Lehetővé teszi nagyszámú genetikai jellemző elemzését a forrásanyag egyetlen mintájában. Ebben az esetben kívánatos, hogy a DNS-chipek két olyan tulajdonsággal rendelkezzenek, amelyek bizonyos értelemben ellentmondanak egymásnak. Egyrészt érdekes, hogy egy DNS-chipben minél több sejt legyen, hogy minél több információt kapjunk a vizsgált mintáról. Ugyanakkor a kutatók gyakran kénytelenek nagyon kis mennyiségű biológiai anyaggal dolgozni, így minél kisebb a DNS-chip mérete, annál jobb.

Modern módszerek(például atomerőmikroszkópia, AFM) lehetővé teszik a jel detektálását egy DNS-chip sejtjeiben, ha azok méretei több tíz nanométer. Az ilyen DNS-chipek előállításának módszerei litográfián alapulnak (a legvonzóbb módszer a dip-pen nanolitography, DPN). Az ilyen kis cellákból álló chipek építése általában meglehetősen drága és időigényes.

Amerikai és koreai tudósok egy csoportja javasolt egy módszert az olcsóbb, gyorsabb és tömegtermelés DNS mikro- és nanochipek. A kutatók kimutatták, hogy egy DNS-chip mintavételével egy lépésben ki lehet nyomtatni egy olyan chipet, amely komplementer az eredetihez. A DNS-chipek előállításának ezt a módszerét a szupramolekuláris nanonyomtatás módszerének (supramolekuláris nanobélyegzés, SuNS) nevezik, és vázlatosan az 1. ábrán látható.

Mintaként a tudósok egy szálú, arany nanorészecskékkel összevarrt DNS-t vettek, amelyben a sejtméret 9 ± 2 nm, a sejtek közötti távolság pedig 77 ± 9 nm volt. Ehhez a DNS chiphez az 5' végén hexil-tiollal módosított komplementer DNS-t adtunk. A hibridizáció (vagyis a komplementer DNS-szálak megkötése) után egy arannyal bevont üvegszubsztrátot helyeztünk a minta chipre. Ehhez az új szubsztráthoz komplementer DNS-szálak kapcsolódnak. Ezután 90 °C-on dehibridizálást végeztünk, és ennek eredményeként olyan lenyomatot kaptunk, amely komplementer volt az eredeti mintához.

A keletkezett másolat vizsgálata után a tudósok arra a következtetésre jutottak, hogy a lenyomat elkészítése sikeres volt: az új DNS-chipen 14±2 nm méretű sejteket találtak, amelyeket 77±10 nm-es rések választanak el egymástól (2. ábra). Annak bizonyítására, hogy a cellák elrendezése a tömbben azonos a minta és a nyomtatás esetében, mindkét esetben kiszámítottuk a radiális eloszlásfüggvényt (3. ábra). Látható, hogy a funkciók meglehetősen hasonlóak lettek.

A jövőben meg kell mutatni, hogy a SuNS alkalmas többkomponensű chipek nyomtatására, és egyetlen mintából sok másolat készítésére a pontosság elvesztése nélkül. A kutatók úgy vélik, hogy a közeljövőben ezt bizonyítani is tudják majd.

A folyóiratban megjelent az "Application of supramolecular nanostamping to the replikáció DNS nanoarrays" című munka. Nano Letters.

A közelmúltban olyan DNS-technológiákat fejlesztettek ki, amelyek nemcsak a tulajdonság meghatározását teszik lehetővé, hanem egyidejűleg differenciális szekvenálást is végeznek, pl. pontmutációk vagy polimorfizmusok meghatározása a genom ismert régióiban. Ezek a technológiák jelentős előnyökkel rendelkeznek a hagyományos molekuláris biológiai módszerekkel szemben, hiszen lehetővé teszik a vizsgálati minta és az analizátor miniatürizálását, ami jelentősen csökkenti az analízis költségét és végrehajtásának idejét, valamint a vizsgálati minta különböző paramétereinek egyidejű meghatározását anélkül, hogy elveszítené az amplifikációs módszerek érzékenységét. Az összes lehetséges oligonukleotiddal rendelkező chipek használatán alapuló módszerek fő előnye nukleotid szekvenciák adott hosszúság, sokoldalúságuk. Bármely szekvenciájú oligonukleotid jelenléte a chipen lehetővé teszi bármely vizsgált szekvencia elemzését. A mikrochipek alkalmazása azon az elven alapul, hogy bizonyos ligandumok kölcsönhatásait gyorsan meghatározzák sok különböző szondával egyidejűleg. Valójában a biológiai mikrochipek egy vagy másik szilárd szubsztrát, amelyen nukleinsavak, fehérjék vagy szénhidrátok bizonyos fragmentumai, vagy bármely más, felismerhető vagy biológiai aktivitást mutató próbamolekula lerakódnak. A különböző szondák száma a hordozón elérheti a százezret, az egyes típusok chipjei pedig szigorúan azonosak, és a meglévő technológiákkal több százezer és millió példányban reprodukálhatók a hordozón.

DNS mikrotömbök

Vannak fehérje, DNS, szénhidrát, szövet chipek. speciális figyelem megérdemlik a DNS chipeket. Egyedülálló analitikai eszköz, amely lehetővé teszi az elemzett (általában biológiai eredetű) DNS-szekvenciák jelenlétének meghatározását (ún. hibridizációs elemzés). A DNS-chipekkel végzett elemzés többszörösen olcsóbb, mint az alternatív technológiák (elektroforézis, valós idejű PCR) alkalmazása, és egyszerű kialakítású detektor jelenlétében lehetővé teszi a laboratóriumon kívüli munkát.

Először a múlt század 80-as éveinek végén használtak DNS-chipeket a kutatásban. Ez a ma már széles körben elterjedt módszer, amely lehetővé teszi több gén expressziójának egyidejű elemzését, azon az elven alapul, hogy az mRNS vagy cDNS célpontok felismerhetők a microarray-en rögzített egyszálú DNS-fragmensekkel történő hibridizáció révén.

A DNS-chip egy szilárd szubsztrát, amelyen különböző hosszúságú egyszálú DNS-fragmenseket rögzítenek (általában kovalensen): rövid - 15-25 nukleotid, hosszú - 25-60 nukleotid és cDNS-fragmensek - 100-3000 nukleotid. A felhasznált hordozóanyag üveg, szilícium, különféle polimerek, hidrogélek (például poliakrilamid alapú) és még arany is.

A hibridizáció a technológia alapja

Minden modern DNS-technológia alapja a hibridizáció. A hibridizáció eredményeként a nukleinsavmolekulák stabil kétszálú struktúrákat tudnak kialakítani a molekulák elemei - nukleotidok - közötti kötések miatt. Az adenin nukleotid (A) a timinnel (T), a guanin (G) a citozinnal (C) komplementer. Ennek eredményeként egy egyszálú ATHC nukleotid szekvencia stabil asszociációt, kétszálú szerkezetet alkot a TACG összetételű egyszálú DNS-molekulával.

….. ATHC….

| | | |

….. TACG….

Az ilyen komplementaritás két DNS-molekula "megtapadásához" vezet, amelyek közül az egyik mozdulatlanul rögzíthető a szubsztrátumon, és a DNS-chip eleme lehet. Minél több olyan molekulát tartalmaz a minta, amely komplementer a chip elemeivel, annál több kötődik belőlük a chiphez, és annál nagyobb lesz az ebből az elemből észlelt jel intenzitása. ábrán. Az 1. ábra egy DNS-sejt vagy egy oligonukleotid biochip működési elvét mutatja be, amely egy adeninbázis komplementer kölcsönhatásain alapul ( A) timinnel ( T) és guanin ( G) citozinnal ( VAL VEL) a DNS két szálában. Ha a DNS (vagy oligonukleotid) egyik szálában lévő bázisszekvencia teljesen komplementer a másik szál szekvenciájával, akkor stabil, tökéletes kettős szálú hélix képződik - duplex. Azonban például egy rossz pár jelenléte a duplexben G-G, megakadályozza a duplex képződést. Ha egy specifikus egyszálú DNS-t vagy mondjuk egy 20 tagú oligonukleotidot (próbát) rögzítünk a mikrochip egyik elemében, akkor ha fluoreszcens festékkel jelölt DNS-fragmenseket, például a humán genomot adjuk a mikrochiphez, ezek nagyon specifikus kölcsönhatása lép fel. A biochip egy adott oligonukleotid eleme specifikusan csak egy komplementer szekvenciát köt meg a DNS-ben található összes lehetséges ilyen hosszúságú szekvencia közül 4 20 =1,09x10 12 közül. Ennek eredményeként a fluoreszcens fény csak a biochip ezen kiegészítő elemén figyelhető meg. Így a biochip egyik eleme egy mintát állít elő körülbelül billió lehetséges opcióból, ellentétben az elektronikus chip elemével, ahol bináris minta fordul elő: IGEN vagy NEM.

Rizs. 1. A DNS kettős hélix kialakulásának vázlata biochipen. Az oligonukleotid a biochip egyik elemén van rögzítve, és szelektíven csak a komplementerhez kötődik számos fluoreszcensen jelölt DNS-fragmensből. Ennek eredményeként csak ez az elem kezd világítani. Ez a komplementer bázispárok rendkívül specifikus kölcsönhatásainak köszönhető. A Val vel TÉs G Val vel VAL VEL. Például egy nem komplementer pár jelenléte G-G, megakadályozza az interakciót, és sötéten hagyja a mikrochip elemet.

A hibridizációs paraméterek meghatározására használt eszközök nemcsak a végeredmény, hanem a komplementer láncok asszociációs és disszociációs kinetikájának rögzítését is lehetővé teszik. Ezek a technológiák, miközben lehetővé teszik a minták többparaméteres elemzését, rengeteg információt szolgáltathatnak. A hibridizáció eredménye a DNS-minta hosszától, a jelölt DNS-célpont kémiai összetételétől, a hibridizáció hőmérsékletétől, a hibridizációs keverék összetételétől és a fluoreszcens jelölés típusától függ. Itt meg kell jegyezni, hogy a passzív hibridizációt főként DNS-chipekben alkalmazzák; a cél-DNS és az immobilizált minta kölcsönhatása valószínűségi folyamat, és különböző körülményektől függ.

A DNS chipek használata

A vizsgált organizmus összes génjének állapotának felmérése és azonosítása az egyik kritikus feladatokat a DNS-chipek fejlesztői elé állítva. A probléma megoldása megvalósítható a szervezet összes génjének rögzítésével egy biológiai chipen, amely lehetővé teszi a gének állapotának és a genom egészének átfogó felmérését. A különböző élőlények génjeiről és genomjairól szóló (rendszerezett) összes információt tartalmazó biogenetikai adatbázisok nagy lehetőségeket kínálnak a kutatóknak a DNS chipek tervezésében.

A biochip vizsgálatok elterjedtségének fő okai között szerepel a nagy érzékenység, specificitás és reprodukálhatóság, az eljárás egyszerűsége, számos paraméter egyidejű elemzésének lehetősége, valamint a viszonylag alacsony munkaköltség. Ugyanezek az okok késztetnek bennünket arra, hogy a biochipeket ígéretes eszköznek tekintsük különböző területeken Nemzetgazdaság.

Összegezve, meg kell jegyezni, hogy a microarray-ek hatékony megközelítést jelentenek több tíz-ezer gén egyidejű azonosítására és szerkezeti elemzésére, specifikus nukleotidszekvenciák és szerkezetük nukleotid-variációinak azonosítására. Ha azonban a gének egy vagy több kópia mennyiségben vannak jelen a genomban, ami a klinikai gyakorlatban folyamatosan előfordul, akkor előzetes amplifikációjuk szükséges. A legtöbb hatékony módszer A DNS-amplifikáció egy polimeráz láncreakció, amelynek során a DNS-molekulák száma exponenciálisan többről millióra vagy még több másolatra nő, és ennek a PCR-típusnak a fő előnye, hogy a Real Time lehetővé teszi a vizsgált mátrix mennyiségi értékelését is. Ez fontos az alap- és integráltudományok fejlesztésének problémáinak megoldásához, valamint a diagnosztikai módszerek feltételeinek optimalizálásához.

Tehát két, a tudomány és az alkalmazott technológia egyes területein már hagyományossá vált módszer a hiányosságaikkal együtt teljesen egyedi előnyökkel rendelkezik.

Valós idejű PCR:

lehetővé teszi az eredeti mátrix mennyiségének becslését;

Nem igényel további munkaigényes szakaszokat;

· az elektroforézis szakasz hiánya minimálisra csökkenti a szennyeződés kockázatát, és így csökkenti a hamis pozitív eredmények számát;

· a matematikai elemzési módszerek alkalmazása lehetővé teszi a kapott eredmények automatikus értelmezését és megszünteti az elektroforegramok szubjektív értékelésének problémáját;

kevésbé szigorú követelményeket ír elő a PCR-laboratórium megszervezésére és az eredmények automatikus nyilvántartására és értelmezésére;

időt takarít meg.

Biológiai mikrochipek:

lehetővé teszi a minta és az analizátor miniatürizálását;

időt és költséget takarít meg az elemzéssel;

lehetővé teszi a vizsgálati minta több paraméterének egyidejű meghatározását;

· magas amplifikációs módszerek érzékenységgel, specifitással és reprodukálhatósággal rendelkezik;

Könnyű kezelhetőséget biztosít.

Lehetséges, hogy ezeknek a módszereknek a kombinációja a polimeráz láncreakció mikrochip formátumba konvertálásával lehetővé teszi egy új generációs diagnosztikai rendszer létrehozását, amelyet a következő tulajdonságok jellemeznek: nagyobb érzékenység és elsősorban specifitás a nukleinsavak meghatározására, magas termelékenység alacsony elemzési költség mellett, valamint a manipulációk számának általános csökkenése az elemzés minden szakaszában.



Gén kifejezés- ez az a folyamat, amelynek során egy génből származó örökletes információ (DNS-nukleotid szekvencia) funkcionális termékké - RNS-é vagy fehérjévé - alakul. A génexpresszió szabályozása lehetővé teszi a sejtek számára, hogy szabályozzák saját szerkezetüket és működésüket, és ez az alapja a sejtek differenciálódásának, morfogenezisének és adaptációjának.

DNS chipek Egy egyedülálló analitikai eszköz, amely lehetővé teszi az elemzett (általában biológiai eredetű) DNS-szekvenciák jelenlétének meghatározását (ún. hibridizációs elemzés). A DNS-chipekkel végzett elemzés többszörösen olcsóbb, mint az alternatív technológiák (elektroforézis, valós idejű PCR) alkalmazása, és egyszerű kialakítású detektor jelenlétében lehetővé teszi a laboratóriumon kívüli munkát.

Először DNS chipek az 1980-as évek végén használták a kutatásban. Ez a ma már széles körben elterjedt módszer, amely lehetővé teszi több gén expressziójának egyidejű elemzését, azon az elven alapul, hogy az mRNS vagy cDNS célpontok felismerhetők a microarray-en rögzített egyszálú DNS-fragmensekkel történő hibridizáció révén. A modern DNS microarray a következőkből áll több ezer dezoxioligonukleotid (próbák vagy minták) mikroszkopikus pöttyök formájában csoportosítva és szilárd szubsztrátumon rögzítve. Minden pont több pmol DNS-t tartalmaz meghatározott nukleotidszekvenciával. A DNS-microarray oligonukleotidok lehetnek gének rövid szakaszai vagy a DNS más funkcionális elemei, és cDNS-sel vagy mRNS-sel (cRNS) történő hibridizációra használják. A próba-cél hibridizáció detektálása és mennyiségi meghatározása fluoreszcenciával vagy kemilumineszcenciával történik, amely lehetővé teszi egy adott szekvencia nukleinsavainak relatív mennyiségének meghatározását egy mintában.

A hagyományos DNS-mikromátrixban a próbák kovalensen rögzítve vannak egy szilárd felülethez - egy üveg vagy szilícium chiphez. Más platformok, például az Illumina által gyártottak, mikroszkopikus golyókat használnak a nagy kemény felületek helyett.

A DNS microarray-eket a génexpresszió változásainak elemzésére, egy nukleotid polimorfizmusok azonosítására, genotipizálásra vagy mutáns genomok újraszekvenálására használják. A mikrochipek tervezésében, teljesítményében, pontosságában, hatékonyságában és költségében különböznek egymástól.

DNS mikrotömbök:

CDNA mikrotömbök

oligonukleotid

(kétszínű fluoreszcencia érzékeléssel)

oligonukleotid

(Affymetrix, egyszínű fluoreszcencia érzékeléssel)

membrán c-DNS microarrays

(radioaktív érzékeléssel)

Gel c-DNS chipek

Fehérje mikrotömbök

Egy kis történelem

1980-as évek: fehérje chips

~1991: Támogatott DNS-szintézis kémia (nagy sűrűségű) - Affymetrix oligonukleotid chipek (Fodor, Stryer, Lockhart)

~1995: Micro-Digging Robots – Stanford University cDNS chips (Pat Brown és Dari Shalon)

1990-es évek: IMB gél chipek

Azonban 1982-ben Augenlicht és Kobrin javasolta a DNS-tömböt ( Rák Kutatás), 1984-ben pedig egy 4000 elemet tartalmazó chipet készítettek a rákos sejtek tanulmányozására.

(A cikket elutasították TudományÉs Természet)

Mit lehet vizsgálni DNS-mikrotömbök segítségével?

Génexpresszió különböző szövetekben

Génexpresszió normál és kóros állapotokban (normál és rákos sejtekben)

A génexpresszió időbeli változásai külső hatások következtében (sejtkölcsönhatás kórokozóval, gyógyszerrel)

Kifejezési profilok(minták) különböznek a normál és a rákos sejtek, vagy a különböző típusú rák között. A gyógyítható és gyógyíthatatlan leukémia különböző mintázatokat eredményez. A minták típusa alapján nagy valószínűséggel előre jelezhető a betegség lefolyása a legkorábbi stádiumban.

Expressziós mikrotömbök

A microarray technológia egyik aktívan fejlődő területe a transzkripciós profilok vizsgálata komplex betegségekben. Bár testünkben minden sejt ugyanazon az öröklött genomiális DNS-en osztozik, minden sejt mRNS-ként más-más gént expresszál a sejttípustól, a biológiai folyamatoktól, a normál vagy patológiás állapotoktól stb. A génexpressziós profilok e sokfélesége biológiai és klinikai jelentősége miatt intenzív kutatás tárgyát képezi. A microarray technológia több száz és több ezer gén expressziójának elemzésére való képessége bizonyult a legkeresettebbnek egy olyan összetett betegség megfejtésében, mint a rák. A Microarray technológia több tízezer gén expressziójának egyidejű nyomon követését teszi lehetővé, így a sejt molekuláris portréja jön létre. A génexpressziós profilok vizsgálatának legjelentősebb következményei közé tartozik számos ráktípus diagnózisa, rétegződése és prognózisa. Bár a kórszövettani kiértékelés, amelyet számos molekuláris marker citogenetikai vizsgálata és elemzése egészít ki, még mindig az arany standard a diagnosztikában és a prognózisban, a legújabb munkák azt mutatják, hogy sok esetben helyettesíthető a génexpressziós profilozással. A rák diagnosztizálásához és prognózisához több szakember – például onkológus, patológus és citogenetikus – közös szakértelmére van szükség, és a végső következtetések a szakértők módszertani megközelítésétől és szakértelmétől függően változhatnak. A mikrochipek teljes mértékben helyettesíthetik sok szakember erőfeszítéseit, emellett javíthatják a diagnózis és a prognózis pontosságát, valamint egységes, szabványosított elemzési platformot biztosíthatnak.

A génexpresszió elemzésére kétféle microarray-t használnak: komplementer DNS (cDNS) és oligonukleotid próbák alapján. A cDNS-alapú mikromátrixok olyan DNS-fragmensek, amelyek szabványos mikroszkópos üvegek felületén vagy más szilárd szubsztrátumon vannak rögzítve. A 25-60 nukleotid bázis hosszúságú oligonukleotidokat (n.b.) ugyanazon a szubsztrátumon oligonukleotid microarray-ben rögzítik. A minta-előkészítési eljárást a microarray-ken végzett elemzéshez az 1. ábra mutatja. 2. A sejtekből teljes RNS-t izolálunk (néha mRNS-frakciót is izolálunk), majd a poliA-terminális mRNS-fragmenssel komplementer szekvenciát és a T7 RNS-polimeráz promoter régióját tartalmazó kombinált primer segítségével reverz transzkripciós reakciót hajtunk végre. A T7 RNS polimeráz promoter szekvenciájának beépítése a szintetizálandó cDNS láncba lehetővé teszi az in vitro amplifikációs reakció további lebonyolítását: a T7 RNS polimeráz enzim számos RNS-kópiát állít elő a kémcsőben lévő minden cDNS-molekulából. Így megy végbe az eredeti mRNS lineáris amplifikációja. A kapott RNS-molekulák jelölését általában egyidejűleg hajtják végre, mivel a reakcióban fluoreszcens jelölést tartalmazó nukleotidokat használnak. Az oligonukleotid microarray-ekkel végzett kísérletekben gyakran használnak azonos típusú fluoreszcens jelölést egy komplementer RNS (cRNS) minta jelölésére, és a génexpressziós szinteket úgy határozzák meg, hogy a kapott fluoreszcens jeleket összehasonlítják a microarray belső ellenőrzőpontjaiból származó jelekkel. A cDNS alapú microarray-ekkel végzett munka során általában 2 mintát használunk a kísérletben: a kontrollmintát egy fluoreszcens festékkel, a tesztmintát egy másikkal jelöljük, majd összekeverjük és egy microarray-vel hibridizáljuk. A mikrochip minden sejtjében lévő két különböző fluoreszcens jelölés aránya alapján ítéljük meg egy adott gén expressziós szintjének növekedését vagy csökkenését. A technológiai platformtól függetlenül minden kísérlet olyan adatokat generál, amelyek több tíz és százezer gén expressziós szintjének értékelését tartalmazzák. Ekkora adatmennyiség feldolgozására egy meglehetősen összetett matematikai apparátust, elsősorban klaszteranalízist alkalmaznak. A Microarray adatok elemezhetők a klinikai adatokkal összefüggésben (hipotézis-orientált elemzés, felügyelt elemzés), vagy a páciens klinikai jellemzőitől függetlenül (független elemzés, felügyelet nélküli elemzés).

A klasszikus módszerek lehetővé teszik több gén expressziójának egyidejű elemzését, vagy speciális microarray technológiák alkalmazását teszik szükségessé, mint pl. Affymetrix. Az Affymetrix a fotolitográfia és a kémiai szintézis oligonukleotidok GeneChip® microarray-ek előállításához.

SÁRGA- ha a gén a beteg (Cy5) és normál (Cy3) szövetekben is expresszálódik, akkor a vörös és zöld színnel jelölt DNS ezen a helyen hibridizálódik, és az eredmény sárga lesz

PIROS- ha a gén csak beteg (Cy5) szövetben expresszálódik, akkor ezen a helyen csak a vörös festékkel jelölt DNS hibridizálódik

ZÖLD- ha a gén csak egészséges (Cy3) szövetben expresszálódik, akkor ezen a helyen csak a zöld festékkel jelölt DNS hibridizálódik

FEKETE- ha a gén nem expresszálódik sem beteg, sem egészséges szövetben

És így,

A DNS-mikrotömbök sok ezer gén expressziójával kapcsolatos információk egyidejű elemzését teszik lehetővé.

A jelenleg használt DNS-mikroarray-k fő típusai az Affymetrix cDNS-mikrotömbjei és oligonukleotid chipjei.

A cDNS microarray-ek különböző fluoreszcens festékekkel jelölt, vegyes kísérleti és kontrollminták hibridizációján alapulnak egy chiphez, amelynek felületén ~10 000-20 000 génnek megfelelő kettős szálú c-DNS van lerakva.

Az Affimetrix microarray-ek egy kísérleti minta biotinnal jelölt cRNS-ének hibridizálásán alapulnak egy chip szubsztrátumon szintetizált Perfect Match és Mismatch oligonukleotidok sorozatával, majd sztreptavidin-fikoeritrin festéssel. A GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 47 000 átirat egyidejű elemzését teszi lehetővé, köztük 38 500 jellemzett gént. A mikrochip 1 300 000 különféle típusú oligonukleotidot tartalmaz.

A kapott adatok elemzése többlépcsős matematikai feldolgozást igényel speciális statisztikai módszerekkel.

Gyakorlatilag a mikrochipek használata már ma is lehetővé teszi a következő problémák megoldását:

pontos diagnózis, a betegség új altípusainak azonosítása, a besorolás pontosítása;

a betegség lefolyásának és klinikai kimenetelének előrejelzése, az onkohematológiai betegségek patogenezisében szerepet játszó gének és jelátviteli utak azonosítása, új célpontok keresése az irányított differenciált terápia számára;

egyszerűbb és olcsóbb diagnosztikai tesztek fejlesztése, létrehozása, beleértve a mikrochip technológián alapulókat is (tíz- és százezer helyett több tíz vagy száz gén mintát tartalmazó mikrochipek);

microarray-ek bevonása a prospektív klinikai vizsgálatokba, a microarray-re vonatkozó elemzési eredmények megerősítése a klinikai kezelési protokollokba való felvétel céljából, klinikai protokollok tervezése a microarray technológiával nyert betegségek természetére vonatkozó új adatok figyelembevételével.

DNS microarray(angolul DNS microarray) egy összetett technológia, amelyet a molekuláris biológiaés az orvostudomány. A DNS-mikrochip egy kis felület, amelyen az egyszálú szintetikus DNS ismert szekvenciájú fragmentumai nagy sűrűséggel, meghatározott sorrendben rakódnak le. Ezek a fragmensek próbaként működnek, amelyekkel a vizsgált mintából általában fluoreszcens festékkel jelölt komplementer DNS-szálakat hibridizálnak (kétszálú molekulákat képeznek). Minél több bizonyos szekvenciával rendelkező DNS-molekula található a mintában, annál több kötődik belőlük a komplementer próbához, és annál erősebb lesz az optikai jel azon a mikrochip-ponton, ahová a megfelelő szondát „ültették”. A hibridizációt követően a mikrochip felületét letapogatják, és ennek eredményeként az egyes DNS-szekvenciák a keverékben jelen lévő, ezt a szekvenciát tartalmazó DNS-molekulák számával arányos jelszinthez kapcsolódnak.

Hagyományos DNS-microarray-ben (pl. az Affymetrix által gyártott) a szondákat szilárd felülethez - üveg- vagy szilikon chiphez - rögzítik. Más platformok, például az Illumina által gyártottak, mikroszkopikus golyókat használnak a nagy kemény felületek helyett. A DNS microarray technológia a modern biológiában és az orvostudományban a legkülönfélébb alkalmazási lehetőségeket találja a DNS komplex keverékeinek elemzésére – például egy sejtben lévő összes transzkriptum (hírvivő RNS) elemzésére. A DNS microarray-eket a génexpresszió változásainak elemzésére, az egynukleotidos polimorfizmusok azonosítására, a genotipizálásra vagy a mutáns genomok újraszekvenálására használják. A mikrochipek tervezésében, teljesítményében, pontosságában, hatékonyságában és költségében különböznek egymástól.

Példa a DNS microarray használatára

Az alábbiakban egy DNS-microarray-t használó kísérlet példája látható.

1. A biológiai mintákat elkülönítik vagy növesztik összehasonlítás céljából. Megfelelhetnek ugyanazoknak az egyéneknek bármely kezelés előtt és után (páros összehasonlítás esetén), vagy különböző egyének csoportjainak, például betegeknek és egészségeseknek stb.
2. A mintából tisztított nukleinsavat izolálnak, amely a vizsgálat tárgya: lehet RNS a génexpressziós profil vizsgálatánál, DNS az összehasonlító genomiális hibridizáció vizsgálatánál stb. Ez a példa az első esetnek felel meg.
3. Az átvett minőség és mennyiség ellenőrzése nukleinsav. Ha a követelmények teljesülnek, a kísérlet folytatható.
4. A rendelkezésre álló RNS-minták alapján a reverz transzkripció során komplementer DNS-szekvenciákat (cDNS, angol cDNS) szintetizálnak.
5. Az amplifikáció (további DNS-másolatok szintézise) során a mintákban lévő cDNS-szekvenciák száma sokszorosára nő.
6. A cDNS-szekvenciák végeihez fluoreszcens vagy radioaktív jelölések kapcsolódnak.
7. A kapott mintákat összekeverjük a szükséges vegyszerek mikroszkopikus lyukon keresztül DNS-microarray-ekre visszük fel, és megkezdődik a hibridizációs folyamat, melynek során az egyik cDNS-lánc csatlakozik a mikromátrixon lévő komplementer lánchoz.
8. A hibridizációs folyamat befejezése után a forgácsokat mossuk, hogy eltávolítsuk a maradék anyagot.
9. A kapott mikrochipeket lézerrel szkenneljük. A kimenet egy- vagy kétszínű képek (a felhasznált színezékek mennyiségétől függően).
10. Minden egyes képre rács kerül rácsra úgy, hogy minden cellája megfelel egy-egy chipszakasznak azonos típusú mintákkal. A rácscellában lévő minták lumineszcencia intenzitása egy bizonyos számhoz van rendelve, amely a legelső közelítésben a megfelelő mintában lévő RNS-szekvenciák számának mértékeként szolgálhat.

Az eredmények további feldolgozása komplex statisztikai apparátus többlépcsős bevonását igényli.

Kísérleti adatok előfeldolgozása

Az azonos gént reprezentáló, azonos DNS-microarray két mintájának intenzitása közötti korreláció általában nagyobb, mint 95%. Ezt a tényt gyakran a chipekkel végzett kísérletek jó reprodukálhatóságának megerősítéseként értelmezik. Ha azonban ugyanazt a biológiai anyagot két részre osztjuk és különböző mikrotömbökkel készítjük, a kapott intenzitások közötti korreláció valószínűleg 60-80%. A chipek és az azonos alomból származó egerekből vett minták közötti korreláció 30%-ra csökkenhet. Ha a kísérleteket különböző laboratóriumokban végzik, az eredmények között még kisebb lehet az összefüggés.

Az intenzitások ilyen alacsony reprodukálhatósága számos variációs forrás kumulatív hatásához kapcsolódik. Három nagy csoportra oszthatók. A biológiai változatosság magában foglalja az élőlények sajátosságait. A technikai eltérések a minta izolálása, festése és hibridizáció szakaszában jelentkeznek. A mérési hiba a kész tömbök szkennelésével jár, aminek eredményét befolyásolhatja például a szkenner belsejében lévő por.

A technikai eltérések és a mérési hibák hatásainak semlegesítése a DNS microarray előfeldolgozás szakaszában történik.

Háttérkorrekció

A háttérkorrekció szükségességét olyan zavaró tényezők jelenléte okozza, mint például a zaj optikai rendszer felismerés (a szkennelés során kapott intenzitásadatok nem egyenlők a "valódi" mintaintenzitásokkal) és a nem specifikus hibridizáció (nukleotidszekvenciák csatolása idegen minták próbáihoz).

Normalizálás

Az adatok normalizálása lehetővé teszi, hogy több, a kísérletben figyelembe vett chipet alkalmassá tegyünk az egymással való összehasonlításra. Az elemzés fő célja ebben a szakaszban az, hogy kizárja a szisztematikus nem biológiai különbségek hatását a mikrotömbök között. Az ilyen eltérések forrásai számosak: változatosak a reverz transzkripció hatékonyságában, festékjelölés, hibridizáció, chipek közötti fizikai különbségek, kis különbségek a reagenskoncentrációkban, eltérések a laboratóriumi körülmények között.

Kimutattuk, hogy a normalizálási módszer megválasztása jelentős hatással van az elemzés eredményére.

Összegzés

Az azonos szekvenciákhoz tartozó összes minta expressziós szintértékeinek általánosítása

Minőség ellenőrzés

Kibocsátás feldolgozás

A statisztikai feldolgozás fő szakasza

Linkek

• DNS microarray
• DNS microarray kísérlet – cikk az angol Wikipédiából
• DNS Microarray Virtual Lab – lépésről lépésre interaktív példa egy kétszínű DNS mikrotömbbel végzett kísérletre
• A Microarray Analysis tíz buktatója – gyakori hibák a DNS microarray elemzésben

A fiatal kaliforniai Affymetrix cég (1993-ban indult) a genetikai kutatóeszközök piacvezetői közé tartozik.

A cég a félvezető-technológia, úgymond "mikroáramköri" ipar és a biokémiai tesztek forradalmi kombinációjáról ismert.

Az Affymetrix DNS chipjeit széles körben használják a genetikai elemzéssel és géntechnológiával foglalkozó különféle laboratóriumokban.

De a hétköznapi embereket sokkal jobban érdekli a cég egy másik terméke. Ez egy mikrochip-szerű eszköz, amely lehetővé teszi, hogy különböző állatokból származó DNS-ek tucatjait azonosítsa egy emberi élelmiszermintában.

A bioMerieux FoodExpert-ID gyakorlatilag az úgynevezett GeneChip változata.

A készülék 12 emlősfaj, 5 baromfifaj és 16 halfaj biológiai nyomait képes azonosítani az élelmiszerekben.

Így kideríthető, hogy a vásárlóban gyanút keltő libapástétom valóban libamájat tartalmaz-e, nem pedig mást.

A DNS-chip a számítógéphez hasonló technológiákkal készül, de nem elektromos, hanem bioobjektum (illusztráció az affymetrix.com weboldalról).

És például a muszlimok ellenőrizhetik, hogy a hanyag gyártók nem tesznek-e sertéshúst a „marhaszeletbe”.

Mindez azonban működik, csak további laboratóriumi képességek bevonásával, így a hétköznapi fogyasztó nem tudja majd „csupasz” formában, térdre fekve használni a chipet.

Ahhoz, hogy megértsük a FoodExpert-ID működését, emlékeznünk kell egy kicsit a genetikára: a DNS kettős hélixekre, amelyek az alapmolekulákat alkotják - adenin, guanin, timin és citozin, valamint arra is, hogy csak párban, például kulcsokkal és zárakkal kapcsolhatók össze.

A DNS-chip a DNS-kód számtalan és számtalan "felezett" fragmentumát tartalmazza.

A chip felületének egy darabja kulcsmolekulákkal (illusztráció az affymetrix.com webhelyről).

A köröm méretű chip felülete 97 000 négyzetre van osztva, ezeket "jellemzőknek" nevezik.

Minden körülbelül 26 mikron átmérőjű "jellemző" csak egy DNS-kódot tartalmaz. Pontosabban sok-sok hasonló molekula.

És mindegyik abszolút a 33 állat valamelyikére utal.

Minden darab hossza 17 alap. Ez elegendő a megbízható azonosításhoz, hiszen 17, tetszőleges helyen sorrendben felvett hang elegendő ahhoz, hogy a rendelkezésre álló adatbázisból valamilyen dallamot találjunk.

A kísérletezők széttört DNS-darabok egész sorát vonják ki egy élelmiszer-standardból. Mi nincs ott. És akkor?

A "helytelen" genetikai kóddarabokat lemossák, a megfelelőket pedig rögzítik a chipen. A vöröses gyöngyök fluoreszkáló molekulák (az affymetrix.com illusztrációja).

Adjunk hozzá egy fluoreszcens anyag molekuláit a genetikai kódot alkotó molekulákhoz. Vigye fel ezt a keveréket a FoodExpert-ID felületére. Kevés tennivaló maradt.

Minden egyező kódrészletet egyesítenek a "natív" szekvenciáikkal egyik vagy másik "funkcióban".

Most a chip vízzel mosható - minden felesleg eltűnik. A chipet lézersugár alá helyezzük, és a befogott anyagot tartalmazó négyzetek fényesen ragyognak. Már csak a chiptérkép ellenőrzése maradt, hogy megtudja, melyik DNS-t határozták meg.

A ragyogás intenzitásából pedig közvetett következtetést vonhatunk le a disznó- és marhahús arányára a hipotetikus szeletünkben.

Amint látjuk, a chip megvalósítása viszonylag egyszerű, és lehetővé teszi, hogy a nagyon hagyományos berendezéssel rendelkező laboratóriumok genetikai elemzést végezzenek.

De milyen okos a chip létrehozása. Az ilyen biokémiai remekművek automatikus és tömeges létrehozásához az Affymetrix egyesítette a fotolitográfia és a kombinatorikus kémia elveit.

A színes négyzetek olyan „jellemzők”, amelyek felelősek az egyik vagy másik DNS-kód azonosításáért (illusztráció az affymetrix.com webhelyről).

A kiindulási terméket - egy kvarclemezt - speciális reagenssel, a szilánnal vonják be, amely szorosan kötődik a kvarchoz, és szigorúan periodikus (egyenletes felületi sűrűségű) molekulamátrixot képez, amely készen áll a nukleotidok befogadására.

A készülő kód láncaiban az alapok függőlegesen felfelé haladnak, és rétegről rétegre azonnal felviszik a teljes felületre.

Nyilvánvalóan minden alkalommal, amikor valamilyen anyagot visznek fel a chipre, és hogy az kizárólag bizonyos „tulajdonságokban” rögzítse magát, azokat a mikron négyzeteket, maszkokat használják, hasonlóan a mikroáramkörök gyártásához szükségesekhez.

Pillanatkép egy reagált chipről hatalmas lendülettel. A hófehér, vöröses, sárga négyzetek azok a területek, ahol a legmagasabb a fluoreszcens anyag koncentrációja. Zöld, kék, fekete - rendre, egyre több alacsony (illusztráció az affymetrix.com webhelyről).

Minden alkalommal csak azok az alapok tapadnak a chip alapjához, amelyeket a maszk lyukain keresztül ultraibolya fénnyel világítanak meg.

Ebben a szekvenciális szintézis folyamatában a legfontosabb, hogy minden alkalommal a legújabb maszkot alkalmazzuk mikronos pontossággal, különben minden genetikai kódok keverve a tányéron.

Így lépésről lépésre (az élelmiszerchipben 17, a cég más modelljeiben legfeljebb 24 darab van) nukleotidláncok függőleges oszlopai jönnek létre, amelyek a gének kulcselemzőit alkotják.

Ez a fejlesztés természetesen nem csak az olyan nevetséges (talán első ránézésre) felhasználási területeket, mint a libapástétomban található malachús kimutatása szolgálja, hanem teljesen komoly kutatásokat is.

Valóban, a chip felületén, tovább elméleti szinten, bármilyen genetikai kód darabjait alkalmazhatja.

Affymetrix munkája redundáns megerősítése annak, hogy a legfigyelemreméltóbb és legígéretesebb felfedezések a tudományok és tudományágak metszéspontjában születnek.

Úgy néz ki, mint a természetben előforduló biobőség, amelyet gének keverésével nyernek. Nem?