Umožňuje analyzovat obrovské množství genetických rysů v jediném vzorku zdrojového materiálu. V tomto případě je žádoucí, aby DNA čipy měly dvě vlastnosti, které si v jistém smyslu protiřečí. Na jedné straně je zajímavé mít v jednom DNA čipu co nejvíce buněk, abychom získali více informací o zkoumaném vzorku. Výzkumníci jsou přitom často nuceni pracovat s velmi malými objemy biologického materiálu, takže čím menší je velikost DNA čipu, tím lépe.
Moderní metody(např. mikroskopie atomárních sil, AFM) umožňují detekovat signál v buňkách DNA čipu, jejichž rozměry jsou několik desítek nanometrů. Metody výroby takovýchto DNA čipů jsou založeny na litografii (nejatraktivnější metodou je nanolitografie dip-pen, DPN). Stavba čipů s takto malými články je obvykle poměrně drahá a časově náročná.
Skupina vědců ze Spojených států a Koreje navrhla metodu pro levnější, rychlejší a masová produkce DNA mikro- a nanočipy. Vědci ukázali, že odebráním jednoho DNA čipu jako vzorku je možné v jednom kroku vytisknout čip, který je komplementární k původnímu. Tento způsob získávání DNA čipů se nazývá metoda supramolekulárního nanotisku (supramolekulární nanostamping, SuNS) a je schematicky znázorněn na obrázku 1. Obr.
Jako vzorek vědci vzali pole jednovláknové DNA sešité na zlaté nanočástice, ve kterých byla velikost buněk 9 ± 2 nm a vzdálenost mezi buňkami byla 77 ± 9 nm. Do tohoto DNA čipu byla přidána komplementární DNA modifikovaná hexylthiolem na 5' konci. Po hybridizaci (tj. navázání komplementárních řetězců DNA) byl na čip vzorku umístěn skleněný substrát potažený zlatem. K tomuto novému substrátu jsou připojena komplementární vlákna DNA. Poté byla při 90 °C provedena dehybridizace a jako výsledek byl získán otisk, který byl komplementární k původnímu vzorku.
Po prozkoumání výsledné kopie vědci dospěli k závěru, že otisk byl proveden úspěšně: nový čip DNA měl buňky o velikosti 14±2 nm, oddělené mezerami 77±10 nm (obrázek 2). Aby se ukázalo, že uspořádání buněk v poli je pro vzorek a tisk stejné, byla pro oba případy vypočtena funkce radiálního rozdělení (obrázek 3). Je vidět, že funkce dopadly dost podobně.
Do budoucna je potřeba ukázat, že SuNS je vhodný pro tisk vícesložkových čipů a pro výrobu mnoha kopií z jednoho vzorku bez ztráty přesnosti. Vědci věří, že to budou moci prokázat v blízké budoucnosti.
V časopise byla publikována práce „Application of supramolekulární nanostamping na replikaci DNA nanoarrays“ Nano dopisy.
V poslední době se aktivně vyvíjejí technologie DNA, které umožňují nejen určit znak, ale také současně provádět diferenciální sekvenování, tzn. stanovení bodových mutací nebo polymorfismů ve známých oblastech genomu. Tyto technologie mají významné výhody oproti tradičním molekulárně biologickým metodám, protože umožňují miniaturizaci zkušebního vzorku a analyzátoru, což výrazně snižuje náklady na analýzu a dobu její realizace, jakož i současné stanovení různých parametrů zkušebního vzorku, aniž by došlo ke ztrátě citlivosti amplifikačních metod. Hlavní výhodou metod založených na použití čipů s oligonukleotidy všech možných nukleotidové sekvence daná délka, je jejich všestrannost. Přítomnost oligonukleotidu jakékoli sekvence na čipu umožňuje analyzovat jakoukoli studovanou sekvenci. Použití mikročipů je založeno na principu rychlého stanovení interakcí určitých ligandů s mnoha různými sondami současně. Biologické mikročipy jsou ve skutečnosti jedním nebo druhým pevným substrátem, na kterém jsou uloženy určité fragmenty nukleových kyselin nebo proteinů nebo uhlohydrátů nebo jakékoli jiné molekuly sondy, které mohou být rozpoznány nebo vykazují biologickou aktivitu. Počet různých sond na substrátu může dosahovat stovek tisíc a čipy každého typu jsou přísně identické a se stávajícími technologiemi je lze replikovat ve stovkách tisíc a milionech kopií uložených na substrátu.
DNA mikročipy
Existují proteiny, DNA, sacharidy, tkáňové čipy. speciální pozornost zaslouží DNA čipy. Jsou unikátním analytickým nástrojem, který umožňuje určit v analyzovaném vzorku (zpravidla biologického původu) přítomnost daných sekvencí DNA (tzv. hybridizační analýza). Analýza pomocí DNA čipů je několikanásobně levnější než použití alternativních technologií (elektroforéza, real-time PCR) a umožňuje za přítomnosti detektoru jednoduché konstrukce pracovat mimo laboratoř.
Poprvé byly čipy DNA použity ve výzkumu na konci 80. let minulého století. Tato dnes široce používaná metoda, která umožňuje současně analyzovat expresi více genů, je založena na principu rozpoznávání cílů mRNA nebo cDNA prostřednictvím jejich hybridizace s jednovláknovými fragmenty DNA imobilizovanými na mikročipu.
DNA čip je pevný substrát, na kterém jsou imobilizovány (zpravidla kovalentně) jednořetězcové fragmenty DNA různých délek: krátké - 15-25 nukleotidů, dlouhé - 25-60 nukleotidů a cDNA fragmenty - od 100 do 3000 nukleotidů . Použitým materiálem substrátu je sklo, křemík, různé polymery, hydrogely (například na bázi polyakrylamidu) a dokonce i zlato.
Hybridizace je základem technologie
Základem všech moderních DNA technologií je hybridizace. V důsledku hybridizace jsou molekuly nukleových kyselin schopny vytvářet stabilní dvouvláknové struktury díky vazbám mezi prvky molekul – nukleotidy. Nukleotid adenin (A) je komplementární k thyminu (T), guanin (G) je komplementární k cytosinu (C). Výsledkem je, že jednovláknová nukleotidová sekvence ATHC vytvoří stabilní spojení, dvouvláknovou strukturu, s jednovláknovou molekulou DNA kompozice TACG.
…..ATHC….
| | | |
….. TACG….
Taková komplementarita vede k „přilepení“ dvou molekul DNA, z nichž jedna může být nehybně fixována na substrátu a být prvkem DNA čipu. Čím více molekul, které jsou komplementární k prvkům čipu, je ve vzorku obsaženo, tím více se jich na čip naváže a tím vyšší bude intenzita signálu vnímaného z tohoto prvku. Na Obr. 1 ukazuje princip fungování DNA buňky nebo oligonukleotidového biočipu na základě komplementárních interakcí adeninové báze ( A) s thyminem ( T) a guanin ( G) s cytosinem ( S) ve dvou řetězcích DNA. Pokud je sekvence bází v jednom vláknu DNA (nebo oligonukleotidu) zcela komplementární k sekvenci druhého vlákna, vytvoří se stabilní dokonalá dvouvláknová helix - duplex. Například přítomnost i jednoho špatného páru v duplexu G-G, zabraňuje tvorbě duplexu. Pokud je v jednom z prvků mikročipu imobilizována specifická jednořetězcová DNA nebo řekněme 20-merní oligonukleotid (sonda), pak když jsou fragmenty DNA značené fluorescenčními barvivy, například lidský genom, přidány do mikročipu, dojde k jejich vysoce specifické interakci. Daný oligonukleotidový prvek biočipu bude specificky vázat pouze jednu komplementární sekvenci ze 420 = 1,09x1012 všech možných sekvencí této délky v DNA. V důsledku toho je fluorescenční záře pozorována pouze na tomto komplementárním prvku biočipu. Jeden prvek biočipu tedy vytváří jeden vzorek z asi bilionu možných možností, na rozdíl od prvku elektronického čipu, kde se vyskytuje binární vzorek: ANO nebo NE.
Rýže. 1. Schéma vzniku dvoušroubovice DNA na biočipu. Oligonukleotid je fixován na jednom z prvků biočipu a selektivně váže pouze ten komplementární z mnoha fluorescenčně značených fragmentů DNA. Výsledkem je, že pouze tento prvek začne svítit. To je způsobeno vysoce specifickými interakcemi komplementárních párů bází. A S T A G S S. Například přítomnost nekomplementární dvojice G-G, zabraňuje interakci a zanechává prvek mikročipu tmavý.
Zařízení používaná ke stanovení parametrů hybridizace umožňují zaznamenat nejen konečný výsledek, ale také kinetiku asociace a disociace komplementárních řetězců. Tyto technologie, i když umožňují multiparametrovou analýzu vzorků, mohou poskytnout velké množství informací. Výsledky hybridizace závisí na délce vzorku DNA, chemickém složení značeného cíle DNA, teplotě, při které se hybridizace provádí, složení hybridizační směsi a typu fluorescenční značky. Zde je třeba poznamenat, že pasivní hybridizace se používá hlavně v čipech DNA; interakce cílové DNA s imobilizovaným vzorkem je pravděpodobnostní proces a závisí na různých podmínkách.
Použití DNA čipů
Posouzení stavu a identifikace všech genů studovaného organismu je jednou z nich kritické úkoly před vývojáři čipů DNA. Řešení tohoto problému lze realizovat v imobilizaci všech genů organismu na biologickém čipu, což umožní komplexní posouzení stavu genů a genomu jako celku. Biogenetické databáze obsahující veškeré informace (systematizované) o genech a genomech různých organismů poskytují výzkumníkům velké možnosti při navrhování DNA čipů.
Mezi hlavní důvody širokého využití biočipových studií patří vysoká senzitivita, specificita a reprodukovatelnost, jednoduchost postupu, možnost současné analýzy mnoha parametrů a relativně nízká cena práce. Ze stejných důvodů považujeme biočipy za slibný nástroj různé oblasti Národní ekonomika.
Shrneme-li to, je třeba poznamenat, že mikročipy jsou efektivním přístupem pro současnou identifikaci desítek až tisíc genů a jejich strukturní analýzu, k identifikaci specifických nukleotidových sekvencí a nukleotidových variací v jejich struktuře. Pokud jsou však geny v genomu přítomny v množství jedné nebo více kopií, s čímž se v klinické praxi neustále setkáváme, je nutná jejich předběžná amplifikace. Většina účinná metoda Amplifikace DNA je polymerázová řetězová reakce, při které dochází k exponenciálnímu nárůstu počtu molekul DNA z několika na miliony i více kopií a hlavní výhodou tohoto typu PCR je skutečnost, že Real Time umožňuje i kvantitativní hodnocení studované matrice . To je důležité pro řešení problémů v rozvoji základních a integrálních věd a také pro optimalizaci podmínek diagnostických metod.
Dvě metody, které se již pro některé oblasti vědy a aplikovaných technologií staly tradičními, mají spolu se svými nedostatky zcela unikátní výhody.
RealTime PCR:
umožňuje odhadnout množství původní matrice;
Nevyžaduje další pracovně náročné fáze práce;
· absence elektroforézy minimalizuje riziko kontaminace a tím snižuje počet falešně pozitivních výsledků;
· použití matematických metod analýzy umožňuje automatickou interpretaci získaných výsledků a odstraňuje problém subjektivního hodnocení elektroforegramů;
poskytuje méně přísné požadavky na organizaci laboratoře PCR a automatickou registraci a interpretaci výsledků;
umožňuje ušetřit čas.
Biologické mikročipy:
umožňují miniaturizaci vzorku a analyzátoru;
šetří čas a náklady na analýzu;
umožňuje současně určit několik parametrů zkušebního vzorku;
· má vysokou citlivost amplifikačních metod, specificitu a reprodukovatelnost;
Poskytuje snadnou obsluhu.
Je možné, že kombinace těchto metod převedením polymerázové řetězové reakce do formátu mikročipu umožní vytvořit diagnostický systém nové generace vyznačující se následujícími vlastnostmi: vyšší citlivost a především specifita detekce nukleových kyselin, vysoká produktivita při nízkých nákladech na analýzu, obecně snížení počtu manipulací v každé fázi analýzy.
Genové vyjádření- jde o proces, při kterém se dědičná informace z genu (sekvence nukleotidů DNA) přemění na funkční produkt - RNA nebo protein. Regulace genové exprese umožňuje buňkám řídit jejich vlastní strukturu a funkci a je základem buněčné diferenciace, morfogeneze a adaptace.
DNA čipy jsou unikátním analytickým nástrojem, který umožňuje určit v analyzovaném vzorku (zpravidla biologického původu) přítomnost daných sekvencí DNA (tzv. hybridizační analýza). Analýza pomocí DNA čipů je několikanásobně levnější než použití alternativních technologií (elektroforéza, real-time PCR) a umožňuje za přítomnosti detektoru jednoduché konstrukce pracovat mimo laboratoř.
Poprvé DNA čipy byly použity ve výzkumu na konci 80. let. Tato dnes široce používaná metoda, která umožňuje současně analyzovat expresi více genů, je založena na principu rozpoznávání cílů mRNA nebo cDNA prostřednictvím jejich hybridizace s jednovláknovými fragmenty DNA imobilizovanými na mikročipu. Moderní DNA microarray se skládá z tisíce deoxyoligonukleotidů (sond nebo vzorků) seskupených ve formě mikroskopických bodů a fixovaných na pevném substrátu. Každá tečka obsahuje několik pmol DNA se specifickou nukleotidovou sekvencí. Oligonukleotidy DNA microarray mohou být krátké úseky genů nebo jiných funkčních prvků DNA a používají se pro hybridizaci s cDNA nebo mRNA (cRNA). Hybridizace sonda-cíl je detekována a kvantifikována fluorescencí nebo chemiluminiscencí, což umožňuje stanovit relativní množství nukleové kyseliny dané sekvence ve vzorku.
V konvenčním DNA mikročipu jsou sondy kovalentně připojeny k pevnému povrchu – skleněnému nebo silikonovému čipu. Jiné platformy, jako jsou ty od Illumina, používají místo velkých tvrdých povrchů mikroskopické kuličky.
DNA microarrays se používají k analýze změn v genové expresi, identifikaci jednonukleotidových polymorfismů, genotypizaci nebo resekvenování mutantních genomů. Mikročipy se liší designem, výkonem, přesností, účinností a cenou.
DNA mikročipy:
CDNA mikročipy
oligonukleotid
(dvoubarevný s fluorescenční detekcí)
oligonukleotid
(Affymetrix, jednobarevný s fluorescenční detekcí)
membránové c-DNA mikročipy
(s radioaktivní detekcí)
Gelové c-DNA čipy
Proteinové mikročipy
Trocha historie
80. léta: proteinové chipsy
~1991: Podporovaná chemie syntézy DNA (vysoká hustota) - Affymetrix oligonukleotidové čipy (Fodor, Stryer, Lockhart)
~1995: Micro-Digging Robots - cDNA čipy Stanfordské univerzity (Pat Brown a Dari Shalon)
90. léta: IMB gelové čipy
V roce 1982 však Augenlicht a Kobrin navrhli pole DNA ( Rakovina Výzkum), a v roce 1984 vyrobili čip, který obsahoval 4 000 prvků pro studium rakovinných buněk.
(Článek byl zamítnut VědaA Příroda)
Co lze studovat pomocí mikročipů DNA?
Genová exprese v různých tkáních
Genová exprese za normálních a patologických stavů (v normálních a rakovinných buňkách)
Změny genové exprese v průběhu času v důsledku vnějšího vlivu (interakce buňky s patogenem, lékem)
Výrazové profily(vzory) se liší mezi normálními a rakovinnými buňkami nebo mezi různými typy rakoviny. Vyléčitelné a nevyléčitelné typy leukémie vytvářejí různé vzory. Podle typu vzorů je možné s vysokou pravděpodobností předpovědět průběh onemocnění v nejranějším stadiu.
Expression microarrays
Jednou z aktivně rozvíjených oblastí využívajících technologii microarray je studium transkripčních profilů u komplexních onemocnění. Přestože všechny buňky v našem těle sdílejí stejnou zděděnou genomickou DNA, každá buňka exprimuje různé geny jako mRNA podle typu buňky, biologických procesů, normálních nebo patologických stavů a tak dále. Tato diverzita v profilech genové exprese je předmětem intenzivního studia kvůli jejímu biologickému a klinickému významu. Schopnost technologie mikročipů analyzovat expresi stovek a tisíců genů se ukázala být nejžádanější při dešifrování tak komplexního onemocnění, jako je rakovina. Technologie Microarray umožňuje simultánní sledování exprese desítek tisíc genů a vytváří tak molekulární portrét buňky. Mezi nejvýznamnější důsledky studia profilů genové exprese patří diagnóza, stratifikace a prognóza mnoha typů rakoviny. Ačkoli je histopatologické vyšetření doplněné o cytogenetické vyšetření a analýzu několika molekulárních markerů stále zlatým standardem v diagnostice a prognóze, nedávné práce ukazují, že v mnoha případech může být nahrazeno profilováním genové exprese. Diagnostika a prognóza rakoviny vyžaduje společné odborné znalosti několika praktických lékařů, jako jsou onkologové, patologové a cytogenetikové, a konečné závěry se mohou lišit v závislosti na metodických přístupech a odbornosti odborníků. Mikročipy by mohly zcela nahradit úsilí mnoha specialistů, navíc zlepšit přesnost diagnostiky a prognózy a také poskytnout jednotnou standardizovanou platformu pro analýzu.
K analýze genové exprese se používají dva typy mikročipů: na bázi komplementární DNA (cDNA) a na bázi oligonukleotidových sond. Mikročipy na bázi cDNA jsou fragmenty DNA fixované na povrchu standardních mikroskopických skel nebo na jiném pevném substrátu. Oligonukleotidy o délce 25–60 nukleotidových bází (n.b.) jsou imobilizovány v oligonukleotidových mikročipech na stejném substrátu. Postup přípravy vzorku pro analýzu na microarrays je znázorněn na obr. 1. 2. Z buněk se izoluje celková RNA (někdy se izoluje i frakce mRNA), poté se provede reverzní transkripční reakce s použitím kombinovaného primeru obsahujícího sekvenci komplementární k polyA-terminálnímu fragmentu mRNA a oblast T7 RNA polymerázy promotér. Zařazení sekvence promotoru T7 RNA polymerázy do syntetizovaného řetězce cDNA umožňuje další provedení amplifikační reakce in vitro: enzym T7 RNA polymeráza produkuje mnoho kopií RNA z každé molekuly cDNA ve zkumavce. Tak dochází k lineární amplifikaci původní mRNA. Značení výsledných molekul RNA se zpravidla provádí současně díky použití nukleotidů obsahujících fluorescenční značku v reakci. V experimentech s oligonukleotidovými mikročipy se fluorescenční značka stejného typu často používá k označení vzorku komplementární RNA (cRNA) a úrovně genové exprese se určují porovnáním výsledných fluorescenčních signálů se signály z vnitřních kontrolních bodů mikročipu. Při práci s mikročipy na bázi cDNA se v experimentu používají zpravidla 2 vzorky: kontrolní vzorek se označí jedním fluorescenčním barvivem, zkušební vzorek jiným, poté se smíchají a hybridizují s jedním mikročipem. Podle poměru dvou různých fluorescenčních značek v každé buňce mikročipu se posuzuje zvýšení nebo snížení hladiny exprese daného genu. Bez ohledu na technologickou platformu každý experiment generuje data obsahující hodnocení úrovně exprese desítek a stovek tisíc genů. Ke zpracování takového množství dat se používá poměrně složitý matematický aparát, především shluková analýza. Data microarray lze analyzovat ve vztahu ke klinickým datům (analýza orientovaná na hypotézy, analýza pod dohledem) nebo bez ohledu na jakoukoli klinickou charakteristiku pacienta (nezávislá analýza, analýza bez dozoru).
Klasické metody umožňují analyzovat expresi několika genů současně nebo vyžadují použití specializovaných technologií microarray, např. Affymetrix. Affymetrix využívá kombinaci fotolitografie a chemická syntéza oligonukleotidy pro výrobu mikročipů GeneChip®.
ŽLUTÁ- pokud je gen exprimován v nemocných (Cy5) i normálních (Cy3) tkáních, pak DNA značená červenou a zelenou barvou bude hybridizovat v tomto místě a výsledek bude žlutý
ČERVENÉ- pokud je gen exprimován pouze v nemocné (Cy5) tkáni, pak v tomto místě bude hybridizovat pouze DNA značená červeným barvivem
ZELENÁ- pokud je gen exprimován pouze ve zdravé (Cy3) tkáni, pak v tomto místě bude hybridizovat pouze DNA značená zeleným barvivem
ČERNÁ- pokud gen není exprimován v nemocné ani zdravé tkáni
Tím pádem,
DNA microarrays umožňují simultánní analýzu informací o expresi mnoha tisíc genů.
Hlavní typy DNA microarrays, které se v současnosti používají, jsou cDNA microarrays a oligonukleotidové čipy od Affymetrix.
cDNA microarrays jsou založeny na hybridizaci smíšených experimentálních a kontrolních vzorků značených různými fluorescenčními barvivy k čipu, na jehož povrchu je uložena dvouvláknová c-DNA odpovídající ~10 000-20 000 genům.
Mikročipy Affimetrix jsou založeny na hybridizaci biotinem značené cRNA experimentálního vzorku se sadou oligonukleotidů Perfect Match a Mismatch syntetizovaných na čipovém substrátu, po které následuje barvení streptavidin-fykoerythrin. GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 umožňuje simultánní analýzu 47 000 transkriptů, včetně 38 500 charakterizovaných genů. Mikročip obsahuje 1 300 000 oligonukleotidů různých typů.
Analýza získaných dat vyžaduje vícestupňové matematické zpracování pomocí speciálních statistických metod.
Prakticky již dnes použití mikročipů umožňuje řešit následující problémy:
přesná diagnóza, identifikace nových podtypů onemocnění, upřesnění klasifikace;
predikce průběhu onemocnění a klinického výsledku, identifikace genů a signálních drah podílejících se na patogenezi onkohematologických onemocnění, hledání nových cílů pro řízenou diferencovanou terapii;
vývoj a tvorba jednodušších a levnějších diagnostických testů, včetně těch na bázi mikročipové technologie (mikročipy obsahující vzorky pro desítky či stovky genů namísto desítek a stovek tisíc);
zařazení microarrays do prospektivních klinických studií, potvrzení výsledků analýzy na microarrays pro zařazení do protokolů klinické léčby, návrh klinických protokolů zohledňující nová data o povaze onemocnění získaná pomocí technologie microarray.
DNA microarray(anglicky DNA microarray) je komplexní technologie používaná v molekulární biologie a lékařství. Mikročip DNA je malý povrch, na kterém jsou s vysokou hustotou v určitém pořadí uloženy fragmenty jednovláknové syntetické DNA se známou sekvencí. Tyto fragmenty fungují jako sondy, se kterými hybridizují (vytvářejí dvouvláknové molekuly) komplementární řetězce DNA ze studovaného vzorku, obvykle značené fluorescenčním barvivem. Čím více molekul DNA s určitou sekvencí je ve vzorku, tím více se jich naváže na komplementární sondu a tím silnější bude optický signál v místě mikročipu, kam byla „zasazena“ odpovídající sonda. Po hybridizaci je povrch mikročipu naskenován a v důsledku toho je každá sekvence DNA spojena s tou či onou signální úrovní úměrnou počtu molekul DNA s touto sekvencí přítomných ve směsi.
V konvenčním DNA mikročipu (např. vyrobeném společností Affymetrix) jsou sondy připevněny k pevnému povrchu – skleněnému nebo silikonovému čipu. Jiné platformy, jako jsou ty od Illumina, používají místo velkých tvrdých povrchů mikroskopické kuličky. Technologie DNA microarray nachází širokou škálu aplikací v moderní biologii a medicíně pro analýzu komplexních směsí DNA - například souhrn všech transkriptů (messenger RNA) v buňce. DNA microarrays se používají k analýze změn v genové expresi, identifikaci jednonukleotidových polymorfismů, genotypování nebo resekvenování mutantních genomů. Mikročipy se liší designem, výkonem, přesností, účinností a cenou.
Příklad použití DNA microarray
Níže je uveden příklad experimentu využívajícího DNA microarray.
- Biologické vzorky jsou izolovány nebo pěstovány pro srovnání. Mohou odpovídat stejným jedincům před a po jakékoli léčbě (případ párového srovnání) nebo různým skupinám jedinců, např. nemocným a zdravým atd.
- Ze vzorku, který je předmětem studie, je izolována purifikovaná nukleová kyselina: může to být RNA při studiu profilu genové exprese, DNA při studiu komparativní genomové hybridizace atd. Tento příklad odpovídá prvnímu případu.
- Kontrola kvality a množství přijatého nukleová kyselina. Pokud jsou požadavky splněny, lze v experimentu pokračovat.
- Na základě dostupných vzorků RNA jsou v procesu reverzní transkripce syntetizovány komplementární sekvence DNA (cDNA, anglicky cDNA).
- V procesu amplifikace (syntézy dalších kopií DNA) se počet sekvencí cDNA ve vzorcích mnohonásobně zvyšuje.
- Fluorescenční nebo radioaktivní značky jsou připojeny ke koncům sekvencí cDNA.
- Výsledné vzorky, smíchané s nezbytnými Chemikálie jsou aplikovány na DNA mikročipy mikroskopickým otvorem a začíná hybridizační proces, během kterého se jeden z cDNA řetězců spojí s komplementárním řetězcem na mikročipu.
- Po ukončení hybridizačního procesu se čipy promyjí, aby se odstranil zbytkový materiál.
- Výsledné mikročipy jsou skenovány pomocí laseru. Výstupem jsou jedno- nebo dvoubarevné obrázky (v závislosti na množství použitých barviv).
- Na každém obrázku je umístěna mřížka, takže každá její buňka odpovídá řezu čipu se vzorky stejného typu. Intenzita luminiscence vzorků v buňce mřížky je přiřazena k určitému číslu, které v prvním přiblížení může sloužit jako míra počtu sekvencí RNA přítomných v odpovídajícím vzorku.
Další zpracování výsledků vyžaduje vícestupňové zapojení složitého statistického aparátu.
Předzpracování experimentálních dat
Korelace mezi intenzitami dvou vzorků stejného DNA mikročipu reprezentujícího stejný gen je obvykle větší než 95 %. Tato skutečnost je často interpretována jako potvrzení dobré reprodukovatelnosti experimentů s čipy. Pokud je však stejný biologický materiál rozdělen na dvě části a vyroben s různými mikročipy, korelace mezi získanými intenzitami bude pravděpodobně od 60 do 80 %. Korelace na čipech se vzorky odebranými myším ze stejného vrhu může klesnout až na 30 %. Pokud se experimenty provádějí v různých laboratořích, může být korelace mezi jejich výsledky ještě nižší.
Taková nízká reprodukovatelnost intenzit je spojena s kumulativním účinkem velkého počtu zdrojů variací. Lze je rozdělit do tří velkých skupin. Biologická variace zahrnuje přirozené rysy organismů. Technická odchylka se objevuje ve fázi izolace vzorku, barvení a hybridizace. Chyba měření je spojena se skenováním hotových polí, jejichž výsledky může ovlivnit například prach uvnitř skeneru.
Neutralizace účinků technických odchylek a chyb měření se provádí ve fázi předzpracování DNA mikročipem.
Korekce pozadí
Potřeba korekce pozadí je způsobena přítomností rušivých faktorů, jako je šum optický systém rozpoznávání (údaje o intenzitě získané během skenování se nerovnají "skutečným" intenzitám vzorku) a nespecifická hybridizace (připojení nukleotidových sekvencí k sondám cizích vzorků).
Normalizace
Normalizace dat umožňuje učinit několik čipů uvažovaných v experimentu vhodnými pro vzájemné srovnání. Hlavním cílem analýzy v této fázi je vyloučit vliv systematických nebiologických rozdílů mezi mikročipy. Zdrojů těchto rozdílů je mnoho: variace v účinnosti reverzní transkripce, značení barviv, hybridizace, fyzikální rozdíly mezi čipy, malé rozdíly v koncentracích činidel, variace v laboratorních podmínkách.
Ukazuje se, že volba normalizační metody má významný vliv na výsledek analýzy.
Shrnutí
Zobecnění hodnot úrovně exprese pro všechny vzorky odpovídající stejným sekvencím
Kontrola kvality
Zpracování emisí
Hlavní etapa statistického zpracování
Odkazy
- DNA microarray
- DNA microarray experiment – článek z anglické Wikipedie
- DNA Microarray Virtual Lab - krok za krokem interaktivní příklad experimentu s dvoubarevným DNA microarray
- Deset úskalí analýzy mikročipů – běžné chyby v analýze mikročipů DNA
Mladá kalifornská společnost Affymetrix (založená v roce 1993) je jedním z lídrů na trhu zařízení pro genetický výzkum.
Společnost je známá svou revoluční kombinací polovodičové technologie, takříkajíc „mikroobvodového“ průmyslu a biochemických testů.
DNA čipy od Affymetrix jsou široce používány v různých laboratořích zabývajících se genetickou analýzou a genetickým inženýrstvím.
Běžné lidi ale mnohem více zajímá jiný produkt firmy. Jedná se o zařízení podobné mikročipu, které umožňuje identifikovat desítky DNA z různých zvířat ve vzorku lidské potravy.
bioMerieux FoodExpert-ID je prakticky variací tzv. GeneChipu.
Zařízení dokáže identifikovat biologické stopy v potravinách od 12 druhů savců, 5 druhů drůbeže a 16 druhů ryb.
Umožňuje tak zjistit, zda husí paštika, která u kupujícího vyvolává podezření, skutečně obsahuje husí játra, a ne něco jiného.
DNA čip vzniká technologiemi podobnými počítačovým, ale nejedná se o elektrický, ale bio objekt (ilustrace z webu affymetrix.com).
A například muslimové mohou kontrolovat, zda nedbalí výrobci nedávají vepřové maso do „hovězích“ řízků.
To vše však funguje, pouze se zapojením dalších laboratorních schopností, takže běžný spotřebitel nebude moci čip používat v „nahé“ podobě na koleně.
Abyste pochopili, jak FoodExpert-ID funguje, musíte si zapamatovat trochu genetiky: dvojité šroubovice DNA, které tvoří jejich základní molekuly – adenin, guanin, thymin a cytosin, a také to, že mohou být spojeny pouze v párech, jako jsou klíče a zámky.
DNA čip obsahuje myriády a myriády „rozpůlených“ fragmentů kódu DNA.
Kousek povrchu čipu s klíčovými molekulami (ilustrace z webu affymetrix.com).
Povrch čipu o velikosti nehtu je rozdělen na 97 000 čtverců, kterým se říká „vlastnosti“.
Jakákoli "funkce" o průměru asi 26 mikronů obsahuje pouze jeden kód DNA. Přesněji řečeno, mnoho, mnoho podobných molekul.
A všechny absolutně odkazují na jedno z 33 zvířat.
Délka každého kusu je 17 základen. Pro spolehlivou identifikaci to stačí, protože k nalezení nějaké melodie z dostupné databáze stačí 17 pořízených not na libovolném místě.
Experimentátoři extrahují celý rozptyl rozbitých kousků DNA z potravinářského standardu. Co tam není. a co?
"Nesprávné" kusy genetických kódů jsou smyty a odpovídající se fixují na čip. Načervenalé kuličky jsou fluorescenční molekuly (ilustrace z affymetrix.com).
K molekulám, které tvoří genetický kód, přidejme molekuly fluorescenční látky. Naneste tuto směs na povrch FoodExpert-ID. Zbývá udělat málo.
Všechny odpovídající části kódu budou kombinovány s jejich "nativními" sekvencemi v té či oné "funkci".
Nyní lze čip omýt vodou - veškerý přebytek zmizí. Čip se umístí pod laserový paprsek a čtverečky obsahující zachycený materiál budou jasně zářit. Zbývá pouze zkontrolovat čipovou mapu, abyste zjistili, která DNA byla určena.
A podle intenzity záře si můžeme udělat nepřímý závěr o poměrech vepřového a hovězího masa v našem hypotetickém řízku.
Jak vidíme, implementace čipu je relativně snadná a umožňuje laboratořím s velmi konvenční sadou vybavení provádět genetickou analýzu.
Ale jak chytré je vytvoření čipu. K vytvoření takových biochemických mistrovských děl automaticky a hromadně spojil Affymetrix principy fotolitografie a kombinatorické chemie.
Barevné čtverečky jsou „funkce“ zodpovědné za identifikaci jednoho nebo druhého kódu DNA (ilustrace z webu affymetrix.com).
Výchozí produkt - křemenná deska - je potažena speciálním činidlem, silanem, které se pevně váže na křemen a tvoří přísně periodickou molekulární matrici (s rovnoměrnou povrchovou hustotou) připravenou přijímat nukleotidy.
V řetězcích nadcházejícího kódu jdou základy svisle nahoru a nanášejí se okamžitě na celý povrch, vrstvu po vrstvě.
Je zřejmé, že pokaždé, když se na čip nanese určitá látka a aby se zafixoval výhradně v určitých „vlastnostech“, používají se ty mikronové čtverečky, masky, podobné těm, které jsou potřeba pro výrobu mikroobvodů.
Snímek zareagovaného čipu s obrovským posílením. Sněhově bílé, načervenalé, žluté čtverce jsou oblasti s nejvyšší koncentrací fluorescenční látky. Zelená, modrá, černá - respektive se stále více s nízkým (ilustrace z webu affymetrix.com).
Pokaždé k základně čipu přilnou pouze ty základny, které jsou osvětleny otvory v masce ultrafialovým světlem.
V tomto procesu sekvenční syntézy je hlavní vždy aplikovat nejnovější masku s mikronovou přesností, jinak vše genetické kódy smíchané na talíři.
Krok za krokem (v potravinovém čipu jich je 17, v jiných modelech firmy až 24) tak vznikají vertikální sloupce nukleotidových řetězců, které tvoří klíče-analyzátory genů.
Tento vývoj samozřejmě slouží nejen pro tak směšné (na první pohled možná) oblasti použití, jako je detekce selata v husí paštice, ale i pro zcela seriózní výzkum.
Opravdu, na povrchu čipu, na teoretické úrovni, můžete použít kousky jakéhokoli druhu genetických kódů.
Affymetrixova práce je nadbytečným potvrzením toho, že k nejpozoruhodnějším a nejslibnějším objevům dochází na průsečíku věd a disciplín.
Vypadá to jako biologická hojnost v přírodě, získaná smícháním genů. Není to ono?
