Ļauj analizēt lielu skaitu ģenētisko pazīmju vienā izejmateriāla paraugā. Šajā gadījumā ir vēlams, lai DNS mikroshēmām būtu divas īpašības, kas savā ziņā ir pretrunā viena otrai. No vienas puses, ir interesanti, ka vienā DNS mikroshēmā ir pēc iespējas vairāk šūnu, lai iegūtu vairāk informācijas par pētāmo paraugu. Tajā pašā laikā pētnieki bieži ir spiesti strādāt ar ļoti maziem bioloģiskā materiāla apjomiem, tāpēc, jo mazāks ir DNS mikroshēmas izmērs, jo labāk.
Mūsdienu metodes(piemēram, atomu spēka mikroskopija, AFM) ļauj noteikt signālu DNS mikroshēmas šūnās, ja to izmēri ir vairāki desmiti nanometru. Metodes šādu DNS mikroshēmu izgatavošanai ir balstītas uz litogrāfiju (vispievilcīgākā metode ir dip-pen nanolitography, DPN). Mikroshēmu veidošana ar tik mazām šūnām parasti ir diezgan dārga un laikietilpīga.
Zinātnieku grupa no ASV un Korejas ierosināja metodi lētākai, ātrākai un masu produkcija DNS mikro- un nanoshēmas. Pētnieki parādīja, ka, ņemot par paraugu vienu DNS mikroshēmu, ir iespējams vienā solī izdrukāt mikroshēmu, kas papildina oriģinālo. Šo DNS mikroshēmu iegūšanas metodi sauc par supramolekulārās nanodrukas metodi (supramolekulārā nanoštancēšana, SuNS) un shematiski parādīta 1. attēlā.
Kā paraugu zinātnieki paņēma ar zelta nanodaļiņām piešūtu vienpavedienu DNS masīvu, kurā šūnas izmērs bija 9 ± 2 nm un attālums starp šūnām bija 77 ± 9 nm. Šai DNS mikroshēmai tika pievienota komplementāra DNS, kas modificēta ar heksiltiolu 5' galā. Pēc hibridizācijas (t.i., komplementāru DNS virkņu saistīšanās) parauga mikroshēmā tika novietots ar zeltu pārklāts stikla substrāts. Šim jaunajam substrātam ir pievienotas komplementāras DNS virknes. Pēc tam 90 ° C temperatūrā tika veikta dehibridizācija, un rezultātā tika iegūts nospiedums, kas papildināja sākotnējo paraugu.
Izpētot iegūto kopiju, zinātnieki secināja, ka nospiedums tika izveidots veiksmīgi: jaunajā DNS mikroshēmā bija 14±2 nm lielas šūnas, kas atdalītas ar 77±10 nm atstarpēm (2. attēls). Lai parādītu, ka šūnu izvietojums masīvā ir vienāds paraugam un izdrukai, abos gadījumos tika aprēķināta radiālā sadalījuma funkcija (3. attēls). Var redzēt, ka funkcijas izrādījās diezgan līdzīgas.
Nākotnē ir jāparāda, ka SuNS ir piemērots daudzkomponentu mikroshēmu drukāšanai un daudzu kopiju izgatavošanai no viena parauga, nezaudējot precizitāti. Pētnieki uzskata, ka tuvākajā nākotnē varēs to pierādīt.
Žurnālā tika publicēts darbs "Supramolekulārās nanoštancēšanas pielietojums DNS nanoarray replikācijai". Nano burti.
Pēdējā laikā aktīvi tiek attīstītas DNS tehnoloģijas, kas ļauj ne tikai noteikt pazīmi, bet arī vienlaikus veikt diferenciālo sekvencēšanu, t.i. punktu mutāciju vai polimorfismu noteikšana zināmos genoma reģionos. Šīm tehnoloģijām ir ievērojamas priekšrocības salīdzinājumā ar tradicionālajām molekulāri bioloģiskajām metodēm, jo tie ļauj miniaturizēt testa paraugu un analizatoru, kas būtiski samazina analīzes izmaksas un tās veikšanas laiku, kā arī vienlaikus noteikt dažādus testa parauga parametrus, nezaudējot pastiprināšanas metožu jutīgumu. Metožu galvenā priekšrocība, pamatojoties uz mikroshēmu izmantošanu ar visiem iespējamiem oligonukleotīdiem nukleotīdu sekvencesņemot vērā garumu, ir to daudzpusība. Jebkuras secības oligonukleotīda klātbūtne mikroshēmā ļauj analizēt jebkuru pētāmo secību. Mikroshēmu izmantošana balstās uz noteiktu ligandu mijiedarbības ātru noteikšanas principu ar daudzām dažādām zondēm vienlaicīgi. Faktiski bioloģiskās mikroshēmas ir viens vai otrs ciets substrāts, uz kura tiek nogulsnēti noteikti nukleīnskābju fragmenti vai proteīni, vai ogļhidrāti, vai jebkuras citas zondes molekulas, kuras var atpazīt vai kurām ir bioloģiska aktivitāte. Dažādu zondu skaits uz pamatnes var sasniegt simtiem tūkstošu, un katra veida mikroshēmas ir stingri identiskas, un, izmantojot esošās tehnoloģijas, tās var atkārtot simtos tūkstošu un miljonos kopiju, kas tiek nogulsnētas uz substrāta.
DNS mikroshēmas
Ir olbaltumvielas, DNS, ogļhidrāti, audu mikroshēmas. īpašu uzmanību ir pelnījuši DNS mikroshēmas. Tie ir unikāls analītisks rīks, kas ļauj noteikt noteiktu DNS sekvenču klātbūtni analizētajā paraugā (parasti bioloģiskas izcelsmes) (tā sauktā hibridizācijas analīze). Analīze, izmantojot DNS mikroshēmas, ir vairākas reizes lētāka nekā izmantojot alternatīvas tehnoloģijas (elektroforēze, reāllaika PCR) un ļauj vienkārša dizaina detektora klātbūtnē strādāt ārpus laboratorijas.
Pirmo reizi DNS mikroshēmas pētījumos tika izmantotas pagājušā gadsimta 80. gadu beigās. Šī tagad plaši izmantotā metode, kas ļauj vienlaikus analizēt vairāku gēnu ekspresiju, ir balstīta uz mRNS vai cDNS mērķu atpazīšanas principu, izmantojot to hibridizāciju ar vienpavedienu DNS fragmentiem, kas imobilizēti mikromasīvā.
DNS mikroshēma ir ciets substrāts, uz kura tiek imobilizēti dažāda garuma vienpavedienu DNS fragmenti (parasti kovalenti): īsie - 15-25 nukleotīdi, garie - 25-60 nukleotīdi un cDNS fragmenti - no 100 līdz 3000 nukleotīdiem. . Pamatnes materiāls ir stikls, silīcijs, dažādi polimēri, hidrogēli (piemēram, uz poliakrilamīda bāzes) un pat zelts.
Hibridizācija ir tehnoloģiju pamats
Visu mūsdienu DNS tehnoloģiju pamatā ir hibridizācija. Hibridizācijas rezultātā nukleīnskābju molekulas spēj veidot stabilas divpavedienu struktūras, pateicoties saitēm starp molekulu elementiem - nukleotīdiem. Nukleotīds adenīns (A) ir komplementārs timīnam (T), guanīns (G) ir komplementārs citozīnam (C). Rezultātā vienpavedienu ATHC nukleotīdu secība veidos stabilu asociāciju, divpavedienu struktūru, ar TACG sastāva vienpavedienu DNS molekulu.
….. ATHC….
| | | |
….. TACG….
Šāda komplementaritāte noved pie divu DNS molekulu "pielipšanas", no kurām viena var būt nekustīgi nostiprināta uz substrāta un būt DNS mikroshēmas elements. Jo vairāk molekulu, kas papildina mikroshēmas elementus, ir paraugā, jo vairāk no tām saistīsies ar mikroshēmu, un jo lielāka būs šī elementa uztvertā signāla intensitāte. Uz att. 1 parāda DNS šūnas vai oligonukleotīdu biočipa darbības principu, pamatojoties uz adenīna bāzes komplementāru mijiedarbību ( A) ar timīnu ( T) un guanīns ( G) ar citozīnu ( AR) divās DNS daļās. Ja bāzes secība vienā DNS virknē (vai oligonukleotīdā) ir pilnībā komplementāra otras virknes secībai, tad veidojas stabila ideāla divpavedienu spirāle - duplekss. Tomēr, piemēram, pat viena nepareiza pāra klātbūtne dupleksā G-G, novērš dupleksa veidošanos. Ja kādā no mikroshēmas elementiem tiek imobilizēta noteikta vienpavedienu DNS vai, teiksim, 20-mer oligonukleotīds (zonde), tad, kad ar fluorescējošām krāsvielām marķēti DNS fragmenti, piemēram, cilvēka genoms, tiek pievienoti mikroshēma, notiks to ļoti specifiska mijiedarbība. Konkrēts biočipa oligonukleotīda elements specifiski saistīs tikai vienu komplementāru secību no 4 20 =1,09x10 12 no visām iespējamām šāda garuma sekvencēm DNS. Rezultātā fluorescējošais spīdums tiek novērots tikai uz šī papildinošā biočipas elementa. Tādējādi viens biočipa elements rada vienu paraugu no aptuveni triljoniem iespējamo opciju, atšķirībā no elektroniskās mikroshēmas elementa, kur notiek binārais paraugs: JĀ vai NĒ.
Rīsi. 1. DNS dubultspirāles veidošanās shēma uz biočipa. Oligonukleotīds ir fiksēts uz viena no biočipa elementiem un selektīvi saista tikai komplementāro no daudziem fluorescējoši iezīmētiem DNS fragmentiem. Rezultātā tikai šis elements sāk mirdzēt. Tas ir saistīts ar ļoti specifisku komplementāru bāzes pāru mijiedarbību. A Ar T Un G Ar AR. Piemēram, nekomplementāra pāra klātbūtne G-G, novērš mijiedarbību un atstāj mikroshēmas elementu tumšu.
Hibridizācijas parametru noteikšanai izmantotās ierīces ļauj reģistrēt ne tikai gala rezultātu, bet arī komplementāro ķēžu asociācijas un disociācijas kinētiku. Šīs tehnoloģijas, lai arī ļauj veikt paraugu daudzparametru analīzi, var sniegt daudz informācijas. Hibridizācijas rezultāti ir atkarīgi no DNS parauga garuma, iezīmētā DNS mērķa ķīmiskā sastāva, temperatūras, kurā tiek veikta hibridizācija, hibridizācijas maisījuma sastāva un fluorescējošās marķējuma veida. Šeit jāatzīmē, ka pasīvo hibridizāciju galvenokārt izmanto DNS mikroshēmās; mērķa DNS mijiedarbība ar imobilizēto paraugu ir varbūtības process un ir atkarīgs no dažādiem apstākļiem.
DNS mikroshēmu izmantošana
Visu pētāmā organisma gēnu stāvokļa novērtējums un identificēšana ir viens no kritiski uzdevumi DNS mikroshēmu izstrādātājiem. Šīs problēmas risinājums ir īstenojams visu organisma gēnu imobilizācijā bioloģiskajā mikroshēmā, kas ļaus vispusīgi novērtēt gēnu stāvokli un genomu kopumā. Bioģenētiskās datu bāzes, kas satur visu informāciju (sistematizētu) par dažādu organismu gēniem un genomiem, sniedz pētniekiem lielas iespējas DNS mikroshēmu projektēšanā.
Galvenie biočipu pētījumu plašās izmantošanas iemesli ir augsta jutība, specifiskums un reproducējamība, procedūras vienkāršība, daudzu parametru vienlaicīgas analīzes iespēja un salīdzinoši zemās darba izmaksas. Tie paši iemesli liek mums uzskatīt biočipus par daudzsološu instrumentu dažādas jomas Tautsaimniecība.
Rezumējot, jāatzīmē, ka mikromasīvi ir efektīva pieeja desmitiem līdz tūkstošiem gēnu vienlaicīgai identificēšanai un to strukturālai analīzei, lai identificētu specifiskas nukleotīdu sekvences un nukleotīdu variācijas to struktūrā. Tomēr, ja gēni ir sastopami genomā vienas vai vairāku kopiju apjomā, kas pastāvīgi sastopams klīniskajā praksē, ir nepieciešama to iepriekšēja pastiprināšana. Lielākā daļa efektīva metode DNS amplifikācija ir polimerāzes ķēdes reakcija, kuras laikā notiek eksponenciāls DNS molekulu skaita pieaugums no vairākiem līdz miljoniem vai vairāk kopiju, un šāda veida PCR galvenā priekšrocība, jo reāllaika režīms ļauj pat kvantitatīvi novērtēt pētāmo matricu. . Tas ir svarīgi, lai atrisinātu problēmas fundamentālo un integrālo zinātņu attīstībā, kā arī optimizētu diagnostikas metožu nosacījumus.
Tātad divām metodēm, kas jau kļuvušas tradicionālas atsevišķās zinātnes jomās un lietišķajās tehnoloģijās, kopā ar to trūkumiem ir pilnīgi unikālas priekšrocības.
Reāllaika PCR:
ļauj novērtēt sākotnējās matricas daudzumu;
Neprasa papildu darbietilpīgus darba posmus;
· elektroforēzes stadijas neesamība samazina piesārņojuma risku un tādējādi samazina viltus pozitīvu rezultātu skaitu;
· matemātisko analīzes metožu izmantošana ļauj automātiski interpretēt iegūtos rezultātus un novērš elektroforegrammu subjektīvās vērtēšanas problēmu;
paredz mazāk stingras prasības PCR laboratorijas organizēšanai un rezultātu automātiskai reģistrācijai un interpretācijai;
ļauj ietaupīt laiku.
Bioloģiskās mikroshēmas:
ļauj miniaturizēt paraugu un analizatoru;
ietaupa analīzes laiku un izmaksas;
ļauj vienlaikus noteikt vairākus testa parauga parametrus;
· piemīt augsta pastiprināšanas metožu jutība, specifiskums un reproducējamība;
Nodrošina vieglu darbību.
Iespējams, ka šo metožu kombinācija, pārvēršot polimerāzes ķēdes reakciju mikromasīva formātā, ļaus izveidot jaunas paaudzes diagnostikas sistēmu, kam raksturīgas šādas īpašības: augstāka jutība un galvenokārt nukleīnskābju noteikšanas specifika, augsta produktivitāte. ar zemām analīzes izmaksām, kopumā samazinot manipulāciju skaitu katrā analīzes posmā.
Gēnu ekspresija- tas ir process, kura laikā iedzimtā informācija no gēna (DNS nukleotīdu secība) tiek pārvērsta funkcionālā produktā – RNS vai proteīnā. Gēnu ekspresijas regulēšana ļauj šūnām kontrolēt savu struktūru un funkcijas, un tā ir šūnu diferenciācijas, morfoģenēzes un adaptācijas pamatā.
DNS mikroshēmas ir unikāls analītisks rīks, kas ļauj noteikt doto DNS sekvenču klātbūtni analizētajā paraugā (parasti bioloģiskas izcelsmes) (tā sauktā hibridizācijas analīze). Analīze, izmantojot DNS mikroshēmas, ir vairākas reizes lētāka nekā izmantojot alternatīvas tehnoloģijas (elektroforēze, reāllaika PCR) un ļauj vienkārša dizaina detektora klātbūtnē strādāt ārpus laboratorijas.
Pirmo reizi DNS mikroshēmas 80. gadu beigās tika izmantoti pētījumos. Šī tagad plaši izmantotā metode, kas ļauj vienlaikus analizēt vairāku gēnu ekspresiju, ir balstīta uz mRNS vai cDNS mērķu atpazīšanas principu, izmantojot to hibridizāciju ar vienpavedienu DNS fragmentiem, kas imobilizēti mikromasīvā. Mūsdienu DNS mikromasīvs sastāv no tūkstošiem deoksioligonukleotīdu (zondes vai paraugi), kas sagrupēti mikroskopisku punktu veidā un fiksēti uz cieta substrāta. Katrs punkts satur vairākus pmolus DNS ar noteiktu nukleotīdu secību. DNS mikromasīva oligonukleotīdi var būt īsi gēnu vai citu DNS funkcionālo elementu posmi, un tos izmanto hibridizācijai ar cDNS vai mRNS (cRNS). Zondes un mērķa hibridizāciju nosaka un kvantitatīvi nosaka ar fluorescenci vai hemiluminiscenci, kas ļauj noteikt konkrētās sekvences nukleīnskābes relatīvo daudzumu paraugā.
Parastā DNS mikromasīvā zondes ir kovalenti piestiprinātas pie cietas virsmas – stikla vai silīcija mikroshēmas. Citās platformās, piemēram, Illumina ražotajās platformās, lielu cieto virsmu vietā tiek izmantotas mikroskopiskas bumbiņas.
DNS mikromasīvus izmanto, lai analizētu izmaiņas gēnu ekspresijā, identificētu viena nukleotīda polimorfismus, genotipētu vai atkārtotu mutantu genomu sekvencēšanu. Mikroshēmas atšķiras pēc dizaina, veiktspējas, precizitātes, efektivitātes un izmaksām.
DNS mikroshēmas:
CDNA mikromasīvi
oligonukleotīds
(divu krāsu ar fluorescences noteikšanu)
oligonukleotīds
(Affymetrix, vienkrāsains ar fluorescences noteikšanu)
membrānas c-DNS mikroshēmas
(ar radioaktīvo detektoru)
Gēla c-DNS mikroshēmas
Olbaltumvielu mikroshēmas
Mazliet vēstures
1980. gadi: proteīna čipsi
~1991. gads: atbalstīta DNS sintēzes ķīmija (augsts blīvums) — Affymetrix oligonukleotīdu mikroshēmas (Fodor, Stryer, Lockhart)
~1995: Mikrorakšanas roboti — Stenfordas Universitātes cDNS mikroshēmas (Pets Brauns un Dari Šalons)
1990. gadi: IMB gēla čipsi
Tomēr 1982. gadā Augenlihts un Kobrins ierosināja DNS masīvu ( Vēzis Pētījumi), un 1984. gadā viņi izgatavoja mikroshēmu, kas ietvēra 4000 elementus vēža šūnu izpētei.
(Raksts tika noraidīts ZinātneUn Daba)
Ko var pētīt, izmantojot DNS mikromasīvus?
Gēnu ekspresija dažādos audos
Gēnu ekspresija normālos un patoloģiskos apstākļos (normālās un vēža šūnās)
Gēnu ekspresijas izmaiņas laika gaitā ārējas ietekmes rezultātā (šūnu mijiedarbība ar patogēnu, zālēm)
Izteiksmes profili(raksti) atšķiras starp normālām un vēža šūnām vai starp dažādiem vēža veidiem. Izārstējami un neārstējami leikēmijas veidi rada dažādus modeļus. Pēc modeļu veida ar lielu varbūtību ir iespējams paredzēt slimības gaitu agrīnākajā stadijā.
Ekspresijas mikromasīvi
Viena no aktīvi attīstītajām jomām, izmantojot microarray tehnoloģiju, ir transkripcijas profilu izpēte sarežģītās slimībās. Lai gan visām mūsu ķermeņa šūnām ir viena un tā pati iedzimta genoma DNS, katra šūna ekspresē dažādus gēnus kā mRNS atbilstoši šūnu tipam, bioloģiskajiem procesiem, normāliem vai patoloģiskiem apstākļiem utt. Šī gēnu ekspresijas profilu daudzveidība ir intensīva pētījuma priekšmets tās bioloģiskās un klīniskās nozīmes dēļ. Mikroarray tehnoloģijas spēja analizēt simtiem un tūkstošiem gēnu ekspresiju ir izrādījusies vispieprasītākā, lai atšifrētu tik sarežģītu slimību kā vēzis. Microarray tehnoloģija ļauj vienlaikus uzraudzīt desmitiem tūkstošu gēnu ekspresiju, veidojot šūnas molekulāro portretu. Nozīmīgākās gēnu ekspresijas profilu izpētes sekas ir daudzu vēža veidu diagnoze, stratifikācija un prognoze. Lai gan histopatoloģiskais novērtējums, ko papildina citoģenētiskā izmeklēšana un vairāku molekulāro marķieru analīze, joprojām ir zelta standarts diagnostikā un prognozēšanā, jaunākais darbs liecina, ka daudzos gadījumos to var aizstāt ar gēnu ekspresijas profilēšanu. Vēža diagnostikai un prognozēšanai ir nepieciešama vairāku praktizētāju, piemēram, onkologu, patologu un citoģenētiķu, kopīga pieredze, un galīgie secinājumi var atšķirties atkarībā no metodoloģiskās pieejas un ekspertu pieredzes. Mikročipi varētu pilnībā aizstāt daudzu speciālistu centienus, turklāt uzlabot diagnozes un prognozes precizitāti, kā arī nodrošināt vienotu standartizētu platformu analīzei.
Gēnu ekspresijas analīzei izmanto divu veidu mikromasīvus: pamatojoties uz komplementāru DNS (cDNS) un pamatojoties uz oligonukleotīdu zondēm. Uz cDNS balstītas mikromasīvas ir DNS fragmenti, kas fiksēti uz standarta mikroskopisku stiklu virsmas vai uz cita cieta substrāta. Oligonukleotīdi, kuru garums ir 25–60 nukleotīdu bāzes (n.b.), tiek imobilizēti oligonukleotīdu mikromasīvos uz tā paša substrāta. Parauga sagatavošanas procedūra analīzei uz mikromasīviem ir parādīta 1. attēlā. 2. No šūnām tiek izolēta kopējā RNS (dažkārt tiek izolēta arī mRNS frakcija), pēc tam tiek veikta reversās transkripcijas reakcija, izmantojot kombinētu praimeru, kas satur poliA-termināla mRNS fragmentam komplementāru secību un T7 RNS polimerāzes reģionu. veicinātājs. T7 RNS polimerāzes promotora sekvences iekļaušana sintezējamajā cDNS ķēdē ļauj turpināt in vitro amplifikācijas reakciju: T7 RNS polimerāzes enzīms ražo daudzas RNS kopijas no katras cDNS molekulas mēģenē. Tādā veidā notiek sākotnējās mRNS lineāra amplifikācija. Parasti iegūto RNS molekulu marķēšana tiek veikta vienlaikus, jo reakcijā tiek izmantoti nukleotīdi, kas satur fluorescējošu marķējumu. Eksperimentos ar oligonukleotīdu mikromasīviem komplementāra RNS (cRNS) parauga marķēšanai bieži izmanto tāda paša veida fluorescējošu marķējumu, un gēnu ekspresijas līmeņi tiek noteikti, salīdzinot iegūtos fluorescējošos signālus ar signāliem no mikromasīva iekšējiem kontrolpunktiem. Strādājot ar mikromasīviem, kuru pamatā ir cDNS, eksperimentā parasti tiek izmantoti 2 paraugi: kontroles paraugs tiek marķēts ar vienu fluorescējošu krāsvielu, testa paraugs ar citu, pēc tam tos sajauc un hibridizē ar vienu mikromasīvu. Atbilstoši divu dažādu fluorescējošu marķējumu attiecībai katrā mikroshēmas šūnā tiek spriests par konkrētā gēna ekspresijas līmeņa paaugstināšanos vai samazināšanos. Neatkarīgi no tehnoloģiskās platformas katrs eksperiments ģenerē datus, kas satur desmitiem un simtiem tūkstošu gēnu ekspresijas līmeņa novērtējumu. Lai apstrādātu šādu datu apjomu, tiek izmantots diezgan sarežģīts matemātisks aparāts, galvenokārt klasteru analīze. Microarray datus var analizēt saistībā ar klīniskajiem datiem (uz hipotēzēm orientēta analīze, uzraudzīta analīze) vai neatkarīgi no pacienta klīniskajām īpašībām (neatkarīga analīze, bez uzraudzības).
Klasiskās metodes ļauj analizēt vairāku gēnu ekspresiju vienlaicīgi vai arī prasa izmantot specializētas mikromasīvu tehnoloģijas, piemēram, Affymetrix. Affymetrix izmanto fotolitogrāfijas un ķīmiskā sintēze oligonukleotīdi GeneChip® mikromasīvu ražošanai.
DZELTENS- ja gēns ir ekspresēts gan slimos (Cy5), gan normālos (Cy3) audos, tad DNS, kas marķēta gan ar sarkanu, gan zaļu krāsu, hibridizēsies šajā vietā, un rezultāts būs dzeltens.
SARKANS- ja gēns izpaužas tikai slimos (Cy5) audos, tad šajā vietā hibridizēsies tikai ar sarkanu krāsvielu marķēta DNS
ZAĻĀ- ja gēns ir izteikts tikai veselos (Cy3) audos, tad šajā vietā hibridizēsies tikai ar zaļu krāsvielu marķēta DNS
MELNS- ja gēns nav izteikts ne slimos, ne veselos audos
Tādējādi
DNS mikroshēmas ļauj vienlaikus analizēt informāciju par daudzu tūkstošu gēnu ekspresiju.
Galvenie pašlaik izmantotie DNS mikromasīvu veidi ir cDNS mikromasīvi un oligonukleotīdu mikroshēmas no Affymetrix.
cDNS mikromasīvu pamatā ir jauktu eksperimentālo un kontroles paraugu, kas marķēti ar dažādām fluorescējošām krāsvielām, hibridizācija ar mikroshēmu, uz kuras virsmas ir nogulsnēta divpavedienu c-DNS, kas atbilst ~ 10 000-20 000 gēnu.
Affimetrix mikroshēmas ir balstītas uz eksperimentālā parauga ar biotīnu iezīmētas cRNS hibridizāciju ar Perfect Match un Mismatch oligonukleotīdu komplektu, kas sintezēts uz mikroshēmas substrāta, kam seko streptavidīna-fikoeritrīna krāsošana. GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 ļauj vienlaikus analizēt 47 000 transkriptus, tostarp 38 500 raksturotus gēnus. Mikroshēmā ir 1 300 000 dažāda veida oligonukleotīdu.
Iegūto datu analīzei nepieciešama daudzpakāpju matemātiska apstrāde, izmantojot īpašas statistikas metodes.
Praktiski mikroshēmu izmantošana jau šodien ļauj atrisināt šādas problēmas:
precīza diagnostika, jaunu slimības apakštipu noteikšana, klasifikācijas precizēšana;
slimības gaitas un klīniskā iznākuma prognozēšana, onkohematoloģisko slimību patoģenēzē iesaistīto gēnu un signalizācijas ceļu identificēšana, jaunu mērķu meklēšana virzītai diferencētai terapijai;
vienkāršāku un lētāku diagnostikas testu izstrāde un izveide, tai skaitā uz mikroshēmu tehnoloģijām balstītu (mikročipi, kas satur paraugus desmitiem vai simtiem gēnu, nevis desmitiem un simtiem tūkstošu);
mikromasīvu iekļaušana perspektīvajos klīniskajos pētījumos, mikromasīvu analīzes rezultātu apstiprināšana iekļaušanai klīniskās ārstēšanas protokolos, klīnisko protokolu izstrāde, ņemot vērā jaunos datus par slimību būtību, kas iegūti, izmantojot mikroarray tehnoloģiju.
DNS mikromasīvs(angļu DNS microarray) ir sarežģīta tehnoloģija, ko izmanto molekulārā bioloģija un zāles. DNS mikroshēma ir neliela virsma, uz kuras noteiktā secībā ar lielu blīvumu tiek nogulsnēti vienpavedienu sintētiskās DNS fragmenti ar zināmu secību. Šie fragmenti darbojas kā zondes, ar kurām hibridizē (veido divpavedienu molekulas) komplementāras DNS virknes no pētāmā parauga, kas parasti ir marķētas ar fluorescējošu krāsvielu. Jo vairāk DNS molekulu ar noteiktu secību paraugā, jo vairāk no tām saistīsies ar komplementāro zondi, un jo spēcīgāks būs optiskais signāls mikroshēmas punktā, kur tika “iestādīta” atbilstošā zonde. Pēc hibridizācijas mikroshēmas virsma tiek skenēta, un rezultātā katra DNS secība tiek saistīta ar vienu vai otru signāla līmeni, kas ir proporcionāls DNS molekulu skaitam ar šo secību maisījumā.
Parastā DNS mikromasīvā (piemēram, ražotā Affymetrix) zondes ir piestiprinātas pie cietas virsmas – stikla vai silikona mikroshēmas. Citās platformās, piemēram, Illumina ražotajās platformās, lielu cieto virsmu vietā tiek izmantotas mikroskopiskas bumbiņas. DNS mikromasīvu tehnoloģija mūsdienu bioloģijā un medicīnā atrod plašu pielietojumu klāstu, lai analizētu sarežģītus DNS maisījumus - piemēram, visu šūnā esošo transkriptu (Ziņojuma RNS) kopumu. DNS mikromasīvus izmanto, lai analizētu izmaiņas gēnu ekspresijā, identificētu viena nukleotīda polimorfismus, genotipēšanu vai mutantu genomu atkārtotu sekvencēšanu. Mikroshēmas atšķiras pēc dizaina, veiktspējas, precizitātes, efektivitātes un izmaksām.
DNS mikromasīva izmantošanas piemērs
Zemāk ir piemērs eksperimentam, izmantojot DNS mikromasīvu.
- Salīdzināšanai bioloģiskos paraugus izolē vai audzē. Tie var attiekties uz tiem pašiem indivīdiem pirms un pēc jebkuras ārstēšanas (pāru salīdzināšanas gadījumā) vai dažādām personu grupām, piemēram, slimiem un veseliem utt.
- No parauga tiek izdalīta attīrīta nukleīnskābe, kas ir pētījuma objekts: tā var būt RNS gēnu ekspresijas profila izpētē, DNS salīdzinošās genoma hibridizācijas izpētē u.c. Šis piemērs atbilst pirmajam gadījumam.
- Saņemtā kvalitātes un kvantitātes pārbaude nukleīnskābe. Ja prasības ir izpildītas, eksperimentu var turpināt.
- Pamatojoties uz pieejamajiem RNS paraugiem, reversās transkripcijas procesā tiek sintezētas komplementāras DNS sekvences (cDNS, angļu cDNS).
- Amplifikācijas (DNS papildu kopiju sintēzes) procesā cDNS sekvenču skaits paraugos daudzkārt palielinās.
- Fluorescējošas vai radioaktīvās etiķetes ir pievienotas cDNS sekvenču galiem.
- Iegūtie paraugi, sajaukti ar nepieciešamo ķīmiskās vielas tiek uzklāti uz DNS mikromasīviem caur mikroskopisku caurumu un sākas hibridizācijas process, kura laikā viena no cDNS ķēdēm pievienojas komplementārajai ķēdei uz mikromasīva.
- Pēc hibridizācijas procesa beigām skaidas tiek mazgātas, lai noņemtu atlikušo materiālu.
- Iegūtās mikroshēmas tiek skenētas, izmantojot lāzeru. Izvade ir vienas vai divu krāsu attēli (atkarībā no izmantoto krāsvielu daudzuma).
- Katram attēlam tiek uzlikts režģis, lai katra tā šūna atbilstu mikroshēmas sadaļai ar tāda paša veida paraugiem. Paraugu luminiscences intensitāte režģa šūnā tiek piešķirta noteiktam skaitam, kas pirmajā tuvinājumā var kalpot kā RNS sekvenču skaita mērs attiecīgajā paraugā.
Rezultātu tālākai apstrādei nepieciešama sarežģīta statistikas aparāta vairākpakāpju iesaiste.
Eksperimenta datu pirmapstrāde
Korelācija starp diviem viena un tā paša DNS mikromasīva paraugiem, kas pārstāv vienu un to pašu gēnu, parasti ir lielāka par 95%. Šis fakts bieži tiek interpretēts kā apstiprinājums eksperimentu ar mikroshēmām labajai atkārtojamībai. Taču, ja vienu un to pašu bioloģisko materiālu sadala divās daļās un veido ar dažādiem mikromasīviem, korelācija starp iegūtajām intensitātēm, visticamāk, būs no 60 līdz 80%. Korelācija mikroshēmās ar paraugiem, kas ņemti no viena un tā paša metiena pelēm, var samazināties līdz 30%. Ja eksperimentus veic dažādās laboratorijās, korelācija starp to rezultātiem var būt vēl mazāka.
Šāda zema intensitātes atkārtojamība ir saistīta ar daudzu izmaiņu avotu kumulatīvo efektu. Tos var iedalīt trīs lielās grupās. Bioloģiskā variācija ietver organismu raksturīgās iezīmes. Tehniskās variācijas parādās parauga izolācijas, krāsošanas un hibridizācijas stadijā. Mērījumu kļūda ir saistīta ar gatavo masīvu skenēšanu, kuras rezultātus var ietekmēt, piemēram, skenera iekšpusē esošie putekļi.
Tehnisko variāciju un mērījumu kļūdu ietekmes neitralizācija tiek veikta DNS mikromasīva priekšapstrādes stadijā.
Fona korekcija
Nepieciešamība pēc fona korekcijas ir traucējošu faktoru, piemēram, trokšņa, klātbūtnes dēļ optiskā sistēma atpazīšana (skenēšanas laikā iegūtie intensitātes dati nav vienādi ar "īstajām" paraugu intensitātēm) un nespecifiskā hibridizācija (nukleotīdu secību pievienošana svešu paraugu zondēm).
Normalizācija
Datu normalizēšana ļauj vairākas eksperimentā aplūkotās mikroshēmas padarīt piemērotas salīdzināšanai savā starpā. Galvenais analīzes mērķis šajā posmā ir izslēgt sistemātisku nebioloģisku atšķirību ietekmi starp mikromasīviem. Šādu atšķirību avoti ir daudzi: reversās transkripcijas efektivitātes variācijas, krāsvielu marķēšana, hibridizācija, fizikālās atšķirības starp mikroshēmām, nelielas atšķirības reaģentu koncentrācijās, atšķirības laboratorijas apstākļos.
Parādīts, ka normalizācijas metodes izvēlei ir būtiska ietekme uz analīzes rezultātu.
Apkopojums
Izteiksmes līmeņa vērtību vispārināšana visiem paraugiem, kas atbilst tām pašām sekvencēm
Kvalitātes kontrole
Emisiju apstrāde
Galvenais statistiskās apstrādes posms
Saites
- DNS mikromasīvs
- DNS mikromasīva eksperiments - raksts no angļu Vikipēdijas
- DNS Microarray Virtual Lab - soli pa solim interaktīvs piemērs eksperimentam ar divu krāsu DNS mikromasīvu
- Desmit mikromasīvu analīzes nepilnības — izplatītas kļūdas DNS mikromasīvu analīzē
Jaunā Kalifornijas kompānija Affymetrix (sākta 1993. gadā) ir viena no ģenētiskās izpētes ierīču tirgus līderiem.
Uzņēmums ir pazīstams ar savu revolucionāro pusvadītāju tehnoloģiju kombināciju, tā teikt, "mikroshēmu" industriju un bioķīmiskajiem testiem.
Affymetrix DNS mikroshēmas tiek plaši izmantotas dažādās laboratorijās, kas iesaistītas gēnu analīzē un gēnu inženierijā.
Bet parastos cilvēkus daudz vairāk interesē cits uzņēmuma produkts. Šī ir mikroshēmai līdzīga ierīce, kas ļauj identificēt desmitiem dažādu dzīvnieku DNS cilvēka pārtikas paraugā.
bioMerieux FoodExpert-ID praktiski ir tā sauktā GeneChip variācija.
Ierīce spēj identificēt bioloģiskās pēdas pārtikā no 12 zīdītāju sugām, 5 mājputnu sugām un 16 zivju sugām.
Tādā veidā tas ļauj noskaidrot, vai zoss pastēte, kas pircējam rada aizdomas, tiešām satur zosu aknas, nevis ko citu.
DNS mikroshēma ir izveidota, izmantojot datortehnoloģijām līdzīgas tehnoloģijas, taču tas nav elektrisks, bet gan bio objekts (attēls no affymetrix.com vietnes).
Un, piemēram, musulmaņi var pārbaudīt, vai nolaidīgi ražotāji neliek cūkgaļu "liellopa gaļas" kotletēs.
Tas viss tomēr darbojas, tikai piesaistot papildu laboratorijas spējas, tāpēc parastais patērētājs nevarēs izmantot čipu “plikā” formā, uz ceļa.
Lai saprastu, kā FoodExpert-ID darbojas, jums ir jāatceras nedaudz ģenētikas: DNS dubultspirāles, kas veido to bāzes molekulas - adenīnu, guanīnu, timīnu un citozīnu, kā arī to, ka tās var savienot tikai pa pāriem, piemēram, atslēgas un slēdzenes.
DNS mikroshēmā ir neskaitāmas un neskaitāmas DNS koda "uz pusēm samazinātu" fragmentu.
Mikroshēmas virsmas gabals ar galvenajām molekulām (ilutrācija no vietnes affymetrix.com).
Naga lieluma mikroshēmas virsma ir sadalīta 97 000 kvadrātos, ko sauc par "funkcijām".
Jebkura aptuveni 26 mikronu diametra "iezīme" satur tikai vienu DNS kodu. Precīzāk, daudzas, daudzas līdzīgas molekulas.
Un tie visi absolūti attiecas uz vienu no 33 dzīvniekiem.
Katra gabala garums ir 17 bāzes. Ar to pietiek drošai identifikācijai, jo pietiek ar 17 notīm, kas sakārtotas jebkurā vietā, lai atrastu kādu melodiju no pieejamās datu bāzes.
Eksperimentētāji no pārtikas standarta ekstrahē veselu šķelto DNS gabalu izkliedi. Kas tur nav. Un kas?
"Nepareizie" ģenētisko kodu gabali tiek nomazgāti, un atbilstošie tiek fiksēti mikroshēmā. Sarkanās lodītes ir fluorescējošas molekulas (ilustrācija no affymetrix.com).
Molekulām, kas veido ģenētisko kodu, pievienosim fluorescējošas vielas molekulas. Uzklājiet šo maisījumu uz FoodExpert-ID virsmas. Palicis maz darāmā.
Visas atbilstošās koda daļas tiks apvienotas ar to "native" sekvencēm vienā vai citā "funkcijā".
Tagad čipu var mazgāt ar ūdeni - viss liekais pazudīs. Mikroshēma tiek novietota zem lāzera stara, un kvadrāti, kas satur uzņemto materiālu, spīdēs spilgti. Atliek tikai pārbaudīt mikroshēmas karti, lai noskaidrotu, kura DNS ir noteikta.
Un pēc mirdzuma intensitātes mēs varam izdarīt netiešu secinājumu par cūkgaļas un liellopa gaļas proporcijām mūsu hipotētiskajā kotletē.
Kā redzam, mikroshēmas ieviešana ir salīdzinoši vienkārša un ļauj laboratorijām ar ļoti tradicionālu iekārtu komplektu veikt ģenētisko analīzi.
Bet cik gudra ir mikroshēmas izveide. Lai radītu šādus bioķīmiskus šedevrus automātiski un vairumā, Affymetrix apvienoja fotolitogrāfijas un kombinatoriskās ķīmijas principus.
Krāsainie kvadrāti ir "funkcijas", kas ir atbildīgas par viena vai otra DNS koda identificēšanu (attēls no vietnes affymetrix.com).
Sākotnējais produkts - kvarca plāksne - tiek pārklāts ar īpašu reaģentu silānu, kas cieši saistās ar kvarcu un veido stingri periodisku molekulāro matricu (ar vienmērīgu virsmas blīvumu), kas ir gatava uzņemt nukleotīdus.
Gaidāmā koda ķēdēs pamatnes iet vertikāli uz augšu, un tās uzreiz tiek uzklātas uz visas virsmas, slāni pa slānim.
Acīmredzot katru reizi, kad mikroshēmai tiek uzklāta noteikta viela un lai tā fiksētos tikai noteiktās “fīčās”, tiek izmantoti tie mikronu kvadrāti, maskas, līdzīgas tām, kas nepieciešamas mikroshēmu izgatavošanai.
Reaģētas mikroshēmas momentuzņēmums ar milzīgu impulsu. Sniegbalti, sarkanīgi, dzelteni kvadrāti ir apgabali ar visaugstāko fluorescējošās vielas koncentrāciju. Zaļš, zils, melns - attiecīgi ar arvien vairāk ar zemu (ilutrācija no vietnes affymetrix.com).
Katru reizi pie mikroshēmas pamatnes pielīp tikai tās pamatnes, kuras caur maskas caurumiem tiek izgaismotas ar ultravioleto gaismu.
Šajā secīgās sintēzes procesā galvenais katru reizi ar mikronu precizitāti uzklāt jaunāko masku, citādi viss ģenētiskie kodi sajauc uz šķīvja.
Tātad soli pa solim (pārtikas mikroshēmā tās ir 17, citos uzņēmuma modeļos līdz 24) veidojas vertikālas nukleotīdu ķēžu kolonnas, kas veido gēnu atslēgas-analizatorus.
Šī attīstība, protams, kalpo ne tikai tādām smieklīgām (varbūt no pirmā acu uzmetiena) pielietojuma jomām, kā sivēnu gaļas noteikšana zoss pastētē, bet arī pilnīgi nopietniem pētījumiem.
Patiešām, uz mikroshēmas virsmas, uz teorētiskais līmenis, varat izmantot jebkura veida ģenētisko kodu gabalus.
Affymetrix darbs ir lieks apstiprinājums tam, ka visievērojamākie un daudzsološākie atklājumi notiek zinātņu un disciplīnu krustpunktā.
Tas izskatās pēc biopārpilnības dabā, kas iegūts, sajaucot gēnus. Vai ne?
