Võimaldab analüüsida tohutul hulgal geneetilisi tunnuseid ühes lähtematerjali proovis. Sel juhul on soovitav, et DNA kiipidel oleks kaks omadust, mis teatud mõttes on omavahel vastuolus. Ühest küljest on huvitav, et ühes DNA kiibis oleks võimalikult palju rakke, et saada uuritava proovi kohta rohkem infot. Samas on teadlased sageli sunnitud töötama väga väikeste bioloogilise materjali mahtudega, seega mida väiksem on DNA kiip, seda parem.

Kaasaegsed meetodid(näiteks aatomjõumikroskoopia, AFM) võimaldavad tuvastada signaali DNA kiibi rakkudes, kui nende mõõtmed on mitukümmend nanomeetrit. Selliste DNA kiipide valmistamise meetodid põhinevad litograafial (kõige atraktiivsem meetod on dip-pen nanolitography, DPN). Selliste väikeste rakkudega kiipide ehitamine on tavaliselt üsna kulukas ja aeganõudev.

Rühm USA ja Korea teadlasi pakkus välja meetodi odavamaks, kiiremaks ja masstoodang DNA mikro- ja nanokiibid. Teadlased näitasid, et võttes prooviks ühe DNA kiibi, on võimalik ühe sammuga printida originaalkiibi komplementaarne kiip. Seda DNA kiipide saamise meetodit nimetatakse supramolekulaarse nanoprintimise meetodiks (supramolekulaarne nanostantsimine, SuNS) ja see on skemaatiliselt näidatud joonisel 1.

Proovina võtsid teadlased kulla nanoosakestega õmmeldud üheahelalise DNA massiivi, mille raku suurus oli 9 ± 2 nm ja rakkude vaheline kaugus oli 77 ± 9 nm. Sellele DNA kiibile lisati 5'-otsas heksüültiooliga modifitseeritud komplementaarne DNA. Pärast hübridisatsiooni (st komplementaarsete DNA ahelate sidumist) asetati proovikiibile kullaga kaetud klaasist substraat. Selle uue substraadi külge kinnitatakse täiendavad DNA ahelad. Seejärel viidi 90 ° C juures läbi dehübridisatsioon ja selle tulemusena saadi jäljend, mis täiendas esialgset proovi.

Pärast saadud koopia uurimist jõudsid teadlased järeldusele, et jäljendi tegemine õnnestus: uuel DNA kiibil olid 14 ± 2 nm suurused rakud, mida eraldasid 77 ± 10 nm vahed (joonis 2). Näitamaks, et lahtrite paigutus massiivis on proovi ja prindi puhul sama, arvutati mõlemal juhul radiaalne jaotusfunktsioon (joonis 3). On näha, et funktsioonid osutusid üsna sarnaseks.

Edaspidi on vaja näidata, et SuNS sobib mitmekomponentsete kiipide printimiseks ja ühest proovist paljude koopiate tootmiseks ilma täpsust kaotamata. Teadlased usuvad, et suudavad seda lähitulevikus näidata.

Ajakirjas ilmus töö "Application of supramolecular nanostamping to the replikatsioon DNA nanoarrays". Nano kirjad.

Viimasel ajal on aktiivselt arendatud DNA tehnoloogiaid, mis võimaldavad mitte ainult tunnuse määrata, vaid ka samaaegselt läbi viia diferentsiaaljärjestamist, s.t. punktmutatsioonide või polümorfismide määramine teadaolevates genoomi piirkondades. Nendel tehnoloogiatel on traditsiooniliste molekulaarbioloogiliste meetodite ees märkimisväärsed eelised, kuna need võimaldavad miniatuurseks muuta uuritava proovi ja analüsaatorit, mis vähendab oluliselt analüüsi maksumust ja selle teostamise aega, samuti määrata samaaegselt erinevaid uuritava proovi parameetreid, kaotamata seejuures võimendusmeetodite tundlikkust. Meetodite peamine eelis, mis põhineb kiipide kasutamisel kõigi võimalike oligonukleotiididega nukleotiidjärjestused antud pikkus on nende mitmekülgsus. Mis tahes järjestusega oligonukleotiidi olemasolu kiibil võimaldab analüüsida mis tahes uuritavat järjestust. Mikrokiipide kasutamine põhineb teatud ligandide ja paljude erinevate sondidega samaaegselt toimuva interaktsiooni kiire määramise põhimõttel. Tegelikult on bioloogilised mikrokiibid üks või teine ​​tahke substraat, millele on ladestatud teatud nukleiinhapete, valkude või süsivesikute fragmendid või mis tahes muud sondmolekulid, mida saab ära tunda või millel on bioloogiline aktiivsus. Erinevate sondide arv substraadil võib ulatuda sadadesse tuhandetesse ning igat tüüpi kiibid on rangelt identsed ning olemasolevate tehnoloogiate abil saab neid kopeerida sadade tuhandete ja miljonite substraadile paigutatud koopiatena.

DNA mikrokiibid

Seal on valk, DNA, süsivesikud, koe kiibid. erilist tähelepanu väärivad DNA kiipe. Need on ainulaadne analüütiline tööriist, mis võimaldab määrata antud DNA järjestuste olemasolu analüüsitavas proovis (tavaliselt bioloogilist päritolu) (nn hübridisatsioonianalüüs). Analüüs DNA kiipide abil on mitu korda odavam kui alternatiivsete tehnoloogiate kasutamine (elektroforees, reaalajas PCR) ja võimaldab lihtsa disainiga detektori juuresolekul töötada väljaspool laborit.

Esimest korda kasutati DNA-kiipe teadusuuringutes eelmise sajandi 80. aastate lõpus. See nüüd laialdaselt kasutatav meetod, mis võimaldab üheaegselt analüüsida mitme geeni ekspressiooni, põhineb mRNA või cDNA sihtmärkide äratundmise põhimõttel nende hübridiseerimise kaudu mikrokiibile immobiliseeritud üheahelaliste DNA fragmentidega.

DNA kiip on tahke substraat, millele on immobiliseeritud (reeglina kovalentselt) erineva pikkusega üheahelalised DNA fragmendid: lühikesed - 15-25 nukleotiidi, pikad - 25-60 nukleotiidi ja cDNA fragmendid - 100 kuni 3000 nukleotiidi. . Substraadi materjaliks on klaas, räni, mitmesugused polümeerid, hüdrogeelid (näiteks polüakrüülamiidi baasil) ja isegi kuld.

Hübridiseerimine on tehnoloogia alus

Kõigi kaasaegsete DNA tehnoloogiate aluseks on hübridisatsioon. Hübridisatsiooni tulemusena on nukleiinhappemolekulid võimelised moodustama stabiilseid kaheahelalisi struktuure tänu molekulide elementide – nukleotiidide – vahelistele sidemetele. Nukleotiid adeniin (A) on komplementaarne tümiiniga (T), guaniin (G) on komplementaarne tsütosiiniga (C). Selle tulemusena moodustab üheahelaline ATHC nukleotiidjärjestus stabiilse ühenduse, kaheahelalise struktuuri, TACG koostisega üheahelalise DNA molekuliga.

….. ATHC….

| | | |

….. TACG….

Selline komplementaarsus viib kahe DNA molekuli "kleepumiseni", millest üks võib olla substraadile liikumatult fikseeritud ja olla DNA kiibi element. Mida rohkem kiibi elemente täiendavaid molekule proovis on, seda rohkem seostub neist kiibiga ja seda suurem on sellest elemendist tajutava signaali intensiivsus. Joonisel fig. 1 näitab DNA raku või oligonukleotiidse biokiibi tööpõhimõtet, mis põhineb adeniini aluse komplementaarsetel interaktsioonidel ( A) tümiiniga ( T) ja guaniin ( G) tsütosiiniga ( KOOS) kahes DNA ahelas. Kui ühe DNA ahela (või oligonukleotiidi) alusjärjestus on teise ahela järjestusega täielikult komplementaarne, moodustub stabiilne täiuslik kaheahelaline heeliks - dupleks. Küll aga näiteks kasvõi ühe vale paari olemasolu dupleksis G-G, takistab dupleksi moodustumist. Kui mikrokiibi ühte elementi immobiliseeritakse konkreetne üheahelaline DNA või näiteks 20-meerne oligonukleotiid (sond), siis kui fluorestsentsvärvidega märgistatud DNA fragmendid, näiteks inimese genoom, lisatakse mikrokiibile, toimub nende väga spetsiifiline interaktsioon. Biokiibi antud oligonukleotiidne element seob spetsiifiliselt ainult ühe komplementaarse järjestuse 4 20 = 1,09 x 10 12 võimalikust DNA-s olevast sellise pikkusega järjestusest. Selle tulemusena täheldatakse fluorestseeruvat sära ainult sellel biokiibi täiendaval elemendil. Seega, üks biokiibi element toodab ühe proovi umbes triljonist võimalikust valikust, erinevalt elektroonilise kiibi elemendist, kus toimub binaarne proov: JAH või EI.

Riis. 1. Biokiibil DNA kaksikheeliksi moodustumise skeem. Oligonukleotiid on fikseeritud ühele biokiibi elemendile ja seob valikuliselt ainult komplementaarset paljudest fluorestseeruvalt märgistatud DNA fragmentidest. Selle tulemusena hakkab ainult see element helendama. See on tingitud komplementaarsete aluspaaride väga spetsiifilistest interaktsioonidest. A Koos T Ja G Koos KOOS. Näiteks mittekomplementaarse paari olemasolu G-G, takistab interaktsiooni ja jätab mikrokiibi elemendi tumedaks.

Hübridisatsiooniparameetrite määramiseks kasutatavad seadmed võimaldavad salvestada mitte ainult lõpptulemust, vaid ka komplementaarsete ahelate assotsiatsiooni- ja dissotsiatsioonikineetikat. Need tehnoloogiad, mis võimaldavad proovide mitme parameetriga analüüsi, võivad anda palju teavet. Hübridisatsiooni tulemused sõltuvad DNA proovi pikkusest, märgistatud DNA sihtmärgi keemilisest koostisest, hübridiseerimise temperatuurist, hübridisatsioonisegu koostisest ja fluorestseeruva märgise tüübist. Siinkohal tuleb märkida, et passiivset hübridisatsiooni kasutatakse peamiselt DNA kiipides; sihtmärk-DNA interaktsioon immobiliseeritud prooviga on tõenäosuslik protsess ja sõltub erinevatest tingimustest.

DNA kiipide kasutamine

Uuritava organismi kõigi geenide seisundi hindamine ja tuvastamine on üks kriitilised ülesanded DNA-kiipide arendajate ette. Selle probleemi lahendust saab rakendada kõigi organismi geenide immobiliseerimises bioloogilisel kiibil, mis võimaldab igakülgselt hinnata geenide ja genoomi seisundit tervikuna. Biogeneetilised andmebaasid, mis sisaldavad kogu teavet (süstematiseeritud) erinevate organismide geenide ja genoomide kohta, pakuvad teadlastele suurepäraseid võimalusi DNA kiipide kujundamisel.

Biokiibi uuringute laialdase kasutamise peamisteks põhjusteks on kõrge tundlikkus, spetsiifilisus ja reprodutseeritavus, protseduuri lihtsus, paljude parameetrite samaaegse analüüsi võimalus ning suhteliselt madal töö maksumus. Samad põhjused panevad meid pidama biokiipe paljulubavaks vahendiks erinevaid valdkondi Rahvamajandus.

Kokkuvõttes tuleb märkida, et mikrokiibid on tõhus meetod kümnete kuni tuhandete geenide samaaegseks tuvastamiseks ja nende struktuurianalüüsiks, et tuvastada spetsiifilisi nukleotiidjärjestusi ja nende struktuuri nukleotiidide variatsioone. Kui aga geene esineb genoomis ühe või mitme koopia koguses, mida kliinilises praktikas pidevalt kohtab, on vajalik nende eelnev võimendamine. Enamik tõhus meetod DNA amplifikatsioon on polümeraasi ahelreaktsioon, mille käigus toimub DNA molekulide arvu eksponentsiaalne suurenemine mitmelt miljonilt või enama koopiani ning seda tüüpi PCR peamine eelis, kuna reaalajas võimaldab isegi kvantitatiivselt hinnata uuritavat maatriksit. . See on oluline fundamentaal- ja integraalteaduste arendamise probleemide lahendamiseks, samuti diagnostikameetodite tingimuste optimeerimiseks.

Seega on kahel meetodil, mis on mõnes teadusvaldkonnas ja rakendustehnoloogias juba traditsiooniliseks muutunud, koos nende puudustega täiesti ainulaadsed eelised.

Reaalajas PCR:

võimaldab hinnata algse maatriksi kogust;

Ei nõua täiendavaid töömahukaid tööetappe;

· elektroforeesi etapi puudumine minimeerib saastumise riski ja vähendab seega valepositiivsete tulemuste arvu;

· matemaatiliste analüüsimeetodite kasutamine võimaldab saadud tulemusi automaatselt tõlgendada ja kõrvaldab elektroforegrammide subjektiivse hindamise probleemi;

sätestab leebemad nõuded PCR labori korraldamisele ning tulemuste automaatsele registreerimisele ja tõlgendamisele;

võimaldab säästa aega.

Bioloogilised mikrokiibid:

võimaldama proovi ja analüsaatori miniatuursust;

säästab analüüsi aega ja kulusid;

võimaldab üheaegselt määrata mitut uuritava proovi parameetrit;

· omab kõrget võimendusmeetodite tundlikkust, spetsiifilisust ja reprodutseeritavust;

Tagab kasutamise lihtsuse.

Võimalik, et nende meetodite kombineerimine polümeraasi ahelreaktsiooni muutmisega mikrokiibi vormingusse võimaldab luua uue põlvkonna diagnostikasüsteemi, mida iseloomustavad järgmised omadused: suurem tundlikkus ja peamiselt nukleiinhapete tuvastamise spetsiifilisus, kõrge tootlikkus. madalate analüüsikuludega, vähendades üldiselt manipulatsioonide arvu analüüsi igas etapis.



Geeni ekspressioon- see on protsess, mille käigus geenist pärilik informatsioon (DNA nukleotiidide järjestus) muudetakse funktsionaalseks produktiks - RNA-ks või valguks. Geeniekspressiooni reguleerimine võimaldab rakkudel kontrollida oma struktuuri ja funktsiooni ning on rakkude diferentseerumise, morfogeneesi ja kohanemise aluseks.

DNA kiibid on ainulaadne analüütiline tööriist, mis võimaldab määrata antud DNA järjestuste olemasolu analüüsitavas proovis (tavaliselt bioloogilist päritolu) (nn hübridisatsioonianalüüs). Analüüs DNA kiipide abil on mitu korda odavam kui alternatiivsete tehnoloogiate kasutamine (elektroforees, reaalajas PCR) ja võimaldab lihtsa disainiga detektori juuresolekul töötada väljaspool laborit.

Esimest korda DNA kiibid 1980. aastate lõpus kasutati uurimistöös. See nüüd laialdaselt kasutatav meetod, mis võimaldab üheaegselt analüüsida mitme geeni ekspressiooni, põhineb mRNA või cDNA sihtmärkide äratundmise põhimõttel nende hübridiseerimise kaudu mikrokiibile immobiliseeritud üheahelaliste DNA fragmentidega. Kaasaegne DNA mikrokiip koosneb tuhandeid deoksüoligonukleotiide (sonde või proove), mis on rühmitatud mikroskoopiliste täppide kujul ja fikseeritud tahkele substraadile. Iga punkt sisaldab mitut pmol DNA-d, millel on spetsiifiline nukleotiidjärjestus. DNA mikrokiibi oligonukleotiidid võivad olla lühikesed geenilõigud või muud DNA funktsionaalsed elemendid ja neid kasutatakse hübridiseerimiseks cDNA või mRNA-ga (cRNA). Sondi-sihtmärgi hübridisatsioon tuvastatakse ja kvantifitseeritakse fluorestsentsi või kemoluminestsentsi abil, mis võimaldab määrata antud järjestuse nukleiinhappe suhtelist kogust proovis.

Tavalises DNA mikrokiibis kinnitatakse sondid kovalentselt tahkele pinnale – klaas- või ränikiibile. Teised platvormid, näiteks Illumina valmistatud, kasutavad suurte kõvade pindade asemel mikroskoopilisi palle.

DNA mikrokiipe kasutatakse geeniekspressiooni muutuste analüüsimiseks, üksikute nukleotiidide polümorfismide tuvastamiseks, genotüpiseerimiseks või mutantsete genoomide uuesti sekveneerimiseks. Mikrokiibid erinevad disaini, jõudluse, täpsuse, tõhususe ja maksumuse poolest.

DNA mikrokiibid:

CDNA mikrokiibid

oligonukleotiid

(kahevärviline fluorestsentsi tuvastamisega)

oligonukleotiid

(Affymetrix, ühevärviline fluorestsentsi tuvastamisega)

membraani c-DNA mikrokiibid

(radioaktiivse tuvastusega)

Geeli c-DNA kiibid

Valgu mikrokiibid

Natuke ajalugu

1980ndad: valgukrõpsud

~1991: toetatud DNA sünteesi keemia (kõrge tihedusega) – Affymetrixi oligonukleotiidkiibid (Fodor, Stryer, Lockhart)

~1995: mikrokaevamisrobotid – Stanfordi ülikooli cDNA kiibid (Pat Brown ja Dari Shalon)

1990ndad: IMB geelilaastud

Kuid juba 1982. aastal pakkusid Augenlicht ja Kobrin välja DNA massiivi ( Vähk Uurimine) ja 1984. aastal valmistasid nad vähirakkude uurimiseks kiibi, mis sisaldas 4000 elementi.

(Artikkel lükati tagasi TeadusJa Loodus)

Mida saab DNA mikrokiipide abil uurida?

Geeni ekspressioon erinevates kudedes

Geeni ekspressioon normaalsetes ja patoloogilistes tingimustes (normaalsetes ja vähirakkudes)

Muutused geeniekspressioonis aja jooksul välismõjude tagajärjel (raku koostoime patogeeniga, ravim)

Väljendusprofiilid(mustrid) erinevad normaalsete ja vähirakkude või erinevat tüüpi vähirakkude vahel. Ravitavad ja ravimatud leukeemia tüübid tekitavad erinevaid mustreid. Mustrite tüübi järgi on suure tõenäosusega võimalik ennustada haiguse kulgu kõige varasemas staadiumis.

Ekspressiooni mikrokiibid

Üks aktiivselt arendatud valdkondi, mis kasutab mikrokiibi tehnoloogiat, on keeruliste haiguste transkriptsiooniprofiilide uurimine. Kuigi kõik meie keha rakud jagavad sama päritud genoomset DNA-d, ekspresseerib iga rakk mRNA-na erinevaid geene vastavalt rakutüübile, bioloogilistele protsessidele, normaalsetele või patoloogilistele seisunditele jne. Seda geeniekspressiooniprofiilide mitmekesisust uuritakse intensiivselt selle bioloogilise ja kliinilise tähtsuse tõttu. Mikrokiibi tehnoloogia võime analüüsida sadade ja tuhandete geenide ekspressiooni on osutunud enim nõutavaks sellise keerulise haiguse nagu vähk dešifreerimisel. Microarray tehnoloogia võimaldab samaaegselt jälgida kümnete tuhandete geenide ekspressiooni, luues rakust molekulaarse portree. Geeniekspressiooniprofiilide uurimise kõige olulisemad tagajärjed hõlmavad paljude vähitüüpide diagnoosimist, kihistumist ja prognoosi. Kuigi histopatoloogiline hindamine, mida täiendab tsütogeneetiline uurimine ja mitmete molekulaarsete markerite analüüs, on endiselt diagnoosimise ja prognoosimise kuldstandard, näitavad hiljutised tööd, et paljudel juhtudel saab seda asendada geeniekspressiooni profiilide koostamisega. Vähi diagnoosimiseks ja prognoosimiseks on vaja mitme praktiku, nagu onkoloogid, patoloogid ja tsütogeneetikud, ühiseid teadmisi ning lõplikud järeldused võivad erineda olenevalt metoodilistest lähenemisviisidest ja ekspertide asjatundlikkusest. Mikrokiibid võiksid täielikult asendada paljude spetsialistide jõupingutused, lisaks parandada diagnoosi ja prognoosi täpsust ning pakkuda ühtset standardiseeritud analüüsiplatvormi.

Geeniekspressiooni analüüsimiseks kasutatakse kahte tüüpi mikrokiipe: põhinevad komplementaarsel DNA-l (cDNA) ja põhinevad oligonukleotiidsondidel. cDNA-põhised mikrokiibid on standardsete mikroskoopiliste klaaside pinnale või muule tahkele substraadile fikseeritud DNA fragmendid. Oligonukleotiidid pikkusega 25–60 nukleotiidi alust (nb) immobiliseeritakse oligonukleotiidide mikrokiipides samal substraadil. Proovi ettevalmistamise protseduur mikrokiipide analüüsiks on näidatud joonisel 1. 2. Rakkudest eraldatakse kogu RNA (mõnikord eraldatakse ka mRNA fraktsioon), seejärel viiakse läbi pöördtranskriptsioonireaktsioon, kasutades kombineeritud praimerit, mis sisaldab polüA-terminaalse mRNA fragmendi ja T7 RNA polümeraasi piirkonnaga komplementaarset järjestust. promootor. T7 RNA polümeraasi promootori järjestuse kaasamine sünteesitavasse cDNA ahelasse võimaldab edaspidi in vitro amplifikatsioonireaktsiooni läbi viia: T7 RNA polümeraasi ensüüm toodab palju RNA koopiaid igast katseklaasis olevast cDNA molekulist. Nii toimub algse mRNA lineaarne amplifikatsioon. Reeglina toimub saadud RNA molekulide märgistamine samaaegselt, kuna reaktsioonis kasutatakse fluorestseeruvat märgist sisaldavaid nukleotiide. Oligonukleotiidide mikrokiipidega katsetes kasutatakse sageli komplementaarse RNA (cRNA) proovi märgistamiseks sama tüüpi fluorestseeruvat märgist ja geeniekspressiooni tasemed määratakse saadud fluorestseeruvate signaalide võrdlemisel mikrokiibi sisemiste kontrollpunktide signaalidega. Töötades cDNA-põhiste mikrokiibidega, kasutatakse katses reeglina 2 proovi: kontrollproov märgistatakse ühe fluorestsentsvärviga, uuritav proov teisega, seejärel segatakse ja hübridiseeritakse ühe mikrokiibiga. Vastavalt kahe erineva fluorestseeruva märgise suhtele mikrokiibi igas rakus hinnatakse antud geeni ekspressioonitaseme tõusu või langust. Olenemata tehnoloogilisest platvormist genereerib iga katse andmeid, mis sisaldavad hinnangut kümnete ja sadade tuhandete geenide ekspressioonitasemele. Sellise andmehulga töötlemiseks kasutatakse üsna keerukat matemaatilist aparaati, eelkõige klasteranalüüsi. Mikrokiibi andmeid saab analüüsida seoses kliiniliste andmetega (hüpoteesile orienteeritud analüüs, järelevalvega analüüs) või ilma patsiendi kliiniliste tunnusteta (sõltumatu analüüs, järelevalveta analüüs).

Klassikalised meetodid võimaldavad analüüsida mitme geeni ekspressiooni samaaegselt või nõuavad spetsiaalsete mikrokiibi tehnoloogiate kasutamist, näiteks nagu Affymetrix. Affymetrix kasutab fotolitograafia ja keemiline süntees oligonukleotiidid GeneChip® mikrokiipide tootmiseks.

KOLLANE- kui geen ekspresseerub nii haigetes (Cy5) kui ka normaalsetes (Cy3) kudedes, siis selles kohas hübridiseerub nii punase kui rohelise värviga märgistatud DNA ja tulemuseks on kollane.

PUNANE- kui geen ekspresseerub ainult haiges (Cy5) koes, hübridiseerub selles kohas ainult punase värviga märgistatud DNA

ROHELINE- kui geen ekspresseerub ainult terves (Cy3) koes, hübridiseerub selles kohas ainult rohelise värviga märgistatud DNA

MUST- kui geen ei avaldu haiges ega terves koes

Seega

DNA mikrokiibid võimaldavad samaaegselt analüüsida teavet paljude tuhandete geenide ekspressiooni kohta.

Peamised praegu kasutatavad DNA mikrokiibid on cDNA mikrokiibid ja Affymetrixi oligonukleotiidkiibid.

cDNA mikrokiibid põhinevad erinevate fluorestsentsvärvidega märgistatud eksperimentaalsete ja kontrollproovide hübridiseerimisel kiibile, mille pinnale on ladestatud kaheahelaline c-DNA, mis vastab ~10 000-20 000 geenile.

Affimetrixi mikrokiibid põhinevad eksperimentaalse proovi biotiiniga märgistatud cRNA hübridiseerimisel Perfect Match ja Mismatch oligonukleotiidide komplektiga, mis on sünteesitud kiibi substraadil, millele järgneb streptavidiin-fükoerütriini värvimine. GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 võimaldab samaaegselt analüüsida 47 000 transkripti, sealhulgas 38 500 iseloomustatud geeni. Mikrokiip sisaldab 1 300 000 erinevat tüüpi oligonukleotiidi.

Saadud andmete analüüs nõuab mitmeastmelist matemaatilist töötlemist spetsiaalsete statistiliste meetodite abil.

Praktilises plaanis võimaldab mikrokiipide kasutamine juba täna lahendada järgmisi probleeme:

täpne diagnoos, haiguse uute alatüüpide tuvastamine, klassifikatsiooni täpsustamine;

haiguse kulgemise ja kliinilise tulemuse ennustamine, onkohematoloogiliste haiguste patogeneesis osalevate geenide ja signaaliradade väljaselgitamine, uute sihtmärkide otsimine suunatud diferentseeritud ravile;

lihtsamate ja odavamate, sh mikrokiibitehnoloogial põhinevate diagnostiliste testide väljatöötamine ja loomine (kümnete ja sadade tuhandete asemel kümnete või sadade geenide proove sisaldavad mikrokiibid);

mikrokiipide kaasamine prospektiivsetesse kliinilistesse uuringutesse, mikrokiipide analüüsi tulemuste kinnitamine kliinilistesse raviprotokollidesse lisamiseks, kliiniliste protokollide koostamine võttes arvesse uusi andmeid haiguste olemuse kohta, mis on saadud mikrokiibi tehnoloogia abil.

DNA mikrokiip(inglise DNA microarray) on keeruline tehnoloogia, mida kasutatakse molekulaarbioloogia ja meditsiin. DNA mikrokiip on väike pind, millele ladestuvad teatud järjestuses suure tihedusega üheahelalise sünteetilise DNA fragmendid, mille järjestus on teada. Need fragmendid toimivad sondidena, millega hübridiseerivad (moodustavad kaheahelalisi molekule) uuritavast proovist pärinevaid komplementaarseid DNA ahelaid, mis on tavaliselt märgistatud fluorestsentsvärviga. Mida rohkem on proovis kindla järjestusega DNA molekule, seda rohkem seostub neist komplementaarse sondiga ning seda tugevam on optiline signaal mikrokiibi punktis, kuhu vastav sond “istutati”. Pärast hübridisatsiooni skaneeritakse mikrokiibi pind ja selle tulemusena seostatakse iga DNA järjestus ühe või teise signaalitasemega, mis on võrdeline selle järjestusega segus esinevate DNA molekulide arvuga.

Tavalises DNA mikrokiibis (nt tootja Affymetrix) on sondid kinnitatud tahkele pinnale – klaasist või silikoonkiibist. Teised platvormid, näiteks Illumina valmistatud, kasutavad suurte kõvade pindade asemel mikroskoopilisi palle. DNA mikrokiibi tehnoloogia leiab kaasaegses bioloogias ja meditsiinis väga erinevaid rakendusi DNA keeruliste segude analüüsimiseks – näiteks kõigi rakus olevate transkriptide (messenger RNA) kogumi jaoks. DNA mikrokiipe kasutatakse geeniekspressiooni muutuste analüüsimiseks, ühe nukleotiidi polümorfismide tuvastamiseks, genotüpiseerimiseks või mutantsete genoomide resekveneerimiseks. Mikrokiibid erinevad disaini, jõudluse, täpsuse, tõhususe ja maksumuse poolest.

Näide DNA mikrokiibi kasutamisest

Allpool on näide katsest, milles kasutati DNA mikrokiibi.

1. Bioloogilised proovid eraldatakse või kasvatatakse võrdlemiseks. Need võivad vastata samadele isikutele enne ja pärast mis tahes ravi (paarisvõrdluse juhtum) või erinevatele isikute rühmadele, nt haiged ja terved jne.
2. Proovist eraldatakse puhastatud nukleiinhape, mis on uuringu objektiks: see võib olla RNA geeniekspressiooniprofiili uurimisel, DNA võrdleva genoomse hübridisatsiooni uurimisel jne. See näide vastab esimesele juhtumile.
3. Saabunud kauba kvaliteedi ja koguse kontrollimine nukleiinhape. Kui nõuded on täidetud, võib katset jätkata.
4. Olemasolevate RNA proovide põhjal sünteesitakse pöördtranskriptsiooni käigus komplementaarsed DNA järjestused (cDNA, inglise cDNA).
5. Amplifikatsiooni (DNA täiendavate koopiate sünteesi) käigus suureneb cDNA järjestuste arv proovides kordades.
6. Fluorestseeruvad või radioaktiivsed märgised on kinnitatud cDNA järjestuste otstele.
7. Saadud proovid segatakse vajalikuga kemikaalid kantakse DNA mikrokiipidele läbi mikroskoopilise augu ja algab hübridisatsiooniprotsess, mille käigus üks cDNA ahelatest liitub komplementaarse ahelaga mikrokiibil.
8. Pärast hübridiseerimisprotsessi lõppu pestakse kiipe jääkmaterjali eemaldamiseks.
9. Saadud mikrokiibid skaneeritakse laseriga. Väljundiks on ühe- või kahevärvilised pildid (olenevalt kasutatud värvainete kogusest).
10. Iga pildi peale asetatakse ruudustik, nii et iga selle lahter vastab sama tüüpi näidistega kiibile. Proovide luminestsentsi intensiivsus ruudustiku lahtris on määratud teatud arvule, mis esimeses lähenduses võib olla vastavas proovis esinevate RNA järjestuste arvu mõõt.

Tulemuste edasine töötlemine nõuab keeruka statistikaaparaadi mitmeastmelist kaasamist.

Katse andmete eeltöötlus

Korrelatsioon sama DNA mikrokiibi kahe sama geeni esindava proovi intensiivsuse vahel on tavaliselt suurem kui 95%. Seda fakti tõlgendatakse sageli kui kinnitust kiibidega tehtud katsete hea reprodutseeritavuse kohta. Kui aga sama bioloogiline materjal jagada kaheks osaks ja teha erinevate mikrokiipidega, on saadud intensiivsuste vaheline korrelatsioon tõenäoliselt 60–80%. Korrelatsioon kiipidel sama pesakonna hiirtelt võetud proovidega võib langeda 30%-ni. Kui katseid tehakse erinevates laborites, võib nende tulemuste korrelatsioon olla veelgi väiksem.

Intensiivsuse selline madal reprodutseeritavus on seotud suure hulga variatsiooniallikate kumulatiivse mõjuga. Neid saab jagada kolme suurde rühma. Bioloogiline varieeruvus hõlmab organismidele omaseid tunnuseid. Tehniline erinevus ilmneb proovi eraldamise, värvimise ja hübridiseerimise etapis. Mõõtmisviga seostatakse valmis massiivide skaneerimisega, mille tulemusi võib mõjutada näiteks skanneri sees olev tolm.

Tehnilise variatsiooni ja mõõtmisvea mõju neutraliseerimine viiakse läbi DNA mikrokiibi eeltöötluse etapis.

Tausta korrigeerimine

Taustakorrektsiooni vajadus tuleneb segavate tegurite, näiteks müra olemasolust optiline süsteemäratundmine (skaneerimisel saadud intensiivsuse andmed ei võrdu "päris" proovi intensiivsustega) ja mittespetsiifiline hübridisatsioon (nukleotiidjärjestuste kinnitamine võõrproovide sondide külge).

Normaliseerimine

Andmete normaliseerimine võimaldab muuta mitu katses käsitletud kiipi omavahel võrdlemiseks sobivaks. Analüüsi peamine eesmärk selles etapis on välistada süstemaatiliste mittebioloogiliste erinevuste mõju mikrokiipide vahel. Selliste erinevuste allikaid on palju: varieeruvus pöördtranskriptsiooni efektiivsuses, värvide märgistamine, hübridisatsioon, füüsikalised erinevused kiipide vahel, väikesed erinevused reaktiivi kontsentratsioonides, varieeruvus laboritingimustes.

On näidatud, et normaliseerimismeetodi valik mõjutab analüüsi tulemust oluliselt.

Kokkuvõte

Kõigi samadele järjestustele vastavate proovide ekspressioonitaseme väärtuste üldistamine

Kvaliteedi kontroll

Heitmete töötlemine

Statistilise töötlemise põhietapp

Lingid

• DNA mikrokiip
• DNA mikrokiibi eksperiment – ​​artikkel inglise Vikipeediast
• DNA Microarray Virtual Lab - samm-sammult interaktiivne näide katsest kahevärvilise DNA mikrokiibiga
• Mikrokiibi analüüsi kümme lõksu – levinud vead DNA mikrokiibi analüüsis

Noor California ettevõte Affymetrix (alustanud 1993. aastal) on geeniuuringute seadmete turuliidreid.

Ettevõte on tuntud oma revolutsioonilise pooljuhttehnoloogia, nii-öelda "mikroskeemide" tööstuse ja biokeemiliste testide kombinatsiooni poolest.

Affymetrixi DNA kiipe kasutatakse laialdaselt erinevates laborites, mis on seotud geenianalüüsi ja geenitehnoloogiaga.

Tavalisi inimesi aga huvitab hoopis rohkem mõni muu firma toode. See on mikrokiibilaadne seade, mis võimaldab inimtoidu proovis tuvastada kümneid erinevate loomade DNA-d.

bioMerieux FoodExpert-ID on praktiliselt nn GeneChipi variatsioon.

Seade suudab tuvastada 12 liigi imetajate, 5 linnuliigi ja 16 kalaliigi bioloogilisi jälgi.

Nii võimaldab see välja selgitada, kas ostjas kahtlust tekitav hanemapsaat sisaldab tõesti hanemaksa, mitte midagi muud.

DNA kiip luuakse arvutitega sarnaste tehnoloogiate abil, kuid see ei ole elektriline, vaid bioobjekt (illustratsioon veebisaidilt affymetrix.com).

Ja näiteks moslemid saavad kontrollida, kas hooletud tootjad panevad sealiha "veiseliha" kotlettidesse.

Kõik see aga toimib, ainult täiendava laborivõime kaasamisel, nii et tavatarbijal pole võimalik kiipi “alasti” kujul põlve peal kasutada.

FoodExpert-ID toimimise mõistmiseks peate meeles pidama pisut geneetikat: DNA kaksikheeliksid, mis moodustavad nende baasmolekulid - adeniin, guaniin, tümiin ja tsütosiin, samuti seda, et neid saab ühendada ainult paarikaupa, nagu võtmed ja lukud.

DNA kiip sisaldab müriaade ja müriaade DNA koodi "poolitatud" fragmente.

Tükk kiibi pinnast võtmemolekulidega (illustratsioon veebisaidilt affymetrix.com).

Küünte suuruse kiibi pind on jagatud 97 000 ruuduks, mida nimetatakse "funktsioonideks".

Iga umbes 26 mikroni suurune "funktsioon" sisaldab ainult ühte DNA-koodi. Täpsemalt palju-palju sarnaseid molekule.

Ja nad kõik viitavad absoluutselt ühele 33 loomast.

Iga tüki pikkus on 17 alust. Sellest piisab usaldusväärseks tuvastamiseks, sest 17 suvalises kohas järjestatud noodist piisab, et olemasolevast andmebaasist mõni meloodia leida.

Eksperimentaatorid eraldavad toidustandardist terve hulga purustatud DNA tükke. Mida seal pole. Ja mida?

"Valed" geneetiliste koodide tükid pestakse minema ja sobivad kinnitatakse kiibile. Punakad helmed on fluorestseeruvad molekulid (illustratsioon saidilt affymetrix.com).

Lisame geneetilise koodi moodustavatele molekulidele fluorestseeruva aine molekulid. Kandke see segu FoodExpert-ID pinnale. Teha on jäänud vähe.

Kõik vastavad koodilõigud kombineeritakse nende "natiivsete" järjestustega ühes või teises "funktsioonis".

Nüüd saab kiipi veega pesta – kõik üleliigne läheb ära. Kiip asetatakse laserkiire alla ja jäädvustatud materjali sisaldavad ruudud säravad eredalt. Jääb vaid kontrollida kiibi kaarti, et teada saada, milline DNA on määratud.

Ja sära intensiivsuse järgi saame teha kaudse järelduse sea- ja veiseliha proportsioonide kohta meie hüpoteetilises kotletis.

Nagu näeme, on kiibi rakendamine suhteliselt lihtne ja võimaldab väga tavapärase seadmestikuga laboritel teha geneetilist analüüsi.

Aga kui nutikas on kiibi loomine. Selliste biokeemiliste meistriteoste automaatseks ja hulgi loomiseks ühendas Affymetrix fotolitograafia ja kombinatoorse keemia põhimõtted.

Värvilised ruudud on "omadused", mis vastutavad ühe või teise DNA koodi tuvastamise eest (illustratsioon veebisaidilt affymetrix.com).

Esialgne toode – kvartsplaat – kaetakse spetsiaalse reagendi silaaniga, mis seondub tihedalt kvartsiga ja moodustab rangelt perioodilise (ühtlase pinnatihedusega) molekulaarmaatriksi, mis on valmis nukleotiide vastu võtma.

Tulevase koodi ahelates lähevad alused vertikaalselt ülespoole ja need kantakse kiht kihi haaval kohe kogu pinnale.

Ilmselgelt kasutatakse iga kord, kui kiibile kantakse teatud ainet ja selleks, et see kinnituks ainult teatud "omadustes", neid mikroni ruute, maske, mis on sarnased mikroskeemide tootmiseks vajalikele.

Hetktõmmis reageerinud kiibist tohutu tõukejõuga. Lumivalged, punakad, kollased ruudud on alad, kus fluorestseeruva aine kontsentratsioon on kõrgeim. Roheline, sinine, must – vastavalt järjest rohkem madalaga (illustratsioon veebisaidilt affymetrix.com).

Iga kord kleepuvad kiibi alusele ainult need alused, mis on läbi maski aukude ultraviolettvalgusega valgustatud.

Selles järjestikuse sünteesi protsessis on peamine asi mikroni täpsusega iga kord uusimat maski rakendada, vastasel juhul on kõik geneetilised koodid segada taldrikule.

Niisiis moodustuvad samm-sammult (toidukiibis on neid 17, ettevõtte teistes mudelites kuni 24) nukleotiidahelate vertikaalsed veerud, mis teevad geenide võtmed-analüsaatorid.

See arendus ei teeni muidugi mitte ainult selliseid naeruväärseid (võib-olla esmapilgul) rakendusvaldkondi, nagu põrsaliha tuvastamine hanepasteedis, vaid ka täiesti tõsist uurimistööd.

Tõepoolest, kiibi pinnal, edasi teoreetiline tase, saate rakendada igasuguseid geneetilisi koode.

Affymetrixi töö on üleliigne kinnitus, et kõige tähelepanuväärsemad ja paljutõotavamad avastused leiavad aset teaduste ja distsipliinide ristumiskohas.

See näeb välja nagu bioküllus looduses, mis on saadud geenide segamisel. Pole see?