STARPVALSTU STANDARTIZĀCIJAS, METROLOĢIJAS UN SERTIFIKĀCIJAS PADOME

STARPVALSTU STANDARTIZĀCIJAS, METROLOĢIJAS UN SERTIFIKĀCIJAS PADOME

STARPVALSTS

STANDARTS

VĪNS UN VĪNA MATERIĀLI

Ohratoksīna A satura noteikšana ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju

Oficiālais izdevums

Standartinform

Priekšvārds

Starpvalstu standartizācijas darba mērķi, pamatprincipi un pamatprocedūra ir noteikta GOST 1.0-92 “Starpvalstu standartizācijas sistēma. Pamatnoteikumi” un GOST 1.2-2009 “Starpvalstu standartizācijas sistēma. Starpvalstu standarti, noteikumi un ieteikumi starpvalstu standartizācijai. Noteikumi izstrādei, pieņemšanai, piemērošanai, atjaunināšanai un atcelšanai "

Par standartu

1 IZSTRĀDĀJA Sabiedrība ar ierobežotu atbildību "Lumex-Marketing" (SIA "Lumex Marketing")

2 IEVĒROJA Federālā aģentūra tehniskais regulējums un metroloģija (Rosstaidart)

3 PIEŅEMTI starpvalstu standartizācijas, metroloģijas un sertifikācijas padomē (protokols Nr. 47, datēts ar 2015. gada 18. jūniju)

4 Ar Federālās tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūras 2015. gada 21. jūlija rīkojumu Nr. 948-st starpvalstu standarts GOST 33287-2015 tika pieņemts kā valsts standarts. Krievijas Federācija no 2017. gada 1. janvāra

5 IEVADS PIRMO REIZI

Informācija par izmaiņām šajā standartā tiek publicēta ikgadējā informācijas rādītājā "Nacionālie standarti", bet izmaiņu un grozījumu teksts - ikmēneša informācijas rādītājā "Nacionālie standarti". Šī standarta pārskatīšanas (aizstāšanās) vai atcelšanas gadījumā ikmēneša informācijas rādītājā tiks publicēts attiecīgs paziņojums nacionālajiem standartiem. Attiecīgā informācija, paziņojumi un teksti tiek ievietoti arī publiskajā informācijas sistēmā - Federālās tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūras oficiālajā tīmekļa vietnē internetā

© Standartinform. 2016. gads

Krievijas Federācijā šo standartu nevar pilnībā vai daļēji reproducēt, pavairot un izplatīt kā oficiālu publikāciju bez Federālās tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūras atļaujas.

STARPVALSTU STANDARTS

VĪNS UN VĪNA MATERIĀLI

Ohratoksiskā A satura noteikšana ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju

Vīns un vīna materiāli.

Ohratoksīna A satura noteikšana ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju

Iepazīšanās datums - 2017-01-01

1 izmantošanas joma

Šis starptautiskais standarts attiecas uz vīnu un vīna materiāliem un nosaka metodi ohratoksīna A masas koncentrācijas noteikšanai, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC).

Ohratoksīna A masas koncentrācijas mērījumu diapazons ir no 0,001 līdz 0,1 mg/dm 3 .

Šī standarta 8. punktā ir izmantotas normatīvās atsauces uz šādiem standartiem:

GOST 12.1.004-91 Darba drošības standartu sistēma. Uguns drošība. Vispārīgās prasības

GOST 12.1.007-76 Darba drošības standartu sistēma. Klasifikācija un vispārīgās drošības prasības

GOST 12.1.010-76 Darba drošības standartu sistēma. Sprādziendrošs. Vispārīgās prasības

GOST 12.1.019-79 Darba drošības standartu sistēma. Elektriskā drošība. Vispārīgās prasības un aizsardzības veidu nomenklatūra

GOST 61-75 Etiķskābe. Specifikācijas

GOST 1770-74 (ISO 1042-63. ISO 4788-60) Laboratorijas stikla trauku mērīšana. Cilindri, vārglāzes, kolbas, mēģenes. Vispārīgās specifikācijas

GOST ISO 3696-2013 Ūdens laboratorijas analīzēm. Tehniskās prasības un kontroles metodes

GOST 4233-77 Reaģenti. Nātrija hlorīds. Specifikācijas GOST 4204-77 Reaģenti. Sērskābe. Specifikācijas

GOST ISO 5725*6-2003° Mērījumu metožu un rezultātu precizitāte (pareizība un precizitāte). 6. daļa. Precizitātes vērtību izmantošana praksē GOST 6709-72 Destilēts ūdens. Specifikācijas GOST 9293-74 (ISO 2435-73) Gāzveida un šķidrais slāpeklis. Specifikācijas GOST 16317-87 Sadzīves elektriskās saldēšanas iekārtas. Vispārīgās specifikācijas GOST ISO/IEC 17025-2009 Vispārīgās prasības testēšanas un kalibrēšanas laboratoriju kompetencei

GOST 25336-82 Stikla trauki un laboratorijas aprīkojums. Veidi. Pamatparametri un izmēri GOST 29227-91 (ISO 835*1-61) Laboratorijas stikla trauki. Pipetes absolvēja. 1. daļa. Vispārīgās prasības

GOST 31730-2012 Vīna izstrādājumi. Pieņemšanas noteikumi un paraugu ņemšanas metodes GOST OIML R 76-1-2011 Valsts sistēma mērījumu vienveidības nodrošināšanai. Neautomātiskie svari. 1. daļa. Metroloģiskās un tehniskās prasības. Pārbaudes

Piezīme - Izmantojot šo standartu, ieteicams pārbaudīt atsauces standartu derīgumu publiskajā informācijas sistēmā - Federālās tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūras oficiālajā tīmekļa vietnē internetā vai saskaņā ar ikgadējo informāciju.

"" Krievijas Federācijā ir GOST R ISO 5725-6-2002 "Mērījumu metožu un rezultātu precizitāte (pareizība un precizitāte). 6. daļa. Precizitātes vērtību izmantošana praksē.

indeksu "Nacionālie standarti", kas tika publicēts ar kārtējā gada 1.janvāri, un atbilstoši ikmēneša informācijas indeksa "Nacionālie standarti" izdevumiem par kārtējo gadu. Ja atsauces standarts tiek aizstāts (modificēts), tad, izmantojot šo standartu, jums jāvadās pēc aizstājošā (modificētā) standarta. Ja atsauces standarts tiek atcelts bez aizstāšanas, noteikums, kurā ir sniegta atsauce uz to, attiecas tiktāl, ciktāl šī atsauce netiek ietekmēta.

3 Paraugu ņemšana un parauga sagatavošana pārbaudei

Paraugu ņemšana saskaņā ar GOST 31730.

Vīni no augsts saturs oglekļa dioksīds ir iepriekš degazēts. Lai to izdarītu, 50 ml produkta ievieto kolbā ar 100 ml mēģeni (skatīt 6.22. punktu), sakrata un pievieno vakuumsūknim (sk. 6.6.). Degasējiet 10-15 minūtes, līdz pazūd putas un uz šķidruma virsmas parādās lieli burbuļi.

4 Drošības prasības

Veicot mērījumus, jāievēro šādas prasības:

Elektriskā drošība saskaņā ar GOST 12.1.019 un hromatogrāfa tehnisko dokumentāciju:

Eeryesafety saskaņā ar GOST 12.1.010;

Ugunsdrošība saskaņā ar GOST 12.1.004;

Drošība darbā ar kaitīgām vielām saskaņā ar GOST 12.1.007.

BRĪDINĀJUMS – Ohratoksīns A izraisa nieru un aknu bojājumus un

iespējams, kancerogēns. Visi darbi, kas saistīti ar paraugu sagatavošanu un ohratoksīna A šķīdumu sagatavošanu, jāveic velkmes pārsegā, izmantojot aizsargapģērbu, cimdus un aizsargbrilles. Stikla trauku, kas bijuši saskarē ar ohratoksīnu A, dekontamināciju veic ar 4% nātrija hipohlorīta šķīdumu.

5 Metodes būtība

Metodes pamatā ir ohratoksīna A ekstrakcija no parauga ar paskābinātu metilēnhlorīdu, iegūtā ekstrakta koncentrēšana, paraugu skrīnings un ohratoksīna A masas koncentrācijas noteikšana, izmantojot HPLC reversā kolonnā ar fluorimetrisko noteikšanu.

6 Mērinstrumenti, palīgiekārtas, standartmateriāli, reaģenti, stikla trauki un materiāli

6.1. Šķidruma hromatogrāfs ar fluorimetru vai spsktrofluorimstrich detektoru, kas nodrošina fluorescences ierosmi spektra apgabalā (330 ± 20) nm un fluorescences intensitātes reģistrēšanu spektra apgabalā (465 ± 20) nm. Izmantotajam detektoram jānodrošina ohratoksīna A noteikšanas robeža, kas nepārsniedz 5 ng/cm 3 .

6.2. Neautomātiskie svari saskaņā ar GOST OIML R 76-1 ar pieļaujamās absolūtās kļūdas robežām ne vairāk kā ± 0,01 g.

6.3. Analītiskā hromatogrāfijas kolonna, kas piepildīta ar apgrieztās fāzes sorbentu, kura daļiņu izmērs ir 5 µm. kuru efektivitāte ir vismaz 5000 teorētisko plākšņu ohratoksīna A maksimumam "\

6.4. Aizsargkolonna ar tādu pašu iekšējo diametru un piepildīta ar tādu pašu apgrieztās fāzes sorbentu kā analītiskā kolonna.

6.5 Rotācijas iztvaicētājs, aprīkots ar ūdens vannu ar temperatūras regulatoru diapazonā no 20 °C līdz 50 °C.

6.6 Laboratorijas vakuuma, diafragmas vai ūdens strūklas sūknis saskaņā ar GOST 25336, nodrošinot vakuumu no 2,5 līdz 10 kPa.

0 Komerciāla produkta piemērs, kas atbilst noteiktajām prasībām. - hromatogrāfijas kolonna ar iekšējo diametru 2,1 mm un garumu 120 mm. pildīts ar reverso izvadīšanas sorbentu Kromasil S-18. Alltfcna C18 un citi, kuru daļiņu izmērs ir 5 μm. aprīkots ar 25 mm garu priekškausu. Šī informācija ir sniegta šī starptautiskā standarta lietotāju ērtībām, un tā nav norādītā produkta apstiprinājums.

6.7 Žāvēšanas skapis, kas nodrošina temperatūru līdz 200 C.

6.8 Sadzīves ledusskapis saskaņā ar GOST 16317.

6.9. Laboratorijas centrifūga ar ātrumu vismaz 5000 apgr./min.

6.10. Starpvalstu vai metroloģiski nodrošināts tās valsts nacionālajā mērījumu sistēmā, kura pieņēmusi standartu, valsts standarta paraugs 1 "ohratoksīna A šķīduma sastāva acetonitrila masas koncentrācijā 50 μg/cm 3 ar sertificētās vērtības kļūdu ne vairāk kā ± 2,5 μg / cm 3. Sastāva standartparaugu izmantošana pieļaujama ohratoksīna A šķīdums citos šķīdinātājos, kas jāņem vērā, gatavojot sākotnējo šķīdumu saskaņā ar 7.3.1.

6.11 destilēts ūdens saskaņā ar GOST 6709 vai ūdens 1. tīrības laboratorijas analīzei saskaņā ar GOST ISO 3696.

6.12 Etiķskābe saskaņā ar GOST 61. ledus.

6.13. Acetonitrils šķidrumu hromatogrāfijai, optiskais blīvums attiecībā pret destilētu ūdeni pie 200 nm, ne vairāk kā 0,025, ūdens masas daļa, ne vairāk kā 0,03%.

6.14. Metilēnhlorīds augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijai saskaņā ar normatīvie dokumenti kas darbojas standartu pieņēmušās valsts teritorijā.

6.15 Sērskābe saskaņā ar GOST 4204, x. h vai h.

8.16 Nātrija hlorīds saskaņā ar GOST 4233. x. h.

6.17 Pipetes, graduēts 1-2-2-1. 1-2-2-2. 1-2*2*5, 1-2-2-10 vai citi veidi un dizaini saskaņā ar GOST 29227.

6.18. Mērcilindri 1-25-2.1-50-2.1-250-2 vai cita konstrukcija saskaņā ar GOST 1770.

6.19 Mērkolbas 2-25-2. 2-50-2,2-100-2. 2-500-2 saskaņā ar GOST 1770.

6.20 Smaildibena kolbas 0-10-14/23 un 0-50-14/23 saskaņā ar GOST 25336.

6.21. Plakandibena kolbas P-1-50-29/32, P-1-10O-29/32. P-1-20O-29/32. P-1-250-29/32 vai Kn-1-50-29/32. Kn-1-100-29/32. Kn-1 -250-29/32 saskaņā ar GOST 25336.

6.22 Kolbas ar caurulīti 2-100-19/26.2-250-29/32 saskaņā ar GOST 25336.

6.23. VD tipa dalāmās piltuves, 1. vai 3. versija, ar ietilpību 50 cm 3 saskaņā ar GOST 25336.

6.24 B tipa laboratorijas piltuves saskaņā ar GOST 25336.

6.25. Papīra filtri "birokrātija" saskaņā ar normatīvajiem dokumentiem, kas ir spēkā standartu pieņēmušās valsts teritorijā.

6.26. Stikla trauki ar ietilpību 25.50.250, 1000 cm 3 ar slīpēta stikla, fluoroplastmasas vai polietilēna aizbāžņiem atbilstoši normatīvajiem dokumentiem, kas ir spēkā normas pieņēmējas valsts teritorijā.

6.27. Smilšu pulkstenis vai taimeris saskaņā ar normatīvu pieņēmušās valsts teritorijā spēkā esošajiem noteikumiem.

Atļauts izmantot citus mērinstrumentus ar metroloģiskajiem raksturlielumiem, kas nav sliktāki par iepriekšminētajiem, un palīgiekārtas, reaģentus un materiālus, kuru tehniskie parametri nav sliktāki par iepriekšminētajiem.

7 Sagatavošanās pārbaudei

7.1 Stikla trauku sagatavošana

Kuģus kustīgās fāzes sagatavošanai un uzglabāšanai apstrādā tikai ar sērskābi saskaņā ar 6.15. punktu, neizmantojot citus mazgāšanas līdzekļus, rūpīgi mazgā ar krāna ūdeni un izskalo ar destilētu ūdeni.

Pārējos stikla traukus apstrādā ar karstu ūdeni un mazgāšanas līdzekli, rūpīgi noskalo ar destilētu ūdeni un žāvē cepeškrāsnī 105°C temperatūrā.

7.2. Palīgšķīdumu sagatavošana

7.2.1 Mobilās fāzes sagatavošana

8 iepriekš sagatavotā stikla traukā ar ietilpību 1000 cm 3 ar cieši noslēgtu slīpēta stikla, fluoroplastmasas vai polietilēna aizbāzni ievieto 5 cm 3 ledus etiķskābes (sk. 6.12.), 215 cm 3 acetonitrila (sk. 6.13.) un 280 cm 3 destilēta ūdens. Maisījumu rūpīgi sajauc. Uzglabājot mobilo fāzi, gumijas vai korķa aizbāžņu izmantošana ir nepieņemama.

Maisījuma glabāšanas laiks istabas temperatūrā - ne vairāk kā 1 mēnesis.

Pirms lietošanas kustīgā fāze tiek gāzēta un filtrēta saskaņā ar hromatogrāfa ražotāja ieteikumiem.

"Krievijas Federācijā - apstiprināta tipa standarta paraugs.

7.2.2. Metilēnhlorīda un etiķskābes maisījuma sagatavošana tilpuma attiecībā 200:1

Ievieto 200 ml metilēnhlorīda (6.14.) un 1,0 ml ledus etiķskābes (6.12.) 250 ml plakandibena kolbā.

Maisījuma glabāšanas laiks istabas temperatūrā stikla traukā ar slīpēta stikla, fluoroplastmasas vai polietilēna aizbāzni nav ilgāks par 1 mēnesi.

7.2.3. Nātrija hlorīda šķīduma pagatavošana ar masas daļu 20%.

Ievieto 20 g nātrija hlorīda (sk. 6.16.) plakandibena kolbā ar ietilpību 200 cm 3, pievieno 80 cm 3 destilēta ūdens, rūpīgi samaisa.

Šķīduma glabāšanas laiks istabas temperatūrā - ne vairāk kā 3 mēneši.

7.3. Ohratoksīna A šķīdumu sagatavošana

7.3.1. Ohratoksīna A izejas šķīduma pagatavošana c nominālvērtība masas koncentrācija 1 μg / cm 3

Ar pipeti iepilina 1 cm 3 ohratoksīna A šķīduma acetonitrilā sastāva standarta parauga ar masas koncentrāciju 50 µg/cm 3 (sk. 6.10.). ievieto 50 ml mērkolbā un atšķaida līdz zīmei ar acetonitrilu (6.13.).

Sagatavotā šķīduma glabāšanas laiks ledusskapī temperatūrā no 2 ° C līdz 6 * C - ne vairāk kā 6 mēneši.

Ohratoksīna A masas koncentrācijas faktisko vērtību sākotnējā šķīdumā (Cm, μg / cm 3) aprēķina pēc formulas

kur Cco ir ohratoksīna A masas koncentrācijas apliecinātā vērtība standarta paraugā saskaņā ar pasi, µg/cm 3 ;

Vco - sākotnējā šķīduma pagatavošanai izvēlētā ohratoksīna A. šķīduma sastāva standartparauga tilpums, cm 3 (1 cm 3);

V^, - sākotnējā šķīduma pagatavošanai izmantotās mērkolbas tilpums, cm 3 (50 cm 3).

Piezīme. Izmantojot ohratoksīna A šķīduma citos šķīdinātājos sastāva standarta paraugu, alikvotu daļu (1 cm 3) iztvaicē līdz sausam atlikumam vakuumā ūdens vannas temperatūrā no 40 °C līdz 45 °C vai slāpekļa strūklu Sauso atlikumu izšķīdina 2 cm 1 acetonitrila un maisa 1 minūti Pēc tam iegūto šķīdumu kvantitatīvi pārnes mērkolbā ar ietilpību 50 cm 3 un atšķaida līdz atzīmei ar acetonitrilu.

7.3.2. Ohratoksīna A kustīgās fāzes šķīduma sagatavošana ar nominālo masas koncentrāciju 50 ng/cm

Mērkolbā ar ietilpību 50 cm 3 ievieto 2,5 cm 3 ohratoksīna A sākotnējā šķīduma saskaņā ar 7.3.1. punktu un pārnes tilpumu līdz atzīmei ar kustīgo fāzi saskaņā ar 7.2.1.

Iegūtā šķīduma glabāšanas laiks ledusskapī temperatūrā no 2 līdz 6 un C - ne vairāk kā 3 mēneši.

Ohratoksīna A masas koncentrācijas faktisko vērtību šķīdumā (Co, ng / cm 3) aprēķina pēc formulas

С = r ~, ; v ~ -10QQ. (2)

kur Cm ir ohratoksīna A masas koncentrācijas faktiskā vērtība sākotnējā šķīdumā (sk. 7.3.1.), µg/cm 3 ;

Sākotnējā šķīduma tilpums saskaņā ar 7.3.1. izvēlēts šī šķīduma pagatavošanai. cm 3 (2,5 cm 3);

Vo ir sākotnējā šķīduma pagatavošanai izmantotās mērkolbas tilpums, cm 3 (50 cm 3);

1000 - masas vienību izmēru koordinācijas koeficients.

7.3.3. Ohratoksīna A kalibrēšanas šķīdumu sagatavošana

Sākotnējo ohratoksīna A šķīdumu acetonitrilā saskaņā ar 7.3.1. punktu ievieto mērkolbā ar ietilpību 50 cm 3 . Ohratoksīna A šķīduma tilpumam jāatbilst 1. tabulas prasībām.

1. tabula

Kolbas saturu atšķaida līdz atzīmei ar kustīgo fāzi saskaņā ar 7.2.1. punktu saskaņā ar 1. tabulu.

Kalibrēšanas šķīdumu glabāšanas laiks ledusskapī temperatūrā no 2 °C līdz 6 °C nav ilgāks par septiņām dienām.

PIEZĪME Ja nepieciešams, piemēram, lai paraugam pievienotu ohragoksīnu A (sk. 8.2.). līdzīgā veidā atļauts pagatavot arī citas koncentrācijas ohratoksīna A šķīdumus.

Ohratoksīna A masas koncentrācijas faktisko vērtību kalibrēšanas šķīdumos aprēķina pēc formulas (2). pamatojoties uz sākotnējā šķīduma tilpumu vērtībām saskaņā ar 1. tabulu.

Pirms lietošanas šķīdumus uzglabā, līdz tiek sasniegta istabas temperatūra.

7.4. Hromatogrāfa sagatavošana

Hromatogrāfa sagatavošana mērījumiem tiek veikta saskaņā ar lietošanas rokasgrāmatu (instrukciju).

Iestatiet darbības viļņu garumus ierosināšanai un fluorescences noteikšanai (sk. 6.1.). Kustīgās fāzes tilpuma plūsmas ātrumu un parauga dozēšanas tilpumu iestata atkarībā no kolonnas izmēriem, vadoties pēc hromatogrāfa un kolonnas ražotāja norādījumiem. Piemēram, hromatogrāfijas kolonnai, kas norādīta 6.3. ieteicama telpas ātruma vērtība 200 mm 3 / min un dozēšanas vārsta cilpas tilpums no 10 līdz 20 mm Ja ir kolonnas termostats, temperatūra tiek iestatīta uz (25 ± 1) ° С.

7.5. Hromatogrāfa kalibrēšana

Kalibrēšanas raksturlīknes linearitātes diapazons ir no 5 līdz 100 ng/cm*. Kā paraugus hromatogrāfa kalibrēšanai izmanto ohratoksīna A kalibrēšanas šķīdumus Nr. 7.3.3.

Reģistrē divas katra kalibrēšanas šķīduma hromatogrammas un, izmantojot hromatogrāfa programmatūru, hromatogrāfu kalibrē, iestatot kalibrēšanas raksturlieluma parametrus un ohratoksīna A aiztures laiku.

Aprēķiniet korelācijas koeficientu un ohratoksīna A masas koncentrācijas aprēķināto vērtību novirzi katrā kalibrēšanas punktā no faktiskās vērtības saskaņā ar kalibrēšanas šķīdumu sagatavošanas procedūru (skatīt 7.3.3.).

Izlaidums tiek uzskatīts par pieņemamu, ja:

Korelācijas koeficients ne mazāks par 0,998:

Ohratoksīna A masas koncentrācijas aprēķinātās vērtības relatīvā novirze no faktiskās vērtības nav lielāka par ± 10%.

7.6. Kalibrēšanas raksturlieluma stabilitātes pārbaude

Kalibrēšanas raksturlielumu stabilitātes kontrole tiek veikta katru dienu pirms darba uzsākšanas.

8 kā kontroles šķīdumu izmanto ohratoksīna A šķīdumu kustīgajā fāzē, kas sagatavots tāpat kā 7.3.3. Ohratoksīna A masas koncentrāciju kontroles šķīdumā izvēlas, pamatojoties uz paredzamo ohratoksīna A saturu testa paraugos: ieteicams izmantot ohratoksīna A šķīdumu ar masas koncentrāciju 20 ng/cm.

Reģistrē vismaz divas kontroles šķīduma hromatogrammas un identificē ohratoksīna A maksimumu pēc aiztures laika 5 % identifikācijas loga platumā. ja nepieciešams, ieviešot pīķa aiztures laika programmatūras korekciju un izmantojot kalibrēšanas raksturlielumu, ohratoksīna A masas koncentrāciju aprēķina katrai ievadei.

Ohratoksīna A aiztures laiku un masas koncentrāciju atkārtojamību pārbauda, ​​izmantojot formulas

l^Z^lisO.05, (3)

kur h un Tr ir ohratoksīna A maksimuma aiztures laiki attiecīgi pirmajā un otrajā hromatogrammā, min:

f ir vidējais aritmētiskais / un t 2 , min.

i, _ "" * 0L7"

Ar.

kur Cl un Cl2 - ohratoksīna A masas koncentrācijas kontroles šķīdumā atbilstoši pirmajai un otrajai hromatogrammai, attiecīgi, ng/cm 3 ;

C līdz - Cxi un C " vērtību vidējais aritmētiskais. ng/cm3.

Kalibrēšanas atkarība tiek atzīta par stabilu, ja ir izpildīts nosacījums, kur C ir ohratoksīna A masas koncentrācijas faktiskā vērtība kontroles šķīdumā, ng / cm 3 -

Ja nosacījums (5) nav izpildīts, kontroles procedūru atkārto. Atkārtotās kontroles rezultātus uzskata par galīgiem, un vēlreiz veic hromatogrāfa kalibrēšanu saskaņā ar 7.5.

7.7 Tukša vadīkla

Pirms testa paraugu testēšanas veic tukšo testu.

15 cm * metilēnhlorīda un etiķskābes maisījumu ievieto kolbā iztvaicēšanai.

7.2.2. un vakuumā iztvaicē līdz sausumam, ievietojot kolbu ūdens vannā 40 līdz 45 °C temperatūrā.

Sauso atlikumu izšķīdina 0,5 ml* kustīgās fāzes saskaņā ar 7.2.1. nostādina vismaz 5 minūtes un veic iegūtā koncentrāta hromatogrāfisko analīzi saskaņā ar 8.3. Ja hromatogrammā ir pīķi, kas aiztures laikā ir tuvu ohratoksīna A maksimumam, tad tiek atrasti un novērsti tukšā parauga piesārņojuma cēloņi.

PIEZĪME Visbiežākais vājo tukšā parauga kontroles rezultātu cēlonis ir nepietiekama metilēnhlorīda tīrība, kas var būt piesārņots ar piemaisījumiem, kuru aiztures laiks ir tuvs ohratoksīna A aiztures laikam. Šāds metilēnhlorīds ir jāaizstāj vai rūpīgi jādestilē, savācot vidējo frakciju ar viršanas temperatūru no 39 ° C līdz 40 ° C.

8 Testēšana

8.1. Ohratoksīna A ekstrakcija no parauga

5 cm 3 parauga pipeti ievada dalāmpiltuvē, pievieno 5 cm 3 nātrija hlorīda šķīduma saskaņā ar 7.2.3. punktu, pievieno 5 cm 3 metilēnhlorīda un etiķskābes maisījuma saskaņā ar 7.2.2. punktu un krata 1 minūti. Pēc fāzu atdalīšanas apakšējo organisko slāni filtrē caur birokrātisku filtru, kas iepriekš samitrināts ar paskābinātu metilēnhlorīdu, iztvaicēšanas kolbā.

Piezīme - Kad veidojas stabila emulsija, maisījumu ieteicams centrifugēt 2 minūtes ar ātrumu 5000 apgr./min.

Atkārtoti atkārto ohratoksīna A ekstrakciju no augšējā slāņa ar 5 cm 3 etiķskābes un metilēnhlorīda maisījuma saskaņā ar 7.2.2. Iegūto ekstraktu filtrē tajā pašā iztvaicēšanas kolbā.

Filtru mazgā ar paskābinātu metilēnhlorīdu ar tilpumu no 5 līdz 10 cm 3 . Ekstraktu vakuumā iztvaicē līdz sausumam, ievietojot kolbu ūdens vannā 40°C līdz 45°C temperatūrā. Sauso atlikumu izšķīdina 0,5 cm* kustīgās fāzes, tādējādi iegūstot parauga koncentrātu.

Piezīme -Uz skatuves apgūstot metodi, mainot ekstrakta partiju, kā arī, ja rodas šaubas par iegūto rezultātu ticamību, atrast ohratoksīna A transmisijas koeficientu kontrolparaugā saskaņā ar A pielikumu un pārbaudīt iegūtā pieņemamību. vērtību.

8.2. Paraugu pārbaude

Vīna parauga koncentrāts, kas iegūts saskaņā ar 8.1. turiet vismaz 5 minūtes. un pēc tam veic tā hromatogrāfisko analīzi saskaņā ar 8.3.

Ja hromatogrammā nav pīķa, kas identificēts kā ohratoksīna A maksimums, tiek secināts, ka paraugā ohratoksīna A nav mērījumu diapazona apakšējās robežas līmenī (0,001 mg / dm 3) un paraugs ar ohratoksīna A pievienošana nav sagatavota.

Ja parauga hromatogrammā ir redzams maksimums. identificējami programmatūra hromatogrāfam kā ohratoksīna A pīķi (sk. 8.3.). tas ir, tiek ievadīts analizētais paraugs

piedeva ohratoksīna A šķīduma veidā kustīgajā fāzē (sk. 7.3.2.). Ieteicamo ohratoksīna A šķīduma pievienošanas tilpumu (V 4P . cm 3) aprēķina pēc formulas

(6) kur o ir koeficients, kura vērtību izvēlas diapazonā no 0,5 līdz 2,0:

C* ir ohratoksīna A masas koncentrācija parauga koncentrātā (sk. 8.3.). ng / cm 3;

Us ir parauga koncentrāta tilpums, cm 3 (0,5 cm 3);

Komplekts - ohratoksīna A masas koncentrācija šķīdumā, ko izmanto piedevas pievienošanai. ng/cm3.

Pievienotās piedevas tilpums nedrīkst pārsniegt 5% no parauga tilpuma (U pr. cm 3). Ja šī prasība neatbilst vērtībām, kas aprēķinātas pēc formulas (6). tad ohratoksīna A piedevas pievienošanai izmanto šķīdumu ar atšķirīgu masas koncentrācijas vērtību.

Analizējiet paraugu ar radzēm saskaņā ar 8.1.

8.3. Hromatogrāfisko mērījumu veikšana

Reģistrē vismaz divas testa parauga koncentrāta (skatīt 8.1. punktu) un parauga ar piedevu (skatīt 8.2. punktu) hromatogrammas tādos pašos apstākļos, kādos tika kalibrēts hromatogrāfs. Ohratoksīna A identifikāciju veic, saskaņojot ohratoksīna A aiztures laiku parauga ekstraktā ar tā aiztures laiku, kas iegūts, pārraugot kalibrēšanas raksturlieluma stabilitāti, nosakot identifikācijas loga platumu uz 5%.

Hromatogrammas piemērs ir parādīts B.1. attēlā (B papildinājums).

Piezīme – ja nepieciešams apstiprināt ohratoksīna A pīķa pareizu identifikāciju, parauga koncentrātam ieteicams pievienot ohratoksīna A šķīdumu kustīgajā fāzē. Par identifikācijas ticamību var spriest pēc ohratoksīna A paredzamā pīķa augstuma pieauguma. Pievienotā ohratoksīna A šķīduma daudzumu nosaka, pamatojoties uz faktu, ka ohratoksīna A masas koncentrācijai paraugā jāpalielinās par (50 - 150)%, salīdzinot ar sākotnējo vērtību.

Ja parauga koncentrāta hromatogrammā ir pīķis, kas identificēts kā ohratoksīna A maksimums. aprēķina ohratoksīna A masas koncentrāciju parauga koncentrātā katrai reģistrētajai hromatogrammai, izmantojot 7.5. punktā noteikto kalibrēšanas raksturlielumu. un pārbaudiet iegūto vērtību pieņemamību, izmantojot nosacījumu (4). Ja ir izpildīts (4) nosacījums, tad ohratoksīna A masas koncentrācijas mērīšanas rezultātā testa parauga koncentrātā ņem iegūto koncentrāciju vidējo aritmētisko (Cx. ng / cm 3). Ja nosacījums (4) nav izpildīts, tad tiek atrasti un novērsti nestabilitātes cēloņi, pēc tam atkārtojot parauga koncentrāta ievadīšanu.

Analizējot parauga koncentrātu, pievienojot ohratoksīnu A (sk. 8.2. punktu), pierakstiet arī divas hromatogrammas, identificējiet ohratoksīna A maksimumu un katrai hromatogrammai aprēķina ohratoksīna masas koncentrāciju koncentrātā, pārbaudiet iegūto vērtību pieņemamību. un aprēķina ohratoksīna A masas koncentrāciju parauga koncentrātā ar piedevu ( C X 4 D. ng / dm 3) kā vidējo aritmētisko no iegūtajām vērtībām.

Ja ohratoksīna A masas koncentrācija parauga koncentrātā pārsniedz 100 ng/cm3, tad vīna paraugu atšķaida ar ūdeni saskaņā ar 6.11.apakšpunktu un atšķaidīto paraugu atkārtoti analizē saskaņā ar 8.1. Atšķaidījuma koeficientu O aprēķina pēc formulas

kur U p ir atšķaidītā parauga tilpums, cm 3;

Y 4 - atšķaidīšanai ņemtā testa parauga alikvotās daļas tilpums, cm 3 .

9 Pārbaudes rezultātu apstrāde

Ohratoksīna A masas koncentrāciju vīna paraugā (X, mg / dm) aprēķina pēc formulas

V---ts--:--o-yu'

kur Cst ir ohratoksīna A šķīduma masas koncentrācija, ko izmanto kā piedevu (sk. 8.2.). ng/cm3:

Paraugam pievienotā ohratoksīna A šķīduma tilpums (sk. 8.2.), cm 3:

Vpp ir parauga tilpums, kas ņemts testēšanai saskaņā ar 8.1. cm 3 (5 cm 3);

Cx ir ohratoksīna A masas koncentrācija parauga koncentrātā (sk. 8.3.), ng/cm3:

No x. c = ohratoksīna A masas koncentrācija parauga koncentrātā ar smailēm (skatīt 8.3. punktu). ng/cm3:

O ir vīna parauga atšķaidīšanas koeficients (sk. 8.3.). Ja paraugs nebija atšķaidīts, tad O g 1;

10" 3 - masas un tilpuma vienību izmēru koordinācijas koeficients.

10 Metroloģiskie raksturlielumi

Metode nodrošina mērījumu rezultātus ar metroloģiskajiem raksturlielumiem, kas nepārsniedz 2. tabulā norādītās vērtības.

2. tabula

Mērīšanas diapazons. mg/dm 1	Atkārtojamības robeža (pieļaujamās neatbilstības relatīvā vērtība starp diviem mērījumu rezultātiem, kas iegūti atkārtojamības apstākļos pie P * 0,95) g 0, „. %	Kritiskā atšķirība (pieļaujamās neatbilstības relatīvā vērtība starp diviem mērījumu rezultātiem, kas iegūti reproducējamības apstākļos pie P = 0,951 C0% V. kg / dm 1	Precizitātes rādītājs (relatīvās kļūdas robežas* ticamības līmenī Р = 0,95).
No 0,001 līdz 0,005 ieskaitot
Se. 0,005 » 0,1 »
* Noteiktās relatīvo kļūdu robežu skaitliskās vērtības atbilst relatīvās paplašinātās nenoteiktības skaitliskajām vērtībām ar pārklājuma koeficientu k = 2.

Neatbilstība starp diviem mērījumu rezultātiem (X| un X 2 , mg/dm - *). kas iegūti tajā pašā laboratorijā atkārtojamības apstākļos, jāatbilst nosacījumam

kur X ir X vidējais aritmētiskais un X 2 . mg/dm:

L> lpp. - atkārtojamības robeža (2. tabula), %.

Ja nosacījums (9) ir izpildīts, par mērījumu rezultātu tiek ņemts iegūto mērījumu rezultātu vidējais aritmētiskais (X, un X 2 . mg / dm 3).

Neatbilstībai starp diviem mērījumu rezultātiem, kas iegūti divās laboratorijās (X 1gaC un Hahn, mg / dm 3) vienādos paraugos, jāatbilst stāvoklim

kur Хпов ir Х 1лв0 un Х^ vidējais aritmētiskais. mg/DM 3: CO 095 – kritiskā atšķirība (2. tabula). %.

11 Mērījumu rezultātu kvalitātes kontrole

Mērījumu rezultātu kvalitātes rādītāju kontrole laboratorijā paredz mērījumu rezultātu stabilitātes uzraudzību, ņemot vērā GOST ISO 5725 * 6 prasības (6. sadaļa).

12 Pārbaudes rezultātu prezentācija

Pārbaudes rezultāti tiek ierakstīti testa protokolā, kas sastādīts saskaņā ar GOST ISO / IEC 17025 prasībām, savukārt testa ziņojumā jābūt atsaucei uz šo standartu.

Ohratoksīna A satura mērījumu rezultāti (ar laboratoriski apstiprinātu analītiskās procedūras atbilstību šī standarta prasībām) ir norādīti veidlapā.

X±L vai X±U. (11)

kur X ir mērījuma rezultāts, kas iegūts saskaņā ar 10. iedaļu. mg/dm 3:

A - ohratoksīna A satura mērījumu absolūtās kļūdas robežas (P - 0,95), mg / dm 3, ko aprēķina pēc formulas

A = 0,0!bG: (12)

U ir paplašinātā nenoteiktība pie pārklājuma koeficienta k-2. mg / dm 3, ko aprēķina pēc formulas 8

U = 0,CM (/ platums x. (13)

S (U„J) vērtības ir norādītas 2. tabulā.

Absolūtās kļūdas (nenoteiktības) robežu skaitliskās vērtības tiek izteiktas kā skaitlis, kurā ir ne vairāk kā divi zīmīgi cipari, savukārt gala mērījuma rezultāta skaitliskās vērtības mazākais cipars tiek pieņemts par vienādu. kā arī absolūtās kļūdas (nenoteiktības) robežu skaitliskās vērtības mazākais cipars.

Ohratoksīna A transmisijas koeficienta noteikšana

Ohratoksīna A caurlaidības koeficienta noteikšanai izmanto kontroles paraugu, kura pagatavošanai dalāmpiltuvē ievieto 5 ml destilēta ūdens, 5 ml nātrija hlorīda šķīduma atbilstoši 7.2.apakšpunktam kustīgā fāze (sk. 7.3.2.) .

Veic ohratoksīna A ekstrakciju saskaņā ar 6.1. sagatavo kontroles parauga koncentrātu saskaņā ar 8.2. punktu un veic tā hromatogrāfisko analīzi saskaņā ar 8.3. un. izmantojot kalibrēšanas raksturlielumu saskaņā ar 7.5. sadala ohratoksīna A masas koncentrāciju kontroles parauga koncentrātā.

Tad ohratoksīna A (p) transmisijas koeficientu aprēķina pēc formulas

kur V\ ir kontroles parauga koncentrāta tilpums, cm 9 (0,5 cm *):

Cx ir ohratoksīna A masas koncentrācijas izmērītā vērtība kontroles parauga koncentrātā, ng/cm*:

C. - ohratoksīna A masas koncentrācijas vērtība šķīdumā saskaņā ar 7.3.2. ng/cm*:

V. - ohratoksīna A šķīduma tilpums saskaņā ar 7.3.2. atlasīts kontroles parauga sagatavošanai, cm* (0,5

Ohratoksīna A transmisijas koeficientu atkārtojamības apstākļos nosaka vismaz trīs reizes. Iegūtajām vērtībām jāatbilst šādām prasībām:

Katra no iegūtajām vērtībām nav mazāka par 0,8:

Iegūto vērtību diapazona relatīvā vērtība atbilst nosacījumam

I P||F Pchii I

kur iv "t un tv". - lielākā un mazākā no iegūtajām ohratoksīna A transmisijas koeficienta vērtībām;

Ja abi šie nosacījumi ir izpildīti, tad darbības saskaņā ar 8.1. punktu tiek uzskatītas par apmierinošām. Pretējā gadījumā tiek atrasti ohratoksīna A zuduma iemesli un tiek atkārtots transmisijas koeficienta noteikšana.

B pielikums (informatīvs)

Hromatogrammas piemērs

pussalds

B.1. attēlā parādīts sarkanvīna parauga koncentrāta hromatogrammas piemērs (ohratoksīna A masas koncentrācija paraugā ir 0,0010 mg/dm 1).

koncentrācija

Attēls B.1 — Hromatogrammas piemērs

Ohratoksīna A maksimums (attēlā atzīmēts kā OTA) atbilst ohratoksīna A masas vērtībai koncentrātā 7,7 ng/cm*.

UDK 543.544.5.068.7:663.2:006.354 MKS 67.160.10

Atslēgas vārdi: vīns, vīna materiāli. testa metodes, augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija, ohratoksīns A. ohratoksīna ekstrakcija A. ohratoksīna masas koncentrācijas noteikšana A. ekstrakta koncentrācija, paraugu skrīnings, fluorimetriskā noteikšana

Redaktors K.V. Dudko korektors P.M. Smirnovs Datorvēsture E.K. Kuzina

Parakstīts publicēšanai 2016. gada 8. februārī. Formāts 60x84V*.

Uel. krāsns l. 1.86. Tirāža 45 eks. Aiz*. 3872.

Sagatavots, pamatojoties uz standarta izstrādātāja nodrošināto elektronisko versiju

Buklets

Komplekti un ir pārbaudes sistēmas enzīmu imūnanalīzei. Tie ir komerciāli pieejami saskaņā ar ISO 9000 komplektā ar nepieciešamajiem reaģentiem un ir paredzēti ohratoksīna kvantitatīvai noteikšanai labībā, barībā, graudu produktos, alū un asins serumā. Vadlīnijas par testa sistēmu izmantošanu RIDASCREEN® FAST ohratoksīns A Un RIDASCREEN® ohratoksīns A gadam apstiprinājusi Federālās aģentūras Veterinārmedicīnas departaments lauksaimniecība Krievijas Lauksaimniecības ministrija ar numuru MUK 5-1-14/1001. Sistēmas ir iekļautas "Sarakstā normatīvā dokumentācija, apstiprināta izmantošanai valsts veterinārajās laboratorijās dzīvnieku, zivju, bišu slimību diagnostikā, kā arī dzīvnieku un augu izcelsmes izejvielu drošuma kontrolē."Testēšanas sistēmas RIDASCREEN® FAST ohratoksīns A atbilst GOST 34108-2017"Barība, jaukta barība, jauktas barības izejvielas. Mikotoksīnu satura noteikšana ar tiešo cietās fāzes konkurējošu enzīmu imūntestu".

Ohratoksīna A noteikšana graudos, lopbarībā, graudu produktos, alū un asins serumā

Ohratoksīns ir indīga viela, kas veidojas dzīvībai svarīgas darbības rezultātā pelējuma sēnītes laipns Aspergillus Un Penicillium. Paralēli izteiktai nefrotoksicitātei ohratoksīnam piemīt hepatotoksicitāte, teratogēnas, kancerogēnas un imūnsupresīvas īpašības. Ar augu un dzīvnieku izcelsmes produktiem ohratoksīns var iekļūt cilvēka organismā. Tas konstatēts ne tikai graudaugos (13% pozitīvo paraugu) un dzīvnieku barībā, bet arī cūku asinīs (60% pozitīvo paraugu) un nierēs (21% pozitīvo paraugu).

Muitas savienības tehniskie noteikumi TR CU 021/2011 "Par pārtikas nekaitīgumu" regulēt šādu ohratoksīna A satura maksimālo līmeni: pārtikas graudos, graudaugos, miltos - 0,005 mg / kg (5 μg / kg); bērnu pārtikā, pārtikas produktos pirmsskolas vecuma bērniem un skolēniem, pārtikas produktos grūtniecēm un sievietēm zīdīšanas periodā - nav atļauts (<0,0005 мг/кг).

Federālā likuma projekts № 349084-5 "Vīna produktu tehniskie noteikumi" nosaka prasības ohratoksīna A saturam vīnā ne vairāk kā 0,002 mg/l.

Federālā likuma projektā "Par prasībām pārtikas produktu nekaitīgumam un to ražošanas, uzglabāšanas, transportēšanas, realizācijas un iznīcināšanas procesiem" ietverta arī prasība par obligātu ohratoksīna A kontroli pārtikas graudos, kuru saturs nedrīkst pārsniegt 0,005 mg. /Kilograms. Ar aktuālajiem tiesību aktiem var iepazīties mājaslapā compact24.com.

Vēl nesen ohratoksīna kontrolei galvenokārt tika izmantotas hromatogrāfijas metodes (augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija, plānslāņa hromatogrāfija). Daudz ērtāka ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas analīzes metode (ELISA vai ELISA), kurai ir ļoti augsta jutība.

Specifikācija:	RIDASCREEN® FAST ohratoksīns A	RIDASCREEN® ohratoksīns A 30/15
Formāts:	Slokšņu plāksne, 48 iedobes (6 sloksnes pa 8 iedobēm)	Slokšņu plāksne, 96 iedobes (12 sloksnes pa 8 iedobēm)
Standarti:	0/5/10/20/40 µg/l	0/50/100/300/900/1800 ng/l
Parauga sagatavošana:	Paraugu malšana, ekstrakcija, filtrēšana	ekstrakcija, centrifugēšana/filtrēšana (graudi, barība); ekstrakcija, centrifugēšana, filtrēšana, kratīšana, pārmērīga ekstrakcija, centrifugēšana, iztvaicēšana (alus/serums)
Pavadītais laiks:
Atklāšanas robeža:	0,005 mg/kg	0,001250 mg/kg (graudi, barība) 0,000050 mg/kg (alus, asins serums)

Saistītie produkti:

Krievijas Medicīnas zinātņu akadēmijas Valsts uztura pētniecības institūts, Maskava

Ohratoksīns A, plaši izplatīto Penicillium (P. verrucosum) un Aspergillius (A. ochraceus) ģints mikroskopisko sēņu sekundārais metabolīts, ir viens no prioritārajiem mikotoksīniem – pārtikas piesārņotājiem, un tas rada reālus draudus cilvēka veselībai. Ohratoksīnam A ir izteikta nefrotoksiska, kancerogēna, kā arī teratogēna, imūntoksiska, neirotoksiska, genotoksiska un citotoksiska iedarbība. Starptautiskā vēža izpētes aģentūra (IARC) (2.B grupa) ohratoksīnu A ir klasificējusi kā cilvēku kancerogēnu. Lietojot iekšķīgi, LD50 dažādām dzīvnieku sugām atšķiras no 20-30 mg/kg ķermeņa masas (žurkām) līdz 1 mg/kg ķermeņa masas (cūkām). Ohratoksīns A tiek uzskatīts par vienu no Balkānu endēmiskās nefropātijas, smagas nieru slimības, kas reģistrēta dažās Austrumeiropas valstīs (jo īpaši Bulgārijā, Rumānijā, Serbijā, Horvātijā, Bosnijā un Hercegovinā, Slovēnijā un Maķedonijā), etioloģiskajiem faktoriem. Ohratoksīns A visbiežāk atrodams graudu produktos, kafijā un garšvielās. Nesen ir pierādījumi par ievērojamu žāvētu augļu, vīna un augļu sulu piesārņojumu ar ohratoksīnu A. Tādējādi ES valstīs veikto pētījumu rezultātā tika konstatēts, ka aptuveni 70% graudu produktu partiju satur ohratoksīnu A robežās no 0,00001 līdz 0,041 mg/kg, aptuveni 60% no pētītajām vīna partijām bija piesārņotas. ar ohratoksīnu A daudzumā no 0 ,000003 līdz 0,016 mg/l. Īpaši ievērības cienīgi ir dati par biežo ohratoksīna A noteikšanu daudzu Eiropas valstu iedzīvotāju asinīs, kā arī mātes pienā, kas liecina par pastāvīgu šī mikotoksīna uzņemšanu cilvēka organismā. Galvenais devums ohratoksīna A uzņemšanā ar pārtiku ir labībai (44%), vīnam (10%) un kafijai (9%). Apvienotās FAO/PVO pārtikas piedevu ekspertu komitejas (JECFA) ieteicamā pieļaujamā ohratoksīna A nedēļas deva ir 100 ng/kg/m. T. . Ohratoksīna A saturs ES valstīs regulēts 0,005 mg/kg līmenī pārtikas izejvielās un 0,003 mg/kg pārtikā. Nav ticamu datu par pārtikas piesārņojumu ar ohratoksīnu A Krievijas Federācijā.

Iepriekš PSRS Sanitārā un epidemioloģiskā dienesta vajadzībām izstrādātajai ohratoksīna A noteikšanas metodei pārtikas produktos, ekstrakta attīrīšanai izmantojot šķidruma-šķidruma sadali, ir vairāki trūkumi: salīdzinoši zema metodes jutība (noteikšanas robeža). - 0,001-0,002 mg / kg), ievērojams analīzes ilgums, kā arī nepieciešamība izmantot lielu daudzumu hloru saturošu organisko šķīdinātāju.

Līdz šim ir izstrādātas jaunas, efektīvākas metodes ohratoksīna A noteikšanai pārtikas produktos, pamatojoties uz cietās fāzes ekstrakciju (SPE) . SPE raksturo laba ekstrakta attīrīšana, augsta reģenerācija un zems šķīdinātāja patēriņš. SPE normālās fāzes adsorbcijas hromatogrāfija uz silikagela, apgrieztās fāzes sadales hromatogrāfija uz silikagela, kas ķīmiski modificēta ar oktadecilsilānu, imūnafinitātes hromatogrāfija, kā arī kolonnu hromatogrāfija uz citiem sorbentiem (diatomīta zeme (celīts), poliamīds, polimēri, kas iegūti ar nospiedumu palīdzību utt.) tiek izmantoti. ) .

Ohratoksīna A vāji skābās īpašības (pKA = 4,4) (1. att.) nosaka nepieciešamību to ekstrahēt vai nu nedisociētā veidā ar organisko šķīdinātāju maisījumiem ar skābiem ūdens-sāls šķīdumiem, vai arī sāls veidā - ar nedaudz sārmaini ūdens šķīdumi, piemēram, nātrija bikarbonāta šķīdums.

Reversās fāzes HPLC (RP HPLC) ar fluorimetrisko noteikšanu ir visplašāk izmantotā metode ohratoksīna A noteikšanai pārtikā.

Pētījuma mērķis bija izstrādāt jutīgu metodi ohratoksīna A noteikšanai, identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai pārtikas produktos, optimizējot analītiskās pieejas, kuru pamatā ir SPE izmantošana.

eksperimentālā daļa

Iekārtas un reaģenti. Hromatogrāfiskā sistēma sastāvēja no Jasco 880-PU augstspiediena sūkņa, Rheodyne-7125 inžektora ar dozēšanas cilpas tilpumu 20 µL, FL Detector modeļa LC305 fluorimetriskā detektora (Linear Instruments) (ex = 250 nm, lamis = 458 ) un datu vākšanas un apstrādes sistēma "Multichrome" (Ampersend). Hromatogrāfiskā kolonna (250 x 4,6 mm) ar stacionāro fāzi Kromasil C18 (MetaChem Technologies Inc.), ar daļiņu izmēru 5 µm.

Ekstrakcija tika veikta, izmantojot kratītāju s-3.08L (ELMI) kratītāju; paraugus centrifugēja, izmantojot CLS 31M centrifūgu. Cietās fāzes ekstrakcija tika veikta, izmantojot Macherey-Nagel kolektoru, DIAPAK silikagela kasetnes (BioChemMac ST), OCHRAPREP imūnafinitātes kolonnas (IAC) (R-BIOFARM RHONE LTD). Šķīdumu pH tika mērīts ar MP 230 pH metru (Mettler Toledo). Paraugi tika koncentrēti uz Laborota 4000 rotācijas iztvaicētāja (Heidolph). Lai izšķīdinātu standartus un iztvaicētos ekstraktus, tika izmantota ultraskaņas vanna UZV-12L (PKF SAPPHIRE). Lai izvēlētos optimālos ierosmes un emisijas viļņus, tika izmantots Cary Eclipse (Varian) fluorescējošais spektrofotometrs. Kā standarts tika izmantots ohratoksīna A standarta paraugs benzola-etiķskābes maisījumā (99:1) ar koncentrāciju C = 9,2 ng/µl.

Cietās fāzes ekstrakcija:

Attīrīšana ar kolonnas hromatogrāfiju (CC) uz diatomīta. Ohratoksīna A ekstrakcija no 25,0 g sasmalcinātā parauga tika veikta ar 125 ml hloroforma pēc 20 ml 2% etiķskābes pievienošanas. Sajauc uz šeikera 30 minūtes. 50 ml hloroforma ekstrakta, kas izlaists caur papīra filtru, tika uzklāts uz diatomīta zemes kolonnas, kas piesūcināta ar nātrija bikarbonātu. Kolonnu secīgi mazgā ar 70 ml heksāna un 30 ml hloroforma. Ohratoksīns A tika eluēts no kolonnas ar 150 ml benzola un etiķskābes maisījuma (86:12:2). Eluāts tika iztvaicēts līdz sausumam, izšķīdināts 3 ml kustīgās fāzes (acetonitrils - H3PO4 ūdens (pH=2,6) (62:38), izmantojot ultraskaņas vannu.

Attīrīšana ar QC uz silikagela. Ohratoksīna A ekstrakcija no 20,0 g sasmalcinātā parauga tika veikta ar 100 ml toluola pēc 30 ml 2M sālsskābes šķīduma un 50 ml 0,4M magnija hlorīda šķīduma pievienošanas. Maisīja 60 minūtes, centrifugēja pie 3500 apgr./min 5 minūtes. Augšējais toluola slānis tika filtrēts caur papīra filtru, ņemot 50 ml filtrāta. Pēc kondicionēšanas 10 ml toluola, 50 ml filtrāta tika uzklāts uz kasetnes ar silikagelu, divas reizes nomazgāts ar 10 ml n-heksāna un 10 ml toluola-acetona maisījuma (85:15), pēc tam ar 5 ml. no toluola. Ohratoksīns A tika eluēts ar 40 ml toluola-acetona-etiķskābes maisījuma (89:10:1). Eluāts tika iztvaicēts līdz sausumam, izšķīdināts 1 ml kustīgās fāzes (acetonitrils - ūdens H3PO4 (pH=2,6) (62:38), izmantojot ultraskaņas vannu.

Attīrīšana ar imūnafinitāti CH. Ohratoksīna A ekstrakcija no 50,0 g. sasmalcināts paraugs tika veikts ar 200 ml acetonitrila - ūdens maisījuma (60:40). Maisa 30 minūtes. 4 ml ekstrakta, kas izlaists caur papīra filtru, tika sajaukts ar 44 ml fosfāta un uzklāts uz imūnafinitātes kolonnu (IAC), ko pēc tam mazgā ar 20 ml fosfāta buferšķīduma. Atlikušais fosfāta buferšķīdums tika noņemts, izpūšot IAC ar gaisu. Ohratoksīns A tika eluēts ar 3 ml metanola-etiķskābes (98:2). Eluāts tika iztvaicēts līdz sausumam, izšķīdināts 1 ml kustīgās fāzes (acetonitrils - ūdens H3PO4 (pH=2,6) (62:38), izmantojot ultraskaņas vannu.

HPLC apstākļi. Ohratoksīns A tika identificēts un kvantitatīvi noteikts ar RP HPLC izokrātiskā eluēšanas režīmā ar fluorescējošu noteikšanu (exc = 250 nm, lamis = 458 nm). Kā kustīgā fāze tika izmantots acetonitrila un H3PO4 ūdens maisījums (рН=2,6) (62:38). Elucijas ātrums bija 1 ml/min. 20 μl testa šķīduma tika ievadīti HPLC sistēmā.

Rezultāti un to apspriešana.

Ekstraktu attīrot ar QC ar diatomītu, kas piesūcināts ar nātrija bikarbonātu, kā bāzes metode tika izmantota AOAC 975.38 metode, kas ietver TLC izmantošanu ohratoksīna A identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai. metodi, mēs izmantojām RP HPLC ar fluorescences noteikšanu. Pamatmetodes pielietošanas rezultātā ohratoksīna A ekstrakcijas pakāpe no matricas, kas mākslīgi piesārņota ar ohratoksīnu A 0,01 mg/kg līmenī mūsu apstākļos nepārsniedza 40%. Lai palielinātu ekstrakcijas vērtību, mēs veicām vairākas izmaiņas ekstrakcijas un attīrīšanas nosacījumos: ekstrakcijas maisījumam tika pievienota etiķskābe; kolonnas mazgāšanai izmantotā hloroforma tilpumu samazina līdz 30 ml; eluējošā maisījuma sastāvam tika pievienots acetons; eluējošā maisījuma tilpums tika palielināts līdz 150 ml. Metodes optimizācijas rezultātā ohratoksīna A ekstrakcija no kviešiem palielinājās līdz 60% (1. tabula).

Ekstrakcijas pakāpe tika ievērojami palielināta, pielietojot cietās fāzes ekstrakcijas metodi uz kārtridžiem ar nemodificētu silikagelu (shēma, kas tuva ICC metodei Nr. 000). Pamatmetodes pielāgošana (toluola saturs kolonnas mazgāšanai izmantotajā toluola-acetona maisījumā tika palielināts līdz 85%, eluēšanas maisījumam tika pievienots acetons, eluēšanas maisījuma tilpums palielināts līdz 40 ml) ļāva palielināt ekstrakcijas pakāpe līdz 80%.

Izmantojot imūnafinitātes CH, tika novērota ohratoksīna A maksimālā ekstrakcijas pakāpe no pārtikas matricas (līdz 100%), savukārt noteikšanas robeža (0,0005 mg/kg) bija augstāka nekā CH attīrīšanai uz silikagela (0,00005 mg/ Kilograms).

Lai noteiktu, identificētu un kvantitatīvi noteiktu ohratoksīnu A, izmantojot HPLC, tika izvēlēts optimālais mobilās fāzes (MP) sastāvs un precizēti ierosmes un fluorescences emisijas viļņu garumi, kas nodrošināja maksimālu signālu un selektivitāti ohratoksīna A noteikšanā (2. ). Pielāgotie ierosmes (250 nm 333 nm vietā) un fluorescences emisijas viļņu garumi optimizētajai mobilajai fāzei ļāva palielināt signāla-trokšņa attiecību, attiecīgi samazinot metodes noteikšanas robežu. PF sastāva izmaiņas ļāva uzlabot ohratoksīna A pīķu un pārtikas produkta matricas komponentu atdalīšanu, vienlaikus samazinot ohratoksīna A pīķa aiztures laiku (2. att.).

Iespēja izmantot mūsu modificēto metodi, kuras pamatā ir kārtridžu izmantošana ar silikagelu, ohratoksīna A rutīnas analīzē tika apstiprināta, veicot selektīvu pētījumu par galveno pārtikas izejvielu veidu piesārņojuma biežumu un līmeni ar šo mikotoksīnu. Šim nolūkam tika pētīti 2004. gada ražas pārtikas graudi no dažādiem Krievijas Federācijas reģioniem (3. tabula). Deviņi no 46 pārbaudītajiem graudu paraugiem saturēja ohratoksīnu A robežās no 0,00005 līdz 0,005 mg/kg, kas nepārsniedza ES valstīs pieņemtos noteikumus.

Tādējādi, optimizējot esošās analītiskās pieejas, tika ierosināti divi metodes varianti ohratoksīna A noteikšanai, identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai pārtikas produktos: izmantojot QC uz silikagela vai imūnafinitātes QC ekstraktu attīrīšanai un optimizētus HPLC apstākļus. Metodei, kuras pamatā ir QC izmantošana uz silikagēla, ir zema noteikšanas robeža un zemas palīgmateriālu izmaksas. Attīrīšana ar imūnafinitātes QC nodrošina augstu ekstrakta atgūšanu un tīrību, kā arī augstāku noteikšanas robežu (0,0005 mg/kg, nevis 0,00005 mg/kg silikagela kvalitātes kontroles attīrīšanas opcijai). Selektīvas ohratoksīna A satura izpētes rezultātā pārtikas izejvielās iegūtie dati liecina par nepieciešamību veikt turpmākus pārtikas piesārņojuma ar ohratoksīnu A pētījumus, lai novērtētu pārtikas piesārņojuma risku ar šo mikotoksīnu iedzīvotāju veselībai. Krievijas Federācijas.

Valsts uztura pētniecības institūts RAMS

109240, Maskava, Ustyinsky proezd, 2/14

I. V. Aksenovs, K. I. Ellers, V. A. Tuteljans

Analītisko metožu optimizācija ohratoksīna A analīzei pārtikā.

Ohratoksīns A ir mikotoksīns, ko ražo plaši izplatītas Aspergillus un Penicillium sugas. Mikotoksīns ir izplatīts graudaugu, kafijas, vīna, žāvētu augļu un garšvielu piesārņotājs. Ir pierādīts, ka ohratoksīns A ir nefrotoksisks, imūnsupresīvs, embriotoksisks, teratogēns un kancerogēns daudzām zīdītāju sugām. Codex Alimentarius un EK ir noteikuši maksimāli pieļaujamo ohratoksīna A līmeni 5 mg/kg neapstrādātos labības graudos un 3 mg/kg – ēšanai gataviem produktiem, kas iegūti no labības. Ir izstrādātas divas vienkāršas un uzticamas metožu modifikācijas ohratoksīna A analīzei pārtikā, kuru pamatā ir imūnafinitāte vai silikagela kolonnas attīrīšana un HPLC ar fluorescences noteikšanu. Noteikšanas robežas bija attiecīgi 0,5 mg/kg un 0,05 mg/kg. Metodes ir veiksmīgi izmantotas ohratoksīna A analīzei 46 neapstrādātas labības paraugos, kas novākti dažādos Krievijas reģionos. Tika konstatēts, ka deviņi paraugi ir piesārņoti ar ohratoksīnu A līmenī no 0,05 līdz 5 mg/kg.

Analītisko metožu optimizācija ohratoksīna A noteikšanai, identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai pārtikas produktos.

Ohratoksīns A ir mikotoksīns, ko ražo plaši izplatītas Aspergillius un Penicillium ģints sēnes. Tas ir biežs graudaugu produktu, kafijas, vīna, žāvētu augļu un garšvielu piesārņotājs. Ohratoksīna A nefrotoksiskā, imūnsupresīvā, embriotoksiskā, teratogēnā un kancerogēnā iedarbība ir pierādīta daudzām zīdītāju sugām. Codex Alimentarius un ES noteiktais maksimāli pieļaujamais ohratoksīna A līmenis graudos ir 5 µg/kg, lietošanai gatavos graudaugu produktos – 3 µg/kg. Ir ierosinātas divas optimizētas metodes ohratoksīna A noteikšanai, identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai pārtikas produktos: izmantojot QC uz silikagela vai imūnafinitātes QC ekstrakta attīrīšanai un HPLC ar fluorescējošu noteikšanu. Noteikšanas robeža bija attiecīgi 0,05 un 0,5 µg/kg. Ar izstrādātajām metodēm analizēts ohratoksīna A saturs 46 graudu paraugos, kas savākti dažādos Krievijas reģionos. Deviņi paraugi bija piesārņoti ar ohratoksīnu A 0,05 līdz 5 µg/kg.

Paraksti zīmējumiem.

1. attēls. Ohratoksīna A ķīmiskā struktūra.

2. attēls. Kviešu parauga hromatogrammas, kas piesārņotas ar ohratoksīnu A 0,01 mg/kg līmenī, izmantojot dažādas attīrīšanas metodes:

A) CH uz diatomīta B) CH uz silikagela C) imūnafinitāte CH.

1. tabula. Dažādu ekstraktu attīrīšanas metožu salīdzinošie raksturlielumi.

2. tabula. HPLC parametru salīdzinošie raksturlielumi (1 ng ohratoksīna A vienā injekcijā).

	PF sastāvs	Fluorimetriskās noteikšanas viļņu garumi, nm	saglabāšanas laiks Ak, min	Signāla un trokšņa attiecība
acetonitrils - ūdens - etiķskābe (99:99:2)
acetonitrils - ūdens - etiķskābe (102:94:4)
Optimizētā metode
acetonitrils — H3PO4 ūdens šķīdums (pH=2,6) (124:76)

3. tabula. Parauga pētījums par ohratoksīna A piesārņojuma līmeni pārtikas graudos no 2004. gada ražas.

Literatūra

Vadlīnijas ohratoksīna A satura noteikšanai, identificēšanai un noteikšanai pārtikas produktos. - M., 1985. , Kravčenko (Medicīniski un bioloģiskie aspekti) - M., 1985. AOAC, Ochratoxin A noteikšana vīnā un alū 2001.01 // J. AOAC Int. - 2001. - Sēj. 84. - P. 1818. AOAC, ohratoksīns A kukurūzā un miežos 991.44 // J. AOAC Int. - 1996. - Sēj. 79. - P. 1102-1105. AOAC, ohratoksīns A zaļajā kafijā 975.38 // J. AOAC Int. - 1975. - Sēj. 58. - P. 258. Pieteikums ohratoksīna A analīzei labībā, izmantojot nātrija bikarbonāta ekstraktu kopā ar Ochraprep. – Glasgow, 2001. Baggiani C., Giraudi G., Vanni A. // Bioseparation. - 2002. - 10.sēj. – 389. lpp. – Regula (EK) Nr. 000/2002 // Eiropas Kopienu Oficiālais Vēstnesis. - 2002. - L 75. - P. 18-20. IARC monogrāfijas par kancerogēnu risku cilvēkiem. Vol. 56. – Lion, 1993. Jodlbauer J., Maier N. M., Lindner W. // Journal of Chromatography A. - 2002. - Vol. 945. – 45.–63. lpp. Jornet D., Busto O., Guasch J // Journal of Chromatography A. - 2000. - Vol. 882.–P. 29–35. Krogh P. // Endēmiskā nefropātija, Proceedings of the second International Symposium on Endemic Nephropathy, 1972. gada 9.–12. novembris. - Sofija, 1972. - P. 266-277. Kuhn I., Valenta H., Rohr K. // Journal of Chromatography B. - 1995. - Vol. 668. – 333.–337. lpp. Majerus P., Weber R., Wolff J. // Bundesgesundheitsblatt. - 1994. - B. 37, N. 11. - S. 454 - 458. Monaci L., Palmisano F. / / Anal. bioanāls. Chem. - 2004. - Sēj. 378. - 96.-103. lpp. Monaci L., Tantillo G., Palmisano F. // Anal. bioanāls. Chem. - 2004. - Sēj. 378. - P. 1777-1782. Ohratoksīna A kvantitatīvā noteikšana. - Glasgow, 2003. Ekspertu ziņojums, kas piedalījās 3.2.7. uzdevumā “ES dalībvalstu iedzīvotāju ohratoksīna A uzņemšanas ar uzturu novērtējums”. – Roma, 2002. Dažu mikotoksīnu drošuma novērtējums pārtikā. // PVO pārtikas piedevu sērija, Nr.47; FAO Food and Nutrition Paper 74. - Geneva, 2001. Schwartz G. G. // Cancer Causes Control. - 2002. - 13.sēj. - 91.-100. lpp. Skots P. M. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2002. - Sēj. 504. - 117.-134. lpp. Skaug MA, Helland I, Solvoll K, Saugstad O. D. // Food Addit. kontam. - 2001. - Sēj. 18. - P. 321-327. Visconti A., Pascale M., Centonze G. // Journal of Chromatography A. - 1999. - Vol. 864.–89.–101.lpp. Zimmerli B., Dick R. // Journal of Chromatography B. - 1995. - Vol. 666. – 85. – 99. lpp.

tiek uzklāts viens pārklājums, bet vidējā daļā - divi pārklājumi ar minimālu soli starp tiem, kas norāda lentes ienākošo un izejošo zaru robežas. Soli starp pārklājumiem uz lentes tuvojošā atzara nosaka, izmantojot aritmētiskās progresijas atkarību, un uz lejupejošo zaru - pamatojoties uz ģeometrisko progresiju. Šajā gadījumā ir jāiestata pirmais aritmētiskās progresijas loceklis un jāņem vērā, ka pēdējā atstarpe starp lentes pretimnākošā atzara oderēm ir pirmais ģeometriskās progresijas elements, un progresiju starpība un saucējs ir nosaka no kopējās atstarpes starp katra lentes atzara oderēm.

Trumuļa loka bremzē specifisko slodžu izlīdzināšana tiek panākta, vairāku sekciju bremžu klučā uz tā ienākošajām un izejošajām daļām ievietojot radiāli kustīgas uzlikas, kas savstarpēji savienotas ar balansieri, t.i., tiek izmantots parasto atsvaru princips. Šo tehnisko risinājumu aizsargā izgudrojuma autortiesību sertifikāts.

Virsmas temperatūru stabilizācija augstākminēto bremžu ierīču berzes pāros tiek panākta, pateicoties termoelektriskajam efektam, izmantojot termoelektriskā ledusskapja un termoelektriskā ģeneratora režīmos strādājošus termopilus lentes ienākošo un izejošo zaru oderēs, kā kā arī kurpes berzes uzliku ienākošajās un izejošajās daļās galvenajās un papildu servobremzēs atkarībā no siltuma slodzes to berzes mezglos. Tajā pašā laikā tas tiek nodrošināts

siltumenerģijas pārdale starp bremžu berzes vienību virsmām, kas noved pie tās kvazistabilizācijas. Termopāļu darbība augstākminētajos režīmos ir teorētiski pamatota.

Lentes bremžu darbības režīmu racionāla kontrole tiek apsvērta ar nosacījumu, ka berzes uzliku virsmas slāņu siltuma slodzes līmenis nepārsniedz to materiāliem pieļaujamo temperatūru. Bremzēšanas režīmu kontroles īstenošanai var izmantot bremžu berzes pāru kombinēto dzesēšanu (termoelektrisko ar siltuma cauruli).

Šī tehniskā risinājuma pielietošanas rezultātā tika panākts U2-5-5 vinčas lentes-kurpes bremzes efektivitātes pieaugums.

Tādējādi ir norādīti bremžu ierīču berzes agregātu dinamiskās un termiskās slodzes regulēšanas veidi.

LITERATŪRA

1. Deklarācija Pat. 63418А (Ukraina). Metode specifisku slodžu kontrolei uz bremžu loka bremžu joslas ienākošajiem un izejošajiem zariem / A.I. Volčenko, V.V. Djačuks, N.A. Volčenko un citi - B.I. - 2004. - Nr.1. - Ukraiņu valodā. lang.

2. A.s. 1682675 A1 PSRS. Trumuļa bremze / A.I. Volčenko, V.V. Moskaļevs, P.A. Skorokhod un citi - B. I. - 1991. -

3. Pat. 2221944 C1 Krievija. Bremžu mehānisma ar servo darbību dzesēšanas sistēmas un tā ieviešanas metode / A.I. Volčenko, A.A. Petriks, N.A. Volčenko un citi - B.I. - 2004. - Nr.2.

Tehniskās mehānikas katedra

Saņemts 22.11.04

OHRATOKSĪNA A NOTEIKŠANA VĪNOGU VĪNOS

E.N. RIKUNOVA, T.I. GGUČKINA

Ziemeļkaukāza dārzkopības un vīnkopības zonas pētniecības institūts

Starp mikotoksīniem īpašu vietu ieņem okera toksīni. Tos ražo dažas Penicillium, Aspergillus ģints mikroskopisko sēņu sugas, jo īpaši A. ochraceus, P. viridicatum. Šīs pelējuma sēnītes ir visuresošas, galvenokārt siltos un mitros apstākļos, izraisot vīnogu puvi ilgstošu lietus laikā. Ohratoksīniem ir vispārēja toksiska iedarbība, tie ietekmē nieres, aknas, samazina produktivitāti, ir embriotoksiska, mutagēna un kancerogēna iedarbība.

Starptautiskā vēža izpētes aģentūra ohratoksīnu ir klasificējusi kā potenciālu kancerogēnu un klasificējusi to 2.B bīstamības klasē. Ja pārtika ir piesārņota ar ohratoksīniem, cilvēks saslimst ar Balkānu endēmisko nefropātiju.

Patu-lin iepriekš tika atrasts vīna produktos, un nesen parādījās informācija par ohratoksīna A saturu. Tas piesārņo graudus, dārzeņus, augļus un to produktus, barību, iesalu, alu, sulas un vīnu.

Mēs esam izstrādājuši metodi ohratoksīna noteikšanai vīnogu vīnā ar plānslāņa hromatogrāfiju (TLC).

Plānslāņu hromatogrāfija ir šķidruma hromatogrāfijas veids sorbenta slānī, kas ir plakans vienā pusē un uzklāts uz līdzenas cietas pamatnes. TLC galvenās iezīmes ir saistītas ar eluenta (šķīdinātāja) kustību pa sorbenta slāni kapilāro spēku ietekmē, kas vienkāršo un atvieglo hromatogrāfijas procesu. Universālā sorbenta - silikagēla un atvērtā slāņa izmantošana nodrošina vieglu parauga uzlikšanu, iespēju vienlaikus analizēt vairākus paraugus un viegli uzraudzīt eluēšanas procesu.

Plānslāņa hromatogrāfija ietver mikotoksīnu attīrīšanu un koncentrēšanu. Šim nolūkam izmanto divdimensiju vai pakāpju hromatogrāfiju.

fiu. Pirmais eluēšanas posms ir attīrīšana, traucējošo vielu atdalīšana, otrais posms ir mikotoksīnu atdalīšana.

Vīna parauga analīze ar TLC ietver parauga, plāksnes, hromatogrāfijas kameras un eluentu, kā arī koncentrēšanas kasetnes Diapak C16MT sagatavošanas posmus; tad faktiskā hromatogrāfija, eluenta iztvaicēšana no plāksnes, identifikācija, kvantitatīva noteikšana un dokumentācija.

Metodes priekšrocība ir ne tikai tās vienkāršība, pieejamība, iespēja izmantot specifiskus attīstošos līdzekļus, kas apliecina vielas piederību vēlamajam, zemākas prasības ekstraktu attīrīšanai, bet arī iespēja noteikt nelielu ohratoksīna daudzumu - noteikšanas robeža ir 0,1 μg / cm3.

Lai noteiktu mikotoksīna ohratoksīnu A vīnā un vīna materiālos, 10 cm3 parauga tiek izlaisti caur koncentrēšanas kārtridžu Diapak C16MT, paraugu koncentrējot 10 reizes un visbeidzot attīrot ar 1 cm3 acetonitrila. Iegūtais ekstrakts 5 μl apjomā un standarts tiek uzklāts uz TLC plāksnēm un hromatogrāfiskā atdalīšana (eluēšana) tiek veikta sagatavotā hromatogrāfijas kamerā ar atbilstošiem eluentiem. Šķīdinātāju sistēma izopropanola un amonjaka veidā izrādījās visoptimālākā mikotoksīna atdalīšanai. Tas ir diezgan nepastāvīgs un tam ir zems aiztures koeficients.

Rf uz sorbenta. Mikotoksīnu plankumi tika izveidoti, apstarojot ar gara viļņa garuma (365 nm) ultravioleto gaismu. Pakļaujot UV stariem, mikotoksīnu plankumi mirdz zili zaļā krāsā.

Ohratoksīna identifikācija un kvantitatīva noteikšana tika veikta, skenējot densometriju uz Sorbfil densitometra ar specializētu programmu analīzes rezultātu apstrādei un hromatogrammas parametru aprēķināšanai.

Densitometra izmantošana padara TLC metodi kvantitatīvu, izšķirtspējas ziņā salīdzināmu ar HPLC, vienlaikus saglabājot visas TLC priekšrocības.

Ierosinātā metode tika pārbaudīta ar vīna paraugiem, iepriekš ievadot noteiktu ohratoksīna daudzumu. Metode ļauj ātri un precīzi kontrolēt ohratoksīna saturu vīna produktos.

LITERATŪRA

1. Kretova L. Glunev L. I. Mikotoksīni. Produktu piesārņojums un analītiskā kontrole. - M.: Agrprogress, 2000.g.

2. OIM asamblejas darbība. - Parīze, 2000. - S. 57-59.

3. Mūsdienu plānslāņa hromatogrāfijas ceļvedis / Red. O.G. Larionova // Pamatojoties uz plānslāņa hromatogrāfijas skolas-semināra materiāliem. - M., 1994. gads.

Vīna darīšanas tehnoloģiju laboratorija

Saņemts 08.09.04

N.T. SIJUKHOVA

Maikopas Valsts tehnoloģiskā universitāte

Šobrīd nopietna uzmanība tiek pievērsta jautājumiem par lauksaimniecības kultūru piesārņojumu ar dažāda rakstura toksiskām vielām, tostarp pesticīdiem. Starp kultūraugiem, kas visvairāk apstrādāti ar ķīmiskiem aizsardzības līdzekļiem pret kaitēkļiem un slimībām, izceļas vīnogulāji. Tā kā katrā augšanas sezonā tiek veikta atkārtota aizsardzības apstrāde, vīna dārzi jau sen tiek uzskatīti par sava veida videi bīstamu ķīmisko vielu akumulatoru.

Tie ietver fosfororganiskos savienojumus, kuriem ir raksturīgs paaugstināts uzkrāšanās risks kultivētajās platībās un kuri ir vadošie praktiskā pielietojuma ziņā. Šīs zāles uzkrājas augu šūnās. Visbīstamāk un intensīvāk ar tām tiek piesārņotas ogas, kas galu galā ietekmē no vīnogām ražoto produktu kvalitāti un vides drošību. Ņemot vērā fosfororganisko savienojumu un to metabolītu augsto toksicitāti un stabilitāti, vīnogu produktu piesārņojuma noteikšanai ar tiem ir liela zinātniska un praktiska nozīme.

Specializētās saimniecības AF "Fanagoria" (Temryuk rajons) ražošanas vietās tika veikta (1999-2002) sarkano vīnogu šķirņu toksikoloģiskā kontrole. Paraugi tika ņemti ražas novākšanas laikā, un produktu analīze par hlora un fosfora insekticīdu atlieku saturu tika veikta SKZNIISiV akreditētā testēšanas toksikoloģiskā laboratorijā. Vīnogu lauciņu atlases princips paraugu ņemšanai tika balstīts uz to, ka no tiem novāktās vīnogas tika izmantotas rūpnīcas pārstrādei un sauso sarkanvīnu pagatavošanai SKZNIISiV vīnogu pārstrādes laboratorijas mikrovīnu cehā.

Plānojot eksperimentus toksisko vielu noturības izpētei vīnogās, tika ņemta vērā divu faktoru iespējamā ietekme, kas kopā nosaka insekticīdu iespējamās bīstamības izpausmi kultivētajās vīnogās: toksisko atlieku iekļūšana no stādījumu augsnes un no pašas rūpnīcas pašreizējās sezonālās apstrādes rezultātā

Ohratoksīnus ražo noteikta veida sēnītes. Aspergillus Un Penicillium. Galvenie ražotāji ir A.ochraceus Un P. viridicatum. Šīs sēnes ir sastopamas visur. Aspergillus ražo ohratoksīnus paaugstinātā temperatūrā un mitrumā, un Penicillium jau pie 5°C. Ohratoksīni ir ļoti toksiski savienojumi ar izteiktu teratogēnu iedarbību.

Ohratoksīni A, B un C ir strukturāli radniecīgu savienojumu grupa, kas ir izokumarīni, kas saistīti ar L-fenilalanīna peptīdu saite. Atkarībā no radikāļu rakstura veidojas dažāda veida ohratoksīni (2.3. tabula).

Ohratoksīns A ir bezkrāsaina kristāliska viela, nedaudz šķīst ūdenī, vidēji šķīst polāros organiskos šķīdinātājos (metanolā, hloroformā), kā arī nātrija karbonāta ūdens šķīdumā. Ķīmiski tīrā veidā tas ir nestabils un ļoti jutīgs pret gaismu un gaisu, bet etanola šķīdumā tas var palikt nemainīgs ilgu laiku. UV gaismā tam ir zaļa fluorescence.

Ohratoksīns B ir kristāliska viela, ohratoksīna A analogs, kas nesatur hlora atomu. Tas ir aptuveni 50 reizes mazāk toksisks nekā ohratoksīns A. UV gaismā tam ir zila fluorescence.

Ohratoksīns C ir amorfa viela, ohratoksīna A etilesteris, kas pēc toksicitātes ir tuvu tam, taču nav konstatēts kā dabisks pārtikas un barības piesārņotājs. Y-gaismā tam ir gaiši zaļa fluorescence.

Ohratoksīni pieder pie toksiskiem mikotoksīniem, tiem piemīt augsta toksicitāte aknām, nierēm, teratogēnas un imūnsupresīvas īpašības, kā arī izteikta hemolītiskā iedarbība. No ohratoksīniem vistoksiskākais ir ohratoksīns A (LD 50 = 3,4 mg/kg, (dienu veci cāļi, orāli)). Tas ir toksiskāks par aflatoksīniem. Citi šīs grupas mikotoksīni ir par vienu pakāpi mazāk toksiski.

Ohratoksīnu bioķīmiskie, molekulārie un šūnu darbības mehānismi nav labi saprotami. Ir zināms, ka ohratoksīns A inhibē proteīnu sintēzi un ogļhidrātu vielmaiņu, jo īpaši glikogenozi, inhibējot fenilalanīna aktivitāti, tRNS, specifisku enzīmu, kam ir galvenā loma olbaltumvielu sintēzes sākumposmā.

Ohratoksīns A ir atrodams kukurūzā, miežos, kviešos, auzās un miežos. Svarīgi un bīstami, ka ohratoksīns A ir atrodams lopkopības produktos (šķiņķī, bekonā, desās) pie augsta lopbarības graudu un dzīvnieku barības piesārņojuma. Ohratoksīns B ir reti sastopams. Ohratoksīni ietekmē arī visus dārzkopības kultūru augļus. Īpaši skarti ir āboli: līdz 50% ražas var būt piesārņoti ar mikotoksīniem.

Jāņem vērā, ka ohratoksīni ir stabili savienojumi. Tā, piemēram, ilgstoši karsējot ar ohratoksīnu A piesārņotos kviešus, to saturs samazinājās tikai par 32% (250–300ºС temperatūrā). Tādējādi ohratoksīnu izplatība pārtikas produktos, toksicitāte un noturība rada reālus draudus cilvēku veselībai.

Analīzes metodes

Ohratoksīns A ir atrodams oksidētos pārtikas produktos. Tas viegli šķīst daudzos organiskos šķīdinātājos, ko izmanto ekstrakcijai. Visbiežāk izmanto ekstrakciju ar hloroformu un fosforskābes ūdens šķīdumu, kam seko attīrīšana kolonnā un kvantitatīvā noteikšana, izmantojot TLC metodi.

Ir izstrādāta arī HPLC metode. Pirms HPLC analīzes paraugu sagatavo šādi. Sasmalcināto paraugu apstrādā ar 2 M sālsskābes un 0,4 M magnija hlorīda šķīduma maisījumu. Pēc homogenizācijas ekstrahē ar toluolu 60 minūtes. Maisījumu centrifugē. Centrifūgu izlaiž caur silikagela kolonnu un mazgā ar toluola un acetona maisījumu (kustīgā fāze). Ohratoksīnu A eluē ar toluola un etiķskābes maisījumu (9:1) un žāvē 40°C. Atlikumu izšķīdina un filtrē. Analīze tiek veikta, izmantojot HPLC.

Turklāt ir izstrādāti vairāki biotesti ar garnelēm un baktērijām, taču iegūtie rezultāti neļāva izmantot šīs metodes ohratoksīnu noteikšanai.