové mapování biomateriálu (tkáň, krevní plazma atd.). Kombinace 1D a/nebo 2D elektroforézy s hmotnostní spektrometrií umožňuje identifikaci separovaných a vizualizovaných proteinů. Postup dvourozměrné gelové elektroforézy však stále není automatizovaný, je poměrně komplikovaný a časově náročný na provedení, vyžaduje vysokou kvalifikaci obsluhy a výsledky analýzy jsou často špatně reprodukovatelné.
Výhodnější ve srovnání s dvourozměrnou elektroforézou je postup pro separaci proteinů vysokoúčinná chromatografie (HPLC); což je automatizovaný postup, který vám umožňuje odstranit proteiny s vysokým počtem kopií ze složité směsi za účelem následné identifikace proteinů s nízkým počtem kopií.
Aby bylo možné přímo identifikovat proteiny v komplexních směsích, lze k hmotnostnímu spektrometru připojit chromatografickou kolonu. Intaktní proteiny však prakticky nejsou přístupné vysoce kvalitní separaci pomocí HPLC, protože během analýzy denaturují (kvůli nízkým hodnotám pH média a vysoké koncentraci organických rozpouštědel) a také kvůli nízké přesnosti hmotnostní spektrometrické analýzy je přímá identifikace většiny intaktních proteinů, zejména těch s molekulovou hmotností přesahující 10 kDa, často nemožná. Přesnost analytického měření lze zlepšit hydrolytickým štěpením proteinů na peptidové fragmenty, molekulová hmotnost od 700 do 4000 Da pomocí proteáz; jako je trypsin (technologie zdola nahoru). Pro dosažení kvalitativní separace proteinů ve směsi se používá kombinace několika chromatografických postupů, tzv. multidimenzionální chromatografie.
Metody diagnostiky hepatitidy
V současné době se pro proteinovou diagnostiku hepatitidy C používají testovací systémy pro detekci anti-HCVcore. První testy ELISA detekující přítomnost anti-HCVcore protilátek byly dostupné na počátku 90. let, ale měly nízkou citlivost a selektivitu. Později, koncem 90. let, se objevila nová generace anti-HCVcore ELISA testů, která měla poměrně vysokou senzitivitu asi 95-99 % a dokázala detekovat HCV několik měsíců po infekci.
Například v roce 1996 se na ruském trhu objevily testovací systémy vyvinuté společnostmi Vector-Best (Novosibirsk) a Diagnostic Systems (Nižnij Novgorod) pro detekci protilátek - anti-HCV třídy IgM. Úloha IgM protilátek v sérodiagnostice není dostatečně prozkoumána, nicméně některé studie prokázaly význam tohoto markeru pro detekci chronické hepatitidy C. Bylo také stanoveno, že korelace mezi detekcí virové RNA a anti-HCV IgM u pacientů je 80–95 %. K určení fáze vývoje virové hepatitidy C Afanasyev A.Yu. et al., použili koeficient odrážející poměr anti-HCV IgG k anti-HCV IgM v krvi pacientů. K dnešnímu dni bylo vyvinuto mnoho systémů ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), které detekují cirkulující protilátky proti mnoha epitopům viru hepatitidy E.
Ve většině lékařských zařízení v Moskvě se provádí moderní laboratorní diagnostika: virové hepatitidy E; v souladu se stávajícími nařízeními Ministerstva zdravotnictví Ruské federace a Ministerstva zdravotnictví: Moskva a má stanovit imunoglobuliny? třídy G na virus hepatitidy E (anti-HGV IgG) v krevním séru pacientů. Identifikace tohoto markeru umožňuje posoudit přítomnost současné nebo minulé infekce.
Nevýhody metod; Detekce na bázi EEISA jsou kromě nízké senzitivity (více než GO "12 M)j způsobeny také falešnou detekcí, virová hepatitida E u pacientů - v důsledku postinfekční imunity,., zkřížená reaktivita protilátek, jakož i nedostatečná citlivost v akutním období fáze BFG. tsii1markery "hepatitida E .
Další skupina metod pro detekci virové hepatitidy v séru: krev is-B_registration, RNA BEI pomocí PCR; Definice RNA. BFG metody; GAD nelze použít jako primární test pro - potvrzení nebo vyloučení; diagnóza; Ale; Možná; Užitečné pro potvrzení diagnózy: Diagnóza 1 BFG se provádí analýzou 5' nekódující oblasti RNA. Výsledky analýzy se však u různých genotypů BFG liší.
Na ruském trhu se objevily biologické mikročipy, které umožňují provádět - BFG genotypizaci a - stanovit účinné antivirové schéma; terapie. Tento biočip je oligonukleotidový čip pro genotypizaci BFG na základě analýzy oblasti NS5B. Získané výsledky ukazují na schopnost biočipu identifikovat všech 6 HCV genotypů a 36 subtypů, včetně nejvirulentnějších a lékově rezistentních forem.
Metody PCR analýzy jsou na jednu stranu supersenzitivní a umožňují detekci a amplifikaci signálu pouze z jedné molekuly RNA ve vzorku, ale na druhou stranu se tyto metody vyznačují falešně pozitivními výsledky v důsledku náhodné kontaminace vzorků, falešně negativními výsledky v důsledku vysoké mutability viru a relativně vysokou cenou analýzy. Dokonce i u stejné osoby se hladiny HCV RNA mohou periodicky měnit více než milionkrát, což vede k falešně negativním výsledkům, pokud jsou nízké? replikace viru nebo pokud virus přetrvává v tkáních, aniž by se dostal do krve. Výsledky kvantitativního stanovení RIG, HCV v různých laboratořích se dostatečně neshodují.
Pro včasnou detekci biomateriálu virové hepatitidy C Bt mají zvláštní význam proteinové antigeny HCV vzhledem k tomu, že se objevují1 v krevním séru o několik týdnů dříve, ještě před rozvinutím plnohodnotné imunitní odpovědi organismu.
Povrchový antigen HCVcoreAg viru hepatitidy C je hlavním markerem infekce virem hepatitidy C. Zjišťuje se 16 týdnů před výskytem protilátek v krvi v důsledku imunitní odpovědi organismu a před rozvojem klinických příznaků, přičemž je zaznamenáván jak v akutní, tak v chronické fázi onemocnění. Existuje pouze jeden zahraniční komerční produkt („Ortho Clinical Diagnostics“) pro ELISA diagnostiku hepatitidy C v akutní fázi na základě průkazu HCVcoreAg.
Strukturní protein HCVcoreAg sestávající ze 121 aminokyselinových zbytků se nachází na N-konci polypeptidu a vzniká vlivem buněčných proteáz. K první proteolytické hydrolýze dochází mezi zbytky 191 a 192 (místo C1) a vede k tvorbě E1 glykoproteinu. Druhé místo štěpení (C2) je mezi aminokyselinami 174 a 191. Odpovídající produkty štěpení se nazývají p21 a p23. Analýza exprese v řadě savčích buněk ukázala, že p21 je hlavním produktem, zatímco p23 se nachází v malých množstvích. Je možné, že štěpení v místech C1 a C2 je vzájemně související proces, protože p21 se tvoří za podmínek, kdy není pozorována hydrolýza na G2 [D45]. HCVcoreAg je hlavní protein vázající RNA, který zřejmě tvoří virový nukleokapsid. Biochemické vlastnosti tohoto proteinu jsou stále špatně charakterizovány. AFM studie částic viru hepatitidy C umožnily získat obraz kapsidy HCV.
ASM čipy
V experimentální části práce byly použity dva typy AFM čipů. První typ byl použit pro MS identifikaci modelových proteinů na povrchu AFM čipů. Tyto čipy byly substráty s funkčně aktivními chemickými skupinami (dále jen AFM čipy s chemicky aktivovaným povrchem), na kterých byly studované molekuly zachyceny a nevratně imobilizovány díky kovalentním vazbám, tzv. postup „chemical fishing“. Druhý typ AFM čipů byl použit pro MS identifikaci na jejich povrchu proteinů biospecificky izolovaných z roztoku analytu. Biologické sondy byly dříve imobilizovány na povrchu těchto čipů – v pracovních oblastech. Jako biologické sondy byly použity monoklonální protilátky proti markerovým proteinům virové hepatitidy B a C (BFB a BFC) nebo aptamerr proti proteinu gpl20 a trombinu. Pro biospecifické rybolovné postupy byly inkubovány čipy s kovalentně imobilizovanými molekulami sondy. v % roztoku analytu obsahujícího pouze detekovatelný protein nebo vzorky krevního séra
Pro splnění úkolu MS identifikace modelových proteinů kovalentně imobilizovaných na povrchu AFM čipů prvního typu byly v práci použity: avidin (Agilent, USA), HSA (Agilent, USA), P450 VMZ (laskavě poskytl profesor A.V. Munro, University of Manchester, UK), trombin (Sigma, USA a anti-USA), a-FP; Pro splnění úkolu MS identifikace proteinů na povrchu AFM čipů druhého typu, biospecificky izolovaných z roztoku analytu, byly jako molekuly sondy použity monoklonální protilátky (MAB): anti-HCVcore (Virogen, USA), anti-HBVcore (Research Institute of Molecular Diagnostics, Moskva), anti-HBsAg (Cíl Aldevogen, HCVAg, molekula HB, HB ) a HBsAg (Aldevron, USA), gpl20 (Sigma, USA), troponin (USBio, USA).
Dále byly v práci použity tyto látky: acetonitril, isopropanol, kyselina mravenčí, destilovaná voda (Merck, USA), kyselina trifluoroctová (TFA), hydrogenuhličitan amonný (Sigma, USA), kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (HCCA), kyselina dihydroxybenzoová-(DHB) (Bruker Daltongaics, Německo). (Bruker Daltongaics, Německo).
Vzorky krevního séra pro studii AFM poskytlo oddělení infekčních nemocí u dětí Ruské státní lékařské univerzity, Ústřední výzkumný ústav epidemiologie Rospotrebnadzor, MNIIEM "n. Gabrichevsky: Přítomnost částic viru hepatitidy C (HCV) ve vzorcích krevního séra byla potvrzena pomocí metody polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí systému výzkumu Amplisens of Health Institute of Epidemiral Monitor v Moskvě (Camplisens of Health Institute of Epidemiral Monitor).
AFM analýza byla provedena v Laboratoři nanobiotechnologie, IBMC RAMS. Výpočet proteinů a komplexů antigen/protilátka na povrchu čipu AFM byl proveden na základě korelace výšek odpovídajících obrazů proteinů a jejich komplexů, měřených pomocí AFM, podle metody popsané v . Byl používán ACM NTEGRA (NT-MDT, Rusko). AFM měření byla provedena v semikontaktním režimu. Jako sondy byly použity konzoly řady NSG10 od NT-MDT. Typický poloměr zakřivení jehel byl 10 nm a rezonanční frekvence se pohybovala od 190 do 325 kHz. Skenovací plocha čipu byla 400 um2. Každé měření bylo provedeno minimálně 3x.
Imobilizace proteinů a aptamerů na povrchu AFM čipu byla provedena podle následujícího postupu.
K roztoku proteinu (0,1 uM) o objemu 2 ul bylo přidáno 8 ul roztoku směsi NHS/EDC (v/v=l/l) a důkladně promícháno. Výsledná směs byla nanesena na povrch silanizovaného čipu a inkubována po dobu 2 minut při teplotě místnosti. Čip byl poté dvakrát promyt v termotřepačce s 1 ml deionizované vody při 800 otáčkách za minutu a 37 °C. Kvalita imobilizace proteinu na povrchu čipu AFM byla sledována mikroskopií atomárních sil.
Imobilizace aptamerů na chemicky aktivovaném povrchu AEM čipu byla provedena následovně. K zásobnímu roztoku DSP o koncentraci 1,2 mM v DMSO/ethanol (obj./obj. = 1/1)4 byl přidán roztok 50 mM pufru PBS (pH 7,4) rovněž v poměru 1/1 objemově. Takto získaný pracovní roztok byl aplikován na povrch AFM čipu a inkubován po dobu 10 minut. Poté bylo provedeno promývání 50% roztokem ethanolu ve vodě o objemu 1 ml při 15 °C po dobu 10 minut. Roztok aptameru o koncentraci 3 JIM byl aplikován na aktivovanou zónu čipu AFM a inkubován po dobu 4 minut za míchání při rychlosti 800 ot./min. Blokování nezreagovaných aminoskupin DSP síťovacího činidla bylo provedeno v přítomnosti 5 mM roztoku Tris-HCl po dobu 10 minut při 37 °C.Konečný promývací krok byl proveden dvakrát vodný roztok objem 1 ml po dobu 10 minut při 25 °C.
Trypsinolytická směs obsahující tlumivý roztok 150 mM NH4HC03, acetonitril, 0,5 M guanidin hydrochlorid a glycerol (pH 7,4) byla aplikována na povrch AFM čipu s imobilizovanými molekulami sondy. Poté bylo k roztoku pufru přidáno 0,5 μl modifikovaného roztoku prasečího trypsinu o koncentraci 0,1 μM. Čip AFM byl inkubován ve vlhkém prostředí po dobu 2 hodin při konstantní teplotě 45 °C, na jeho povrch bylo opět přidáno 0,5 ul roztoku trypsinu (0,1 uM) a inkubace pokračovala dalších 12 hodin. Trypsinolytická směs byla smyta z povrchu čipu AFM 10 ul elučního roztoku obsahujícího 70% acetonitril v 0,7% kyselině trifluoroctové (TFA). Takto získaný hydrolyzát z povrchu čipu AFM byl sušen ve vakuové odparce při 45 °C a 4200 ot./min. Dále byla směs peptidů rozpuštěna v 10 ul 5% roztoku kyseliny mravenčí nebo v 10 ul 0,7% roztoku TFA pro následnou MS analýzu.
Během MS analýzy s ionizací typu MALDI byly vzorky připraveny následovně. Vzorky rozpuštěné v 0,7% roztoku TFA o objemu 10 ul byly zakoncentrovány a odsoleny pomocí mikrošpiček ZipTip C18 (Millipore, USA) podle protokolu výrobce a smíchány s nasyceným roztokem matrice obsahující HCCA nebo DHB v 50% roztoku acetonitrilu s 0,7% TFA. Výsledná směs byla aplikována na cíl MALDI velikosti MTP.
-identifikace proteinů zachycených „chemickým rybolovem“ na povrchu čipu AFM z roztoku analytu
Na tuto fázi experimentální práce MS spektra byla získána pro modelové proteiny chemicky imobilizované na povrchu AFM čipů z roztoku analytu. Rozsah koncentrací studovaných proteinů v roztoku analytu pro avidin, HSA, anti-aFP byl 10"-10"9 M, troponin, aFP a P450 VMZ - 10"6-10"8 M.
MS analýza byla provedena pro 6 typů proteinů lišících se původem, molekulovou hmotností, počtem trypsinolytických míst a jejich prostorovou dostupností, stupněm hydrofobnosti aminokyselinové sekvence (poměr hydrofobních aminokyselin k hydrofilním), které byly kovalentně imobilizovány na povrchu AFM čipu z roztoku analytu (tabulka 1). V těchto experimentech byly použity čipy AFM, které obsahovaly pracovní a kontrolní zónu. Pracovní zóna byla chemicky aktivovaná oblast povrchu čipu AFM, na kterou byly „chemicky loveny“ modelové proteiny; kontrolní zónou byla chemicky neaktivní oblast povrchu čipu. Počet vizualizovaných zachycených molekul byl zaznamenán pomocí AFM. Experimentální data AFM analýzy získaná pro výše uvedené modelové proteiny, konkrétně počet molekul zachycených na povrchu pracovní zóny AFM čipu, jsou uvedeny v tabulce 2. Sloupec "koncentrace proteinových molekul v roztoku" v tabulce 2 ukazuje data pro minimální zaznamenanou koncentraci odpovídajícího proteinu v roztoku analytu.
Jak je vidět z tabulky 2, počet molekul registrovaných v pracovní oblasti AFM čipu pro všechny prezentované proteiny byl -1040 molekul. Limit citlivosti MS detektorů je asi 105 molekul. U prezentovaných modelových proteinů tak byla provedena úspěšná ireverzibilní imobilizace na povrchu AFM čipu a počet AFM registrovaných proteinových objektů byl dostatečný pro následnou MS identifikaci. Současně byla minimální zaznamenaná koncentrace modelových proteinů v inkubačním roztoku poměrně nízká, 10"-10" M.
Hmotnostní spektrometrická analýza vzorků byla provedena pomocí typů ionizace MALDI a ESI. AFM čip po inkubaci ve vhodném roztoku avidinu o koncentraci 10"9 M. Analýza těchto spekter nám umožnila spolehlivě identifikovat avidin (Gallus Gallus) podle jeho dvou proteotypických peptidů: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6). AFM-MS analýza chemicky aktivované pracovní zóny AFM-čipu po inkubaci v proteinovém roztoku analytu o koncentraci 10"8 M odhalila další malý protein - troponin I. MS- a MS/MS-spektra odpovídající peptidu s dvojitým nábojem 1449 Da jsou znázorněny na obrázku 3. povrch AFM čipu.
Obrázek 5 ukazuje spektra tandemové fragmentace globulárního proteinu, lidského sérového albuminu (HSA), který vykonává transportní funkce v krevní plazmě. Spektra byla získána z chemicky aktivované pracovní zóny AFM čipu po inkubaci v odpovídajícím roztoku albuminu o koncentraci 10"9 M. Analýza těchto spekter umožnila spolehlivě identifikovat lidský albumin podle jeho dvou proteotypových peptidů: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756,5) a YYEIARS měli dobře nabité3. ionty (MS).-spektra).
MS/MS spektra trypsinizovaných objektů z chemicky aktivovaného povrchu AFM čipu inkubovaného v roztoku lidského sérového albuminu (C=109 M). Peptid VPQVSTPTLVEVSR s m/z=756,5 (A), peptid YLYEIAR s m/z=464,3 (B). Experimentální podmínky: měření byla provedena na hmotnostním spektrometru LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent).
Analýza MS tedy umožnila identifikovat proteiny detekované pomocí AFM. Na základě získaných dat byl odhalen vztah mezi počtem identifikovaných proteotypických peptidů na povrchu AFM čipu a obsahem požadovaného proteinu v roztoku analytu. Taková závislost například pro proteiny P450 VMZ a HSA kovalentně imobilizované na chemicky aktivovaném povrchu čipu AFM je znázorněna na obrázku 6. Jak je vidět na obrázku 6, čím vyšší je koncentrace proteinu v roztoku analytu (-KG6 M), tím větší počet peptidů lze spolehlivě identifikovat jak v případě analýzy MALDIMS, tak v případě analýzy ESIMS-MS. Významné rozdíly mezi počtem identifikovaných peptidů v koncentračním rozmezí 10"6-10"9M mezi analyzovanými proteiny v roztoku analytu nebyly pozorovány.
Závislosti počtu identifikovaných peptidů molekul analytu na koncentraci proteinu v inkubačním roztoku. (A) - analýza směsi peptidů modelových proteinů HSA, VMZ na hmotnostních spektrometrech s ionizací typu MALDI Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Německo) a Autoflex III (Bruker Daltonics, Německo); (B) - analýza směsi peptidů modelových proteinů HSA, VMZ na hmotnostním spektrometru s ionizací typu ESI LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent, USA).
Získané výsledky umožnily konstatovat, že AFM-MS (MALDI a ESI) umožňuje detekovat a identifikovat proteinové molekuly kovalentně extrahované z roztoku analytu na povrchu čipu AFM, které se liší svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi.
Zároveň v kontrolní zóně čipu AFM (neaktivovaného) po jeho inkubaci v roztoku analytu metoda AFM nezjistila na povrchu čipu přítomnost objektů odpovídajících výšce molekulám proteinu. MS analýza také neodhalila objekty proteinové povahy. Experimentálně tak bylo prokázáno, že AFM adekvátně registruje požadované objekty – proteinové molekuly analytu.
Další fází této práce byl vývoj kombinačního schématu AFM-MS pro identifikaci proteinů získaných z roztoku za. prostřednictvím biospecifických interakcí.
Schéma hmotnostní spektrometrické analýzy v případě biospecifického AFM lovu proteinů z roztoku je znázorněno na obrázku 7. Podle výše uvedeného schématu byly molekuly sond nejprve imobilizovány na povrchu pracovní plochy čipů AFM, což byly monoklonální protilátky proti proteinovým markerům virové hepatitidy B a C nebo aptamery proti HIV-1 kontrolní zóně neobsahovaly molekulu glykoproteinu HIV-1 pro glykoprotein trombinu a gpl imobilizované . Kontrola kvality imobilizace molekul sondy byla provedena pomocí AGM-vizualizace. Poté byl takový čip inkubován v roztoku analytu obsahujícího studovaný protein. Po fázi smytí nespecificky adsorbovaných molekul na povrchu čipu a fázi přípravy vzorku pro následnou hmotnostní spektrometrickou analýzu na povrchu čipu AFM byla provedena MS analýza AFM-detekovaných proteinů.
Experimentální část této části zahrnovala dvě fáze analýzy. V první fázi bylo nutné provést MS identifikaci molekul proteinové sondy kovalentně imobilizované na čipu AFM a ve druhé fázi cílové proteiny zachycené na odpovídajících partnerských molekulách z roztoku nebo ze vzorků krevního séra v důsledku biospecifických interakcí. Pro tento účel byla provedena MS analýza MCA kovalentně imobilizované na povrchu AFM čipů proti HCV a HBV markerovým proteinům: anti-HCVcore a anti-HBVcore. Pro mAb proti proteinům anti-HCVcore a anti-HBVcore byla v této práci poprvé získána spektra tandemové fragmentace a spektra peptidové mapy.
vysoká skladovací kapacita, která zaručuje jejich aktivní biologický princip.
LITERATURA
1. Klychková G.Yu. Vývoj technologie pro komplexní preparát z chrupavkové tkáně chobotnice, lososa a jesetera // Materials of Vseros. Internetová konf. mladí vědci. - Vladivostok: TIN-RO-Center, 2004. - S. 164-170.
2. Metzler D. Biochemie. T. 2. - M., 1980. - 605 s.
3. Suchoverkhova G.Yu. Biochemická charakteristika chrupavčité tkáně hydrobiontů a technologie doplňků stravy: Dis. ... bonbón. tech. vědy. - Vladivostok, 2006. - 157 s.
4. Sytová M.V. Vědecké zdůvodnění komplexního zpracování jesetera amurského: Abstrakt práce. dis. ... bonbón. tech. vědy
M.: VNIRO, 2005. - 24 s.
Ústav biotechnologie potravin
Přijato 07.02.07
IDENTIFIKACE PROTEINOVÝCH SLOŽEK KERATINENZYMATICKÉHO HYDROLYZÁTU
Ch.Yu. ŠAMCHANOV, L.V. ANTIPOVA
Groznyj státní ropný institut Voroněžská státní technologická akademie
Jedním z nejefektivnějších způsobů zpracování druhotných zdrojů masného a drůbežího průmyslu je využití moderních biotechnologických metod k získávání potravinářských hydrolyzátů. Funkční a technologické vlastnosti získaných produktů závisí na biochemickém složení a molekulové hmotnosti jeho proteinových složek.
Při použití fyzikálně-chemických metod pro stanovení molekulové hmotnosti bílkovin závisí výsledek nejen na hmotnosti, ale také na elektrickém náboji a tvaru molekuly bílkoviny, zejména při změně rychlosti difúze bílkovin, rychlosti sedimentace v gravitačním poli. V tomto ohledu je při určování molekulových hmotností proteinů výhodné použít statistické metody když je proteinový roztok v rovnováze, například když prochází kolonou naplněnou gelem.
Účelem práce je stanovení molekulové hmotnosti M proteinových složek keratinového enzymatického hydrolyzátu a jeho biochemické složení.
Ke stanovení molekulové hmotnosti proteinových složek hydrolyzátu keratinu byla použita metoda gelové filtrace. Byl použit Sephadex v-100 (střední, průměr částic 40-120 um) s limity frakcionace 4000-150000 Da.
Kolona 46,0 x 1,9 cm byla naplněna Sephadexem ošetřeným 0,02 M univerzálním pufrem, pH 7,0. Bylo na něj aplikováno 1,5 cm3 roztoku -7 mg/cm3 - hydrolyzátu keratinu a eluováno stejným univerzálním pufrem rychlostí 12 cm3/h. Frakce o objemu 3 cm3 byly shromážděny a obsah proteinu v nich byl stanoven spektrofotometricky na SF-46 při 280 nm. Pro stanovení molekulové hmotnosti frakcí keratinového hydrolyzátu byla kolona se Sephadexem předkalibrována za stejných podmínek s použitím několika čistých (markerových) proteinů se známým M. Kalibrační křivka byla sestavena pomocí lineárního vztahu mezi ^ M a objemem
eluát Ye, uvolněný z kolony. V tabulce. 1 ukazuje některé fyzikálně-chemické charakteristiky markerových proteinů.
stůl 1
Marker protein M, Ano 1§ m V, cm3
Lysozym 13930 4,143 54
Trypsin 25700 4,409 48
Peroxidáza 34000 4,531 45
Hovězí albumin 68000 4,832 36
Modrý dextran 2000000 6,301 21
Frakce rozpustná ve vodě
keropeptid<10000 2,845 72
Ve vodě rozpustná frakce keratinového hydrolyzátu opouští kolonu v mnohem menším objemu než markerový proteinový lysozym s nejnižší molekulovou hmotností. Proto v hydrolyzátu keratinu (keropeptidu) nejsou žádné proteinové frakce s M > 13930 Da. Přibližná hmotnost produktů hydrolýzy je nižší než 10 000 Da, stanoveno gelovou filtrací na markerových proteinech Sephadex B-100. Lineární závislost mezi ^ M proteinů a objemem eluátu Ye uvolněného z kolony je znázorněno na Obr. 1 (1 - modrý dextran; 2 - hovězí albumin; 3 - peroxidáza; 4 - trypsin; 5 - lysozym; 6 - ve vodě rozpustná frakce keropeptidu).
Vzhledem k absenci markerových proteinů ve studovaném rozsahu 10000-5000 Da bylo hledání ve vodě rozpustné proteinové frakce provedeno pomocí porézních
tabulka 2
M, Ano Rozpustný protein a peptidy, mg/cm3 Celkové peptidy a aminokyseliny, µg/cm3 Tyrosin, µmol/cm3 Redukující látky, µg/cm3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% výchozí hodnoty 74,6 71,9 76,1 80,7
membrány jakosti UPM-100 a UAM-50 na laboratorní ultrafiltrační jednotce (CJSC NPO Tekhkon). Schéma zahrnovalo vlastní instalaci s 5% roztokem keropeptidu umístěným na magnetickém míchadle pro jeho neustálé míchání. Pro účinnou separaci proteinového roztoku byl do horní části aparatury pod tlakem přiváděn stlačený vzduch.Produkty hydrolýzy procházely přes porézní membrány, střídavě nahrazované v závislosti na požadované molekulové hmotnosti ultrafiltrátu, do spodní části aparatury a shromažďovány v jímací nádobě. Ve výsledných ultrafiltrátech byla stanovena řada biochemických parametrů, které umožnily vyhodnotit distribuci produktů hydrolýzy podle molekulové hmotnosti (tab. 2).
Keropeptid obsahuje nízkomolekulární proteiny s M 5000-10000 Da. Jejich hmotnostní zlomek se odhaduje jako rozdíl odečtů pro frakce 0-10000 a 0-5000 Da a je 1,43 mg/cm3. Tato frakce také poskytla pozitivní reakci na ninhydrinovou reakci (2059 µg/cm3), tyrosin (1,875 µmol/cm3) a redukující látky (543 µg/cm3). Hlavní podíl produktů hydrolýzy je však koncentrován ve frakci s nižší molekulovou hmotností s М< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
Další stanovení molekulové hmotnosti ve vodě rozpustných proteinových frakcí keropeptidu bylo provedeno na Sephadexu B-25 (průměr, průměr částic 50-150 μm), což umožňuje jeho nastavení v rozmezí frakcionace 1000-5000 Da. Podmínky gelové filtrace zůstaly nezměněny. Podle
Výsledky stanovení proteinu ve frakcích byly použity ke konstrukci elučního profilu. Ve všech frakcích byl kromě proteinu stanoven ninhydrinovou metodou obsah nízkomolekulárních látek, tyrosinu, redukujících látek (RS), dále bylo stanoveno kvantitativní rozdělení proteinových frakcí. Na Obr. Obrázek 2 ukazuje gelový chromatogram enzymatického hydrolyzátu keratinu přes Sephadex B-25 (křivka 1 - protein; 2 - ninhydrinový test; 3 - tyrosin; 4 - PB).
V tomto případě je protein detekován ve formě dvou malých píku téměř v prvních frakcích. Hmotnostní frakce bílkovin ve frakcích č. 1-8 od 3-24 cm3
má poměrně vysoké hodnoty a činí 0,12-0,18 mg/cm3 (křivka 1).
Převážná část produktu vycházela z kolony jako maximální proteinový pík s objemem 27 cm3 eluátu (frakce č. 9, každá 3 cm3 eluátu). Hmotnostní podíl bílkovin v této frakci byl registrován na úrovni 0,66 mg/cm3, což je 3-4krát více než u ostatních studovaných frakcí.
Další eluce keropeptidu v objemovém rozsahu 36-96 cm3 odhalila tři píky s poklesem hmotnostního podílu proteinu v nich nejvýše o 0,08 mg/cm3. Kompletní roztok keropeptidu se eluuje v konečném objemu 96 cm3.
Ve frakci č. 9 bylo nalezeno celé množství dostupného RS, hmotnostní frakce 66 μg/cm3 (křivka 4). Ninhydrinová reakce byla použita v gelové chromatografii k identifikaci distribuce produktů hydrolýzy podle molekulové hmotnosti. Bylo zjištěno, že když nadbytečné množství ninhydrinu a proteinových produktů interaguje s volnou MH2 skupinou a v závislosti na počtu těchto skupin, je možné lokalizovat protein
RV, μg/cm3 175 co D 5 o l s; 0,70
100 125 X - 3 co o o. 0,5
80 § 100 2 _ n 0,4
60 1 isin, 7 sl 0,3
40 1 l 5 o - (P 2 o I- 0,2
20 25 _ 2 ai O 0,1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, cm
deriváty elucí přes Sephadex. Nízká hmotnostní frakce ninhydrinu (4–6 µg/cm3) tedy velmi přesně odráží množství volných aminoskupin a určuje přítomnost vysokomolekulárních peptidů s М 3000–5000 Da ve frakcích J# 1–8 (křivka 2). Je známo, že v rozsahu měření molekulové hmotnosti produktů hydrolýzy< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Ano. Další analýza elučního profilu pro vzorek ninhydrinu (frakce č. 12-36) odhalila pík, který neodpovídal koncentraci jeho proteinu, jak bylo pozorováno u peptidů v předchozích frakcích. Hmotnostní frakce nízkomolekulárních látek ve frakci č. 23 byla 157 μg/cm3, což je více než 2krát více než u peptidů ve frakci č. 9. Inverzně proporcionální závislost parametrů testu proteinu a ninhydrinu ve frakcích č. 9 a 23 ukazuje kvalitativní analýzou na přítomnost produktů hydrolýzy ve formě volných aminokyselin. Příslušnost k němu a aminokyselina tyrosin (0,06 µmol/cm3) je dalším důkazem uvedené polohy.
Gelová filtrace keratinového hydrolyzátu přes Sephadex G-100 a G-25 tedy indikuje přítomnost nízkomolekulárního solutu v něm.
můj protein (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Ano. V tomto případě proteinové řetězce obsahují 5-20 aminokyselinových zbytků. Je důležité zdůraznit, že frakce č. 9 současně reaguje na biuretovou vazbu, ninhydrin, tyrosin a RV. Tato charakteristika naznačuje přítomnost sacharidů v keratinovém proteinu a jejich přímé spojení s proteinem jako součást jednoho komplexu.
LITERATURA
1. Antipova L.V., Pashchenko L.P., Shamkhanov Ch.Yu., Kurilova E.S. Získávání a charakterizace potravinářského keratinového hydrolyzátu // Skladování a zpracování zemědělských surovin. - 2003. - č. 7.
2. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S., Pozhalova N.A. Biochemické charakteristiky procesu enzymatické hydrolýzy surovin obsahujících keratin v drůbežářském průmyslu Izv. vysoké školy. Potravinářské technologie. - 2003. - č. 5-6.
3. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S. Co -
zdokonalení technologie výroby keropeptidu ze surovin z peřícího prachového peří // Masný průmysl. - 2004. - č. 3. - S. 44-47.
4. Rogov I.A., Antipova L.V., Dunchenko N.I., Zhereb-tsov N.A. Chemie potravin. Ve 2 knihách. Rezervovat. 1. Bílkoviny: struktura, funkce, úloha ve výživě. - M.: Kolos, 2000. - 384 s.
5. Osterman L.A. Chromatografie proteinů a nukleových kyselin. - M.: Nauka, 1985. - 536 s.
6. Kochetov G.A. Praktický průvodce enzymologií. - 2. vyd., přepracováno. a doplňkové - M.: Vyšší. škola, 1980. - 272 s.
Ústav technologie potravin Ústav technologie masa a masných výrobků
Přijato 0S.02.0? G.
TEORETICKÉ ZDŮVODNĚNÍ MECHANISMU KONZERVAČNÍHO PŮSOBENÍ SLOŽEK KUŘIVÝCH VÝTAŽKŮ
S.V. ZOLOTOKOPOVÁ, I.A. PALAGINA
Astrachaňská státní technická univerzita Astrachaňská pobočka Saratovské státní sociálně-ekonomické univerzity
Důležitou oblastí výzkumu posledních let je studium vlivu různých potravinářských přídatných látek nejen na chuť a vůni, ale také na zvýšení trvanlivosti potravinářských výrobků. Od starověku se kořeněné rostliny používaly ke konzervování, stolní sůl, kouření atd. Analýza ukazuje, že v současné době trh dobývají kouřové extrakty. Mezi obyvatelstvem jsou oblíbené zejména uzené potraviny a tradiční uzení ztrácí své pozice na bezdýmné.
Ekologicky příznivé a perspektivní jsou extrakty získané za šetrných podmínek.
G.I. pracuje na vylepšení technologie těžby po celá desetiletí. Kasjanov - vážený pracovník vědy a techniky Ruské federace, vážený vynálezce Ruské federace, doktor technických věd, profesor, vedoucí katedry technologie masa a rybích výrobků státu Kuban technologická univerzita. Vědecká a pedagogická škola „Teorie a praxe zpracování surovin rostlinného a živočišného původu se zkapalněnými a stlačenými plyny“, působící při KubGTU a Krasnodarském výzkumném ústavu pro skladování a zpracování zemědělských produktů pod jeho vedením, se zabývá problémy zvyšování efektivity zpracování různých surovin, které mohou zlepšit kvalitu produktů, zkrátit dobu zpracovatelských procesů a zároveň snížit náklady na energii.
vysolování: srážení se solemi alkálií, kovů alkalických zemin (chlorid sodný, síran hořečnatý), síran amonný; zároveň není narušena primární struktura proteinu;
srážky: použití odvodňovacích prostředků: alkohol nebo aceton při nízkých teplotách (asi -20°C).
Při použití těchto metod proteiny ztrácejí svůj hydratační obal a vysrážejí se v roztoku.
Denaturace- porušení prostorové struktury bílkovin (primární struktura molekuly je zachována). Může být reverzibilní (struktura proteinu se obnoví po odstranění denaturačního činidla) nebo ireverzibilní (neobnoví se prostorová struktura molekuly např. při vysrážení proteinů koncentrovanými minerálními kyselinami, solemi těžkých kovů).
Metody separace bílkovin Separace bílkovin od nízkomolekulárních nečistot
Dialýza
Používá se speciální polymerní membrána, která má póry určité velikosti. Malé molekuly (nečistoty s nízkou molekulovou hmotností) procházejí póry v membráně, zatímco velké molekuly (proteiny) jsou zadržovány. Proteiny se tak vymyjí od nečistot.
Separace proteinů podle molekulové hmotnosti
Gelová chromatografie
Chromatografická kolona je naplněna gelovým granulátem (Sephadex), který má póry určité velikosti. Do kolony se přidá směs proteinů. Proteiny, jejichž velikost je menší než velikost pórů Sephadexu, jsou zadrženy v koloně, protože se v pórech „zasekávají“ a zbytek volně kolonu opouští (obr. 2.1). Velikost proteinu závisí na jeho molekulové hmotnosti.
Rýže. 2.1. Separace proteinů gelovou filtrací
Ultracentrifugace
Tato metoda je založena na různé rychlosti sedimentace (precipitace) molekul proteinů v roztocích s různými gradienty hustoty (pufr sacharózy nebo chlorid česný) (obr. 2.2).
Rýže. 2.2. Separace proteinů ultracentrifugací
elektroforéza
Tato metoda je založena na různé rychlosti migrace proteinů a peptidů v elektrickém poli v závislosti na náboji.
Jako nosiče pro elektroforézu mohou sloužit gely, acetát celulózy, agar. Molekuly, které mají být separovány, se pohybují v gelu v závislosti na jejich velikosti: ty, které jsou větší, budou při průchodu póry gelu zadržovány. Menší molekuly narazí na menší odpor, a proto se budou pohybovat rychleji. Výsledkem je, že po elektroforéze budou větší molekuly blíže startu než menší (obr. 2.3).
Rýže. 2.3. Separace proteinů gelovou elektroforézou
Proteiny lze také oddělit elektroforézou podle molekulové hmotnosti. Pro toto použití elektroforéza v PAAG v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-Na).
Izolace jednotlivých proteinů
Afinitní chromatografie
Metoda je založena na schopnosti proteinů vázat se silně na různé molekuly nekovalentními vazbami. Používá se k izolaci a čištění enzymů, imunoglobulinů, receptorových proteinů.
Molekuly látek (ligandů), na které se specificky vážou určité proteiny, jsou kovalentně spojeny s částicemi inertní látky. Směs proteinů je přidána do kolony a požadovaný protein je pevně připojen k ligandu. Zbývající proteiny volně opouštějí kolonu. Zadržený protein pak může být vymyt z kolony pufrem obsahujícím volný ligand. Tato vysoce citlivá metoda umožňuje izolovat velmi malá množství čistého proteinu z buněčného extraktu obsahujícího stovky dalších proteinů.
Izoelektrické zaostřování
Metoda je založena na různých hodnotách IEP proteinů. Proteiny se oddělují elektroforézou na destičce s amfolinem (jedná se o látku, která má předem vytvořený gradient pH v rozmezí od 3 do 10). Při elektroforéze se proteiny oddělují podle hodnoty jejich IEP (v IEP bude náboj proteinu nulový a nebude se pohybovat v elektrickém poli).
2D elektroforéza
Jde o kombinaci izoelektrické fokusace a elektroforézy s SDS-Na. Nejprve se provede elektroforéza v horizontálním směru na desce s amfolinem. Proteiny se oddělují v závislosti na náboji (CEP). Poté se deska ošetří roztokem SDS-Na a provede se elektroforéza ve vertikálním směru. Proteiny jsou klasifikovány na základě molekulové hmotnosti.
Imunoelektroforéza (Western blot)
Analytická metoda používaná ke stanovení specifických proteinů ve vzorku (obrázek 2.4).
Izolace proteinů z biologického materiálu.
Separace proteinů podle molekulové hmotnosti elektroforézou v PAAG s SDS-Na.
Přenos proteinů z gelu na polymerní desku pro usnadnění další práce.
Ošetření destičky nespecifickým proteinovým roztokem k vyplnění zbývajících pórů.
Po této fázi tak byla získána destička, jejíž póry obsahují oddělené proteiny a prostor mezi nimi je vyplněn nespecifickým proteinem. Nyní musíme zjistit, zda mezi proteiny, které hledáme, nejsou zodpovědné za nějaký druh onemocnění. K detekci se používá léčba protilátkou. Pod primárními protilátkami rozumíme protilátky proti požadovanému proteinu. Sekundárními protilátkami se rozumí protilátky proti primárním protilátkám. Ke složení sekundárních protilátek je přidána další speciální značka (tzv. molekulární sonda), aby bylo možné později vizualizovat výsledky. Jako značka se používá radioaktivní fosfát nebo enzym pevně navázaný na sekundární protilátku. Vazba nejprve na primární a poté na sekundární protilátky má dva cíle: standardizovat metodu a zlepšit výsledky.
Zpracování roztokem primárních protilátek vazba nastává v místě destičky, kde je antigen (požadovaný protein).
Odstranění nenavázaných protilátek (promytí).
Léčba roztokem značených sekundárních protilátek pro následný vývoj.
Odstranění nenavázaných sekundárních protilátek (promytí).
Rýže. 2.4. Imunoelektroforéza (Western blot)
V případě přítomnosti požadovaného proteinu v biologickém materiálu se na destičce objeví proužek indikující vazbu tohoto proteinu na odpovídající protilátky.
Nejcharakterističtějšími fyzikálně-chemickými vlastnostmi proteinů jsou: vysoká viskozita roztoků, mírná difúze, schopnost velkého rozsahu bobtnání, optická aktivita, pohyblivost v elektrickém poli, nízký osmotický tlak a vysoký onkotický tlak, schopnost absorbovat UV záření při 280 nm (tato poslední vlastnost se díky přítomnosti aromatických aminokyselin v proteinech využívá pro kvantitativní stanovení proteinů).
Proteiny, stejně jako aminokyseliny, jsou amfoterní díky přítomnosti volných skupin NH2 a COOH a vyznačují se všemi vlastnostmi kyselin a zásad.
Proteiny mají výrazné hydrofilní vlastnosti. Jejich roztoky mají velmi nízký osmotický tlak, vysokou viskozitu a malou difuzivitu. Proteiny jsou schopny bobtnat ve velmi velkém rozsahu.
Rad je spojen s koloidním stavem proteinů. charakteristické vlastnosti, zejména fenomén rozptylu světla, který je základem kvantitativního stanovení proteinů nefelometrií. Tento efekt se také používá v moderní metody, mikroskopie biologických objektů. Molekuly proteinů nejsou schopny procházet polopropustnými umělými membránami (celofán, pergamen, kolodium) ani biomembránami rostlinných a živočišných tkání, ačkoli u organických lézí, jako jsou ledviny, se pouzdro ledvinového glomerulu (Shumlyansky-Bowman) stává propustným pro krevní sérové albuminy a objevují se v moči.
Denaturace proteinů Pod vlivem různých fyzikálních a chemických faktorů podléhají proteiny koagulaci a vysrážení, čímž ztrácejí své přirozené vlastnosti. Denaturaci je tedy třeba chápat jako porušení obecného plánu – jedinečné struktury molekuly nativního proteinu, vedoucí ke ztrátě jejích charakteristických vlastností (rozpustnost, elektroforetická pohyblivost, biologická aktivita atd.). Většina bílkovin denaturuje při zahřátí s roztokem nad 50-60 ° C. Vnější projevy denaturace se redukují na ztrátu rozpustnosti zejména v izoelektrickém bodě, zvýšení viskozity roztoků bílkovin, zvýšení množství volného funkčního SH-rpypp a změnu charakteru rozptylu rentgenového záření. Nejcharakterističtějším znakem denaturace je prudký pokles nebo úplná ztráta biologické aktivity proteinu (katalytické antigenní nebo hormonální). peptidové vazby samotné páteře polypeptidového řetězce Současně se rozvíjejí globule molekul nativních proteinů a vznikají náhodné a neuspořádané struktury.
