hlavička
2
2
Izolácia a čistenie proteínov sa uskutočňuje postupne.
1. Homogenizácia- ide o dôkladné rozomletie predmetov biochemického výskumu do homogénneho, to znamená homogénneho stavu, to znamená, že proteíny prechádzajú dôkladným rozpadom až po deštrukciu bunkovej steny.
Pri tom používajú:
A) Nožové homogenizátory bojového typu;
b) tĺčikové homogenizátory Potter - Elveheim;
V) guľové a valcové mlyny - pre hustejšie predmety;
G) metóda striedavého zmrazovania a rozmrazovania, pričom pôsobením ľadových kryštálov dochádza k pretrhnutiu bunkovej steny;
e) metóda „dusíkovej bomby“ - pod vysokým tlakom sú bunky nasýtené dusíkom, potom sa tlak náhle uvoľní, uvoľní sa plynný dusík, ktorý akoby zvnútra exploduje;
e) Ultrazvuk, rôzne lisovacie metódy, trávenie bunkových stien enzýmami. Vo väčšine prípadov sa pri homogenizácii uvoľňuje teplo, pričom mnohé proteíny je možné inaktivovať, preto sa všetky postupy vykonávajú v chladiacich miestnostiach pri t 0 alebo sa suroviny chladia ľadom. Zároveň je starostlivo kontrolovaný objem a čas deštrukcie buniek, ako aj prevádzkový tlak. Ideálny homogenizát je taký, ktorý je možné ďalej extrahovať.
2. Extrakcia bielkovín, teda ich prechod do rozpusteného stavu; najčastejšie sa súčasne vykonáva extrakcia spolu s mletím.
Extrakcia sa vykonáva:
A) rozpustenie v 8-10% soľných roztokoch;
b) použitím tlmivých roztokov s pH od kyslého po mierne alkalické (boritanový, fosfátový, citrátový, tris-pufor: zmes trisaminometánu s NH2 - CH3 + HCl;
V) zrážanie proteínov organickými rozpúšťadlami (etanol, metanol, butanol, acetón a ich kombinácie), pričom dochádza k štiepeniu proteínovo-lipidovej a proteín-proteínovej zložky, čiže k deštrukcii HSB.
3. Purifikácia a frakcionácia proteínov. Po extrakcii sa zmes separuje alebo frakcionuje na jednotlivé proteíny a ďalej sa čistí:
a) vysolenie- ide o proces zrážania bielkovín neutrálnymi soľnými roztokmi alkalických a kovy alkalických zemín.
vysolovací mechanizmus– pridané anióny a katióny ničia hydratovaný proteínový obal proteínov, čo je jeden z faktorov stability proteínových roztokov. Najčastejšie sa používajú roztoky síranov Na a amónnych. Mnohé proteíny sa líšia veľkosťou hydratačného obalu a veľkosťou náboja. Každý proteín má svoju zónu solenia. Po odstránení vysolovacieho činidla si proteín zachová svoju biologickú aktivitu a fyzikálno-chemické vlastnosti. V klinickej praxi sa metóda vysolovania používa na separáciu globulínov (s prídavkom 50 % roztoku síranu amónneho (NH 4) 2SO 4 vzniká zrazenina) a albumínov (s prídavkom 100 % roztoku síranu amónneho (NH 4) 2SO 4 sa vytvorí zrazenina).
Vysolenie je ovplyvnené:
1) povaha a koncentrácia soli;
2) pH prostredia;
3) teplota.
Hlavnú úlohu zohrávajú valencie iónov. Preto sa účinok soli hodnotí iónovou silou roztoku μ:
, to znamená, že iónová sila roztoku (μ) sa rovná súčinu ½ koncentrácie každého iónu (C) a druhej mocniny jeho mocenstva (V).
Kohnova metóda je typ vysolovania. Súčasne prebieha extrakcia a zrážanie zložiek. Postupnou zmenou teploty (zvyčajne nízka t o -0 + 8 o C), pH roztoku a koncentrovaného etanolu sa z krvnej plazmy postupne izoluje až 18 proteínových frakcií.
Kohnovou metódou používané vo farmaceutickej výrobe pri výrobe krvných náhrad;
b) chromatografické metódy. Za zakladateľa vývoja chromatografických metód analýzy sa považuje ruský vedec Michail Tsvet (1903). V súčasnosti existuje veľa jeho odrôd. Metóda je založená na schopnosti látok špecificky sa adsorbovať na adsorbente uzavretom v stĺpci alebo umiestnenom na nejakom nosiči. Keď k tomu dôjde, separácia analyzovaných látok a ich koncentrácia v presne definovanej adsorbčnej vrstve. Potom kolónou prechádzajú vhodné eluenty (rozpúšťadlá), ktoré oslabujú adsorpčné sily a vymývajú adsorbované látky z kolóny. Látky sa zhromažďujú v zberači frakcií.
Základom chromatografie je distribučný pomer, čo sa rovná pomeru koncentrácie látky v mobilná fáza na koncentráciu látky v stacionárna fáza(alebo stacionárna fáza).
Stacionárna stacionárna fáza– môže byť pevná alebo kvapalná alebo zmes pevnej a kvapalnej látky.
mobilná fáza- kvapalný alebo plynný, preteká stacionárnym, alebo ním prechádza.
V závislosti od typu stacionárnej a mobilnej fázy existujú rôzne modifikácie chromatografickej analýzy.
Adsorpcia- je založená na rôznom stupni adsorpcie bielkovín adsorbentom a ich rozpustnosti v príslušnom rozpúšťadle.
Použité adsorbenty sú kyselina kremičitá, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, drevené uhlie. Adsorbent vo forme suspenzie s rozpúšťadlom (zvyčajne s tlmivým roztokom) je naplnený v kolóne (sklenená vertikálna trubica). Vzorka sa nanesie na kolónu, potom cez ňu prejde rozpúšťadlo alebo zmes rozpúšťadiel.
Separácia je založená na skutočnosti, že látky s vyššou distribúciou K. (B) pohyb pozdĺž kolóny rýchlejším tempom. Frakcie sa odoberajú pomocou zberača frakcií.
Deliaca chromatografia- založený na rozdelení zmesi bielkovín medzi dve kvapalné fázy. Separácia môže prebiehať na špeciálnom chromatografickom papieri, ako aj v kolónach, ako pri adsorpcii. Pevná fáza v tomto prípade slúži len ako nosič pre kvapalnú stacionárnu fázu. Chromatografický papier má vlastnosť zadržiavať vodu medzi svojimi celulózovými vláknami. Táto voda je stacionárna stacionárna fáza. Pri pohybe nevodného rozpúšťadla (mobilnej fázy) cez papier pôsobením kapilárnych síl sa molekuly látky usadené na papieri rozdelia medzi dve fázy v súlade s ich distribučným koeficientom. Čím vyššia je rozpustnosť látky v mobilnej fáze, tým ďalej sa bude pohybovať pozdĺž papiera spolu s rozpúšťadlom.
V prípade distribúcie chromatografie na kolóne sú nosičmi celulóza, škrob, silikagél atď., stacionárnou fázou je voda. Pri aplikácii na kolónu sa látky zmesi pohybujú pozdĺž kolóny rôznymi rýchlosťami, berúc do úvahy Krasp.
Rf pre každú zlúčeninu za štandardných podmienok je konštantná hodnota.
Iónomeničová chromatografia – založená na priťahovaní opačne nabitých častíc. Na tento účel sa používajú rôzne iónomeničové živice: katexové živice obsahujú negatívne nabité skupiny - sulfonované styrény a CMC, ktoré priťahujú kladne nabité ióny skúmaných látok. Nazývajú sa aj kyslé iónomeniče.
Aniónomeničové živice alebo zásadité iónomeniče obsahujú kladne nabité skupiny, ktoré priťahujú záporne nabité proteínové molekuly.
Trimetylaminostyrén je derivátom styrénov a celulózy.
V závislosti od q proteínov, ktoré sa majú separovať, sa používajú vhodné iónomeniče, s ktorými určité proteíny interagujú, zatiaľ čo iné voľne opúšťajú kolónu. Proteíny „vyzrážané“ na kolóne sa odstránia použitím koncentrovanejších soľných roztokov alebo zmenou pH eluentu.
Afinitná chromatografia (alebo afinitná chromatografia) je založená na princípe selektívnej interakcie proteínov alebo iných makromolekúl so špecifickými látkami imobilizovanými na nosičoch - ligandoch (tým môže byť koenzým, ak sa izoluje enzým, protilátka, antigén a pod. vysoká špecifickosť proteínov, imobilizované ligandy sú naň naviazané iba jeden proteín na zmes Vymýva sa zmesami pufrov so zmeneným pH alebo zmenenou iónovou silou.
Výhodou je možnosť izolovať danú látku vysokého stupňa čistoty v jednom kroku.
Metóda gélovej filtrácie alebo metóda molekulového sita je typom permeačnej chromatografie.
Separácia molekúl podľa veľkosti a tvaru je založená na vlastnostiach molekulového sita, ktoré má mnoho poréznych materiálov, ako sú organické polyméry s trojrozmernou sieťovou štruktúrou, ktorá im dáva vlastnosti gélov. Gélová filtrácia je separácia látok pomocou gélov na základe rozdielov vo veľkosti molekúl (sepharose, sephadex, sephacryl, biogels, atď.). Pôsobením epichlórhydrínu sa polysacharidové reťazce dextránu (syntetizované mikroorganizmami) zosieťujú do sieťovej štruktúry, stanú sa nerozpustnými vo vode, no zachovávajú si k nej vysokú afinitu. Vďaka tejto hydrofilnosti výsledné zrná (nazývané Sephadex) silne napučiavajú a vytvárajú gél, ktorý sa plní do kolóny. Metóda je založená na tom, že veľké molekuly nepreniknú do vnútornej vodnej fázy a menšie molekuly najskôr preniknú do pórov „sita“, akoby v nich uviazli, a preto sa pohybujú nižšou rýchlosťou. V súlade s tým proteíny s vyšším Mr vstupujú do prijímača ako prvé. V poslednej dobe sa ako molekulové sito v permeačnej chromatografii stále viac používajú porézne sklenené guľôčky.
Elektroforetická metóda v biochémii je založená na rozdiele v rýchlosti pohybu molekúl v elektrickom poli (aminokyseliny, peptidy, proteíny, nukleové kyseliny).
Rozdiel rýchlosti závisí od:
1. na q molekuly: čím väčšia je pohyblivosť molekúl, tým väčšia je celková q. Hodnota q závisí od pH;
2. na veľkosti molekúl: čím väčšie molekuly, tým menšia je ich pohyblivosť. Je to spôsobené nárastom trecích síl a elektrostatických interakcií veľkých molekúl s prostredím;
3. o tvare molekúl: molekuly rovnakej veľkosti, ale rôznych tvarov, napríklad fibrily a proteínové guľôčky majú rôznu rýchlosť. Je to spôsobené rozdielmi v silách trenia a elektrostatickej interakcie.
Typy elektroforézy
a) Izoelektrické zaostrovanie. K separácii dochádza na zvislom stĺpci v stupňoch. pH aj napätie. Pomocou špeciálnych nosičov amfolytov sa v kolóne zakladajú krúpy. pH od 0 do 14. Do kolóny sa vloží zmes látok a pripojí sa elektrický prúd. Každá zo zložiek sa presunie do tej časti kolóny, kde hodnota pH zodpovedá jej izoelektrickému bodu, a tam sa zastaví, to znamená, že je zaostrená.
Výhoda: oddeľuje, čistí a identifikuje proteíny v jednom kroku. Metóda má vysoké rozlíšenie (0,02 pI).
b) Izotachoforéza je elektroforéza na podpornom médiu. Po zapnutí elektrického prúdu sa ióny s najvyššou pohyblivosťou presunú k zodpovedajúcej elektróde ako prvé, pričom najnižšia - posledná, so strednou pohyblivosťou - sa nachádzajú v strede.
c) Disková elektroforéza – prístroj pozostáva z dvoch nádob s tlmivým roztokom – hornej a dolnej, spojených vertikálnymi trubicami obsahujúcimi gél s rôznymi pórmi. Ako sa ionizované častice pohybujú pôsobením elektrického prúdu. Vyššia pórovitosť je v hornej časti gélu.
d) Imunoelektroforéza - metóda kombinujúca elektroforézu s imunodifúziou (na dôkaz antigénov v zložitých fyziologických zmesiach). Zmes antigénov a zmes protilátok sú umiestnené kolmo na seba na špeciálnom nosiči. Po zapnutí elektrického prúdu sa rozdelia na jednotlivé látky a difundujú na gélovom nosiči. V mieste stretnutia antigénu s príslušnou protilátkou nastáva špecifická precipitačná reakcia vo forme oblúka. Počet vytvorených oblúkov zodpovedá počtu antigénov.
Metódy stanovenia Mr proteínov
O Vysoké číslo proteínov, chemické zloženie a poradie aminokyselín nebolo stanovené (1010–1012 proteínov), preto p. Používajú sa na to rôzne metódy.
a) Sedimentačná metóda - stanovenie Mr sa vykonáva v špeciálnych centrifúgach (prvú centrifúgu navrhol švédsky biochemik Svedberg), v ktorých je možné vytvoriť odstredivé zrýchlenie, ktoré je viac ako 200 tisíc a viacnásobné zrýchlenie zemská príťažlivosť. Mr sa určí z V sedimentácie molekúl. Keď sa molekuly pohybujú zo stredu na perifériu, ostrá hranica rozpúšťadlový proteín. Sedimentačná rýchlosť je vyjadrená ako sedimentačná konštanta (S):
kde V je rýchlosť pohybu rozhrania proteín-rozpúšťadlo (cm/s);
je uhlová rýchlosť rotora (rad/s);
je vzdialenosť od stredu rotora po stred bunky s roztokom proteínu (cm).
Hodnota sedimentačnej konštanty S, ktorá sa rovná 110–13 C, sa podmienečne berie ako 1 a nazýva sa 1 Svedberg (S). S pre proteíny sa pohybuje od 1 do 50 S, niekedy až do 100 S.
Mr proteínov je určený Svedbergovou rovnicou:
kde R je univerzálna plynová konštanta;
T - absolútna teplota od Kelvina;
S je sedimentačná konštanta;
D je koeficient difúzie;
je hustota rozpúšťadla;
V je čiastočný špecifický objem plynu.
Táto metóda je drahá kvôli použitiu zariadenia.
Jednoduchšie a lacnejšie:
b) Gélová filtrácia v tenkej vrstve Sephadexu.
Dĺžka proteínovej dráhy (v mm) je logaritmická k Mr.
X - Mr požadovaného proteínu na kalibračnom grafe.
c) Disková elektroforéza v polyakrylamidovej vrstve - existuje tiež vzťah medzi logaritmom Mr kalibračných proteínov a dĺžkou ich dráhy.
Metódy stanovenia homogenity proteínov
Stupeň čistoty izolovaného proteínu je určený:
- ultracentrifugácia;
- metóda diskovej elektroforézy;
- rôzne imunochemické metódy;
- stanovenie rozpustnosti bielkovín (metóda Northrop) je založené na fázovom pravidle, podľa ktorého rozpustnosť čistej látky za daných experimentálnych podmienok závisí len od teploty, nezávisí však od koncentrácie látky v tuhej fáze.
Ak je proteín homogénny, potom sa na grafe (a) získa jedna inflexia, ak sú v nej bielkovinové nečistoty (b, c), potom dostaneme niekoľko inflexií saturačnej krivky. Všetky proteíny majú svoje vlastné individuálne krivky rozpustnosti.
480 rubľov. | 150 UAH | 7,5 $, MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Diplomová práca - 480 rubľov, doprava 10 minút 24 hodín denne, sedem dní v týždni a sviatky
Kaisheva Anna Leonidovna Hmotnostná spektrometrická identifikácia proteínov a proteínových komplexov na čipoch mikroskopu atómovej sily: dizertačná práca... kandidát biologických vied: 03.01.04 / Kaisheva Anna Leonidovna; [Miesto ochrany: Nauch.-issled. in-t biomed. ich chémia. V.N. Orechovich RAMS].- Moskva, 2010.- 104 s.: chor. RSL OD, 61 10-3/1308
Úvod
Kapitola 1 Prehľad literatúry 10
1.1. Analýza vedeckých a technických podkladov v oblasti vysoko citlivých proteomických technológií
1.2 Charakterizácia vírusu hepatitídy C 20
1.2.1 Metódy diagnostiky hepatitídy C 22
1.2.2 Sérologické proteínové markery hepatitídy C 25
Kapitola 2. Materiály a metódy 28
2.1 ACM čipy 28
2.2 Proteínové prípravky a činidlá 29
2.3 Analýza AFM 30
2.4 Príprava vzorky na hmotnostnú spektrometrickú analýzu 31
2.5 Hmotnostná spektrometrická analýza 33
2.5.1 MALDI-MS analýza proteínov na povrchu AFM čipu 33
2.5.2 ESI-MS analýza proteínov na povrchu AFM čipu 34
Kapitola 3 Výsledky a diskusia 35
3.1 MS - identifikácia proteínov zachytených „chemickým rybolovom“ na povrchu AFM čipu z roztoku analytu
3.2 MS identifikácia proteínov biošpecificky zachytených na povrchu AFM čipu z roztoku analytu
3.3 MS identifikácia proteínov na povrchu AFM čipu biošpecificky izolovaných zo vzoriek krvného séra
Záver 83
Literatúra
Úvod do práce
Relevantnosť práce.
Jednou z prioritných oblastí modernej biochémie je vytvorenie efektívnych analytických metód pre proteomickú analýzu, ktorej hlavnou úlohou je detekcia a inventarizácia proteínov v tele, štúdium ich štruktúry a funkcií a identifikácia proteínových interakcií. Riešenie tohto problému umožní vytvorenie nových systémov na diagnostiku chorôb a ich liečbu. Štandardné metódy modernej proteomickej analýzy sú založené na separácii viaczložkových proteínových zmesí pomocou chromatografie, elektroforézy v kombinácii s hmotnostnými spektrometrickými metódami (MS) na identifikáciu proteínov. Napriek nepochybnej výhode štandardnej MS analýzy, pokiaľ ide o rýchlosť a spoľahlivosť identifikácie proteínových molekúl, má významné aplikačné obmedzenia z dôvodu nízkej
koncentračná citlivosť rozboru na úrovni 10" "10" M a vysoký dynamický rozsah obsahu bielkovín v biologickom materiáli. Zároveň prevažná väčšina funkčných proteínov vrátane biomarkerov takých spoločensky významných ochorení, akými sú vírusová hepatitída B a C, nádorové markery, atď., sú prítomné v krvnej plazme v koncentráciách o 10" Mi nižších.
Jedným zo spôsobov, ako prekonať toto metodologické obmedzenie koncentračnej citlivosti analýzy, je použitie biomolekulových detektorov, ktoré umožňujú detekciu jednotlivých molekúl a ich komplexov a teoreticky nemajú žiadne obmedzenia koncentračnej citlivosti. Biomolekulárne detektory zahŕňajú detektory založené na nanotechnologických zariadeniach, ako sú mikroskopy atómovej sily (AFM), nanodrôtové detektory, nanopóry a množstvo ďalších detektorov. Jedinečná citlivosť AFM detektorov umožňuje vizualizovať jednotlivé molekuly proteínov a spočítať ich počet. Pri použití AFM ako biomolekulového detektora je potrebné použiť špeciálne čipy, ktoré umožňujú koncentráciu makromolekúl biologického analytu z veľkého objemu inkubačného roztoku na obmedzený povrch čipu. Študované proteínové objekty sa môžu koncentrovať na povrchu čipu vďaka fyzikálnej alebo chemickej adsorpcii, ako aj vďaka biošpecifickým interakciám (AFM-biospecific fishing).
V praxi je však obmedzením použitia nanodetektorov na báze AFM to, že napriek možnosti vizualizácie jednotlivých molekúl proteínu na povrchu čipu ich takéto detektory nedokážu identifikovať, čo je dôležité najmä pri štúdiu komplexných proteínov. zmesi vrátane biologického materiálu. Preto sa vývoj metódy analýzy, ktorá dopĺňa možnosti metódy AFM, javí ako naliehavá úloha. Doteraz jedinou proteomickou metódou, ktorá umožňuje jednoznačnú a spoľahlivú identifikáciu proteínových molekúl, je MS analýza. V dizertačnej práci bol vyvinutý prístup, ktorý kombinuje vysokú citlivosť metódy AFM a spoľahlivú MS identifikáciu na detekciu proteínov a ich komplexov z roztoku analytu.
Účel a ciele štúdie.
Cieľom tejto práce bola hmotnostná spektrometrická identifikácia proteínov a proteínových komplexov detegovaných v biomateriáli pomocou mikroskopie atómovej sily.
Na dosiahnutie tohto cieľa boli vyriešené tieto úlohy:
Bola vyvinutá schéma MS identifikácie bielkovín zachytených na povrchu AFM čipu pomocou chemického alebo biošpecifického rybolovu;
Boli vyvinuté podmienky pre enzymatickú hydrolýzu proteínov na povrchu AFM čipu pre následnú MS identifikáciu;
Uskutočnila sa MS-identifikácia modelových proteínov na povrchu AFM čipu;
Uskutočnila sa MS-identifikácia proteínov na povrchu AFM čipu biošpecificky izolovaných z viaczložkovej zmesi (séra).
Vedecká novinka diela .
V dizertačnej práci bola vypracovaná schéma umožňujúca MS identifikáciu proteínov a proteínových komplexov zachytených z roztoku alebo viaczložkovej zmesi na povrchu AFM čipu. Na tento účel boli zvolené optimálne podmienky na prípravu vzorky, vrátane spôsobu hydrolýzy (teplota, vlhkosť, zloženie trypsinolytickej zmesi, doba trypsinolýzy) proteínových molekúl kovalentne a nekovalentne imobilizovaných na povrchu AFM čipu. Zvláštnosťou tejto práce bolo, že v porovnaní so štandardnými proteomickými protokolmi enzymatickej hydrolýzy sa príprava vzoriek na MS analýzu neuskutočňovala v roztoku, ale na obmedzenej ploche.
povrch čipu. Vyvinutá schéma umožnila efektívne vykonávať MS analýzu a identifikovať jednotlivé proteíny aj proteínové komplexy na povrchu AFM čipu. MS analýza proteotypových peptidov študovaných proteínov bola uskutočnená s použitím dvoch typov ionizácie (MALDI A EST) a dva typy detektorov (TOF a iónová pasca). Vyvinutá schéma na spojenie AFM-biošpecifického rybolovu a MS bola tiež úspešne testovaná na detekciu proteínových markerov vírusovej hepatitídy C (HCV) (HCVcoreAg a E2) vo vzorkách krvného séra.
Praktický význam diela .
Výsledky tejto práce umožňujú vytvoriť vysoko citlivé proteomické metódy bez použitia značiek a dodatočných postupov prípravy vzoriek na detekciu proteínov nachádzajúcich sa v nízkych koncentráciách v biologickom materiáli, vrátane krvného séra. Bol navrhnutý prístup založený na mikroskopii atómovej sily a hmotnostnej spektrometrii, ktorý umožní detekovať a identifikovať proteínové markery vírusu hepatitídy C v ľudskom krvnom sére.
Tento prístup je možné využiť vo vývoji zameraných na vytváranie nových diagnostických čipov, hľadanie biomarkerov širokého spektra spoločensky významných ochorení.
Schválenie práce.
Hlavné výsledky štúdie boli prezentované na „1., 2. a 3. medzinárodnom nanotechnologickom fóre“ (Moskva, 2008-2010); „IV. kongres Ruskej spoločnosti biochemikov a molekulárnych biológov“, Novosibirsk, 2008; na medzinárodnom kongrese „Human Proteome“, Amsterdam, 2008; na medzinárodnom kongrese „Human Proteome“, Sydney, 2010.
Publikácie.
Štruktúra a rozsah dizertačnej práce.
Dizertačná práca pozostáva z úvodu, prehľadu literatúry, popisu výskumných materiálov a metód, výsledkov výskumu a ich diskusie, záveru, záverov a zoznamu literatúry. Práca je prezentovaná na 104 stranách, ilustrovaná 33 obrázkami a 4 tabuľkami, zoznam literatúry tvorí 159 titulov.
Analýza vedeckých a technických podkladov v oblasti vysoko citlivých proteomických technológií
Jednou z prioritných oblastí v moderná veda je objaviť a objasniť úlohu rôznych typov bielkovín v organizme, ako aj pochopenie molekulárnych mechanizmov, ktoré vedú k rozvoju chorôb.
Napriek neustálemu zlepšovaniu proteomických metód zostáva počet novoobjavených biomarkerov chorôb takmer / nezmenený posledné desaťročie. Je to spôsobené tým, že koncentračný limit detekcie tradičných proteomických metód nepresahuje 10"9 M. Zároveň je pre proteomiku dôležité vyvinúť nové analytické prístupy na identifikáciu proteínov v nižšom koncentračnom rozsahu, najmä , proteínové molekuly s nízkou kópiou (s koncentráciou 10"13 M a menej), vrátane biomarkerov v biologickom materiáli. Pretože sa dá predpokladať, že práve v týchto koncentračných rozsahoch sa nachádzajú proteínové markery väčšiny chorôb.
Jednou z aktívne sa rozvíjajúcich oblastí, ktorá umožňuje mierne zvýšiť koncentračnú citlivosť analýzy, je vytváranie analytických komplexov na báze nanochromatografických a nanoelektroforetických systémov kompatibilných s hmotnostnými spektrometrami.
Nanochromatografický systém v kombinácii s hmotnostnou spektrometriou a ionizáciou typu elektrosprej umožnil zvýšiť citlivosť detekcie proteínov o dva rády v porovnaní s chromatografiou s vysokým rozlíšením(HPLC). Hranica koncentračnej citlivosti takýchto konjugovaných systémov je obmedzená citlivosťou štádia elektroforézy/chromatografie a nepresahuje 10-12 M pre jednotlivé proteíny (napríklad pre cytochróm C a bradykinín).
V súčasnosti sa chromatografické metódy rozvinuli do samostatných nezávislých oblastí - SELDI MS analýza (povrchová laserová desorpcia a ionizácia/hmotnostná spektrometria s časom letu), metódy lovu proteínov pomocou magnetických mikročastíc. V týchto technológiách sú hydrofóbne alebo nabité povrchy SELDI-čipov. alebo magnetické mikročastice, kombinácie s hmotnostnou spektrometrickou analýzou, sa úspešne používajú: pre? detekcia a identifikácia ako samostatné typy; proteíny a na profilovanie proteínov/peptidov krvného séra [c, 8; \b, 15]. SEbDIi МЄ je: výkonný prístup, ktorý vám umožňuje študovať biomateriál prostredníctvom adsorpcie biomolekúl (proteínov, peptidov) na chemicky aktivovanom? povrchu (katión/aniónomeničové čipy), po ktorej nasleduje hmotnostná spektrometrická analýza adsorbovaných molekúl:. uplatňuje sa prístup SEEDPMЄ; na proteínové profilovanie biomateriálu; a nedávno: používa sa ako „diagnostika pomocou proteomických čiarových kódov“ [17].. Podstatou takejto „diagnostiky čiarových kódov“ je identifikovať? vlastnosti proteínového profilu biologickej vzorky; spojené s konkrétnou chorobou: Áno, známe; čo d na. pri rakovinových ochoreniach je „proteomický čiarový kód“ biomateriálu výrazne odlišný od kódu v zdravých1 skupinách jednotlivcov: Preto kontrola nad zmenami v proteíne; zloženie biomateriálu sa môže stať základom pre včasnú diagnostiku chorôb. Na; dnes pomocou prístupu SELDI? Značky МЄ boli identifikované. rakoviny žalúdka, vaječníkov, prostaty a prsníka: Obmedzením tejto metódy5 je neschopnosť identifikovať proteíny s vysokým rozlíšením a presnosťou, čo je dôležité najmä pri; analýza viaczložkových zmesí, ako je biologický materiál.
Okrem problému nízkej koncentračnej citlivosti existujúcich analytických systémov sa kameňom úrazu proteomickej analýzy biologického materiálu stal široký dynamický rozsah koncentrácií proteínov, najmä v krvnom sére, ktorý sa pohybuje od 1 (GM až po jednotlivé molekuly proteínov). Vysokokópiové (hlavné) proteíny interferujú s detekciou a identifikáciou nízkokópiových (vedľajších) proteínov v takýchto systémoch.
Problém širokého koncentračného rozsahu proteínov v biomateriáli možno vyriešiť aplikáciou metód na ochudobnenie krvného séra o hlavné proteínové frakcie, metódami separácie viaczložkových zmesí a nanotechnologickými metódami založenými na biošpecifickom a chemickom love proteínových molekúl analytu z komplexných zmesí. na povrchu čipov k rôznym biosenzorom alebo na aktivovanom povrchu.magnetické mikroguľôčky.
Na separáciu viaczložkových proteínových zmesí sa tradične používa jednorozmerná, častejšie dvojrozmerná gélová elektroforéza. Princíp separácie proteínov dvojrozmernou gélovou elektroforézou je založený na rozdiele medzi proteínmi podľa hodnôt ich izoelektrických bodov Hf molekulových hmotností. V proteomike sa tieto prístupy využívajú na proteínové mapovanie biomateriálu (tkaniva, krvnej plazmy atď.). Kombinácia 1D a/alebo 2D elektroforézy s hmotnostnou spektrometriou umožňuje identifikáciu separovaných a vizualizovaných proteínov. Postup dvojrozmernej gélovej elektroforézy však stále nie je automatizovaný, je pomerne komplikovaný a časovo náročný, vyžaduje si vysokú kvalifikáciu operátora a výsledky analýzy sú často zle reprodukovateľné.
V porovnaní s dvojrozmernou elektroforézou je vhodnejší postup na separáciu proteínov vysokoúčinná chromatografia (HPLC); čo je automatizovaný postup, ktorý vám umožňuje odstrániť proteíny s vysokou kópiou z komplexnej zmesi, aby ste následne identifikovali proteíny s nízkou kópiou.
Na priamu identifikáciu proteínov v komplexných zmesiach je možné pripojiť chromatografickú kolónu k hmotnostnému spektrometru. Intaktné proteíny však prakticky nie sú prístupné vysokokvalitnej separácii pomocou HPLC, pretože počas analýzy denaturujú (kvôli nízkym hodnotám pH média a vysokej koncentrácii organických rozpúšťadiel) a tiež kvôli nízkej presnosti hmotnostnej spektrometrie. Preto je priama identifikácia väčšiny intaktných proteínov, najmä s molekulovou hmotnosťou presahujúcou 10 kDa, často nemožná. Analytická presnosť merania sa môže zlepšiť hydrolytickým štiepením proteínov na peptidové fragmenty, molekulová hmotnosť od 700 do 4000 Da pomocou proteáz; ako je trypsín (technológia zdola nahor). Na dosiahnutie kvalitatívnej separácie proteínov v zmesi sa používa kombinácia viacerých chromatografických postupov, takzvaná multidimenzionálna chromatografia.
Metódy diagnostiky hepatitídy
V súčasnosti sa na proteínovú diagnostiku hepatitídy C používajú testovacie systémy na detekciu anti-HCV core. Prvé testy ELISA zisťujúce prítomnosť protilátok proti HCV core boli dostupné začiatkom 90-tych rokov, ale mali nízku citlivosť a selektivitu. Neskôr, koncom 90-tych rokov, sa objavila nová generácia anti-HCVcore ELISA testov, ktorá mala dosť vysokú citlivosť okolo 95-99% a dokázala detekovať HCV niekoľko mesiacov po infekcii.
Napríklad v roku 1996 sa na ruskom trhu objavili testovacie systémy vyvinuté spoločnosťami Vector-Best (Novosibirsk) a Diagnostic Systems (Nižný Novgorod) na detekciu protilátok - anti-HCV triedy IgM. Úloha IgM protilátok v sérodiagnostike nie je dostatočne študovaná, avšak niektoré štúdie preukázali význam tohto markera pre detekciu chronickej hepatitídy C. Tiež sa zistilo, že korelácia medzi detekciou vírusovej RNA a anti-HCV IgM u pacientov je 80-95 %. Na určenie fázy vývoja vírusovej hepatitídy C Afanasiev A.Yu. et al., použili koeficient odrážajúci pomer anti-HCV IgG k anti-HCV IgM v krvi pacientov. Doposiaľ bolo vyvinutých mnoho systémov ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), ktoré detegujú cirkulujúce protilátky proti mnohým epitopom vírusu hepatitídy E.
Vo väčšine zdravotníckych zariadení v Moskve sa vykonáva moderná laboratórna diagnostika: vírusovej hepatitídy E; v súlade s existujúcimi nariadeniami ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie a ministerstva zdravotníctva: Moskva a má určiť imunoglobulíny? triedy G na vírus hepatitídy E (anti-HGV IgG) v krvnom sére pacientov. Identifikácia tohto markera umožňuje posúdiť prítomnosť súčasnej alebo minulej infekcie.
Nevýhody metód; Detekcie na báze EEISA sú okrem nízkej citlivosti (viac ako GO "12 M)j spôsobené aj falošnou detekciou, vírusová hepatitída E u pacientov - v dôsledku postinfekčnej imunity,., skrížená reaktivita protilátok, ako napr. aj nedostatočná citlivosť v akútnom období) fáza BFG BI ODKAZY: TOTO je aktívne vyhľadávanie citlivých, špecifických, rýchlych a ľahko vykonateľných metód na detekciu1 markerov „hepatitídy E .
Ďalšia skupina metód na detekciu vírusovej hepatitídy v sére: krv je-B_registrácia, RNA BEI pomocou PCR; Definícia RNA. metódy BFG; GAD nemožno použiť ako primárny test na - potvrdenie alebo vylúčenie; diagnóza; Ale; Možno; Užitočné na potvrdenie diagnózy: Diagnóza 1 BFG je analýzou 5' nekódujúcej oblasti RNA. Výsledky analýzy sa však medzi rôznymi genotypmi BFG líšia.
Na ruskom trhu sa objavili biologické mikročipy, ktoré umožňujú vykonávať - BFG genotypizáciu a - určiť účinnú antivírusovú schému; terapiu. Tento biočip je oligonukleotidový čip na genotypizáciu BFG na základe analýzy oblasti NS5B. Získané výsledky poukazujú na schopnosť biočipu identifikovať všetkých 6 HCV genotypov a 36 podtypov, vrátane najvirulentnejších a voči liekom rezistentných foriem.
Na jednej strane sú metódy analýzy PCR supersenzitívne a umožňujú detekciu a amplifikáciu signálu len z jednej molekuly RNA vo vzorke, no na druhej strane sa tieto metódy vyznačujú falošne pozitívnymi výsledkami v dôsledku náhodnej kontaminácie vzoriek, falošne negatívnymi výsledkami kvôli vysokej mutabilite vírusu a relatívne vysokým nákladom na analýzu. Dokonca aj u tej istej osoby sa hladiny HCV RNA môžu pravidelne meniť o viac ako milinásobok, čo vedie k falošne negatívnym výsledkom, ak sú nízke? replikácie vírusu alebo ak vírus pretrváva v tkanivách bez toho, aby sa dostal do krvi. Výsledky kvantitatívneho stanovenia RIG, HCV v rôznych laboratóriách sa dostatočne nezhodujú.
Osobitný význam pre včasnú detekciu biomateriálu vírusovej hepatitídy C Bt majú HCV proteínové antigény, pretože sa v krvnom sére objavujú o niekoľko týždňov skôr, ešte pred rozvinutím plnohodnotnej imunitnej odpovede organizmu.
Povrchový antigén HCVcoreAg vírusu hepatitídy C je hlavným markerom infekcie vírusom hepatitídy C. Zisťuje sa 16 týždňov pred objavením sa protilátok v krvi v dôsledku imunitnej odpovede organizmu a pred rozvojom klinických príznakov, pričom sa zaznamenáva v akútnej aj chronickej fáze ochorení. Existuje len jeden zahraničný komerčný produkt („Ortho Clinical Diagnostics“) na ELISA diagnostiku hepatitídy C počas akútnej fázy na základe detekcie HCVcoreAg.
Štrukturálny proteín HCVcoreAg pozostávajúci zo 121 aminokyselinových zvyškov sa nachádza na N-konci polypeptidu a vzniká pod vplyvom bunkových proteáz. Prvá proteolytická hydrolýza nastáva medzi zvyškami 191 a 192 (miesto C1) a vedie k vytvoreniu E1 glykoproteínu. Druhé miesto štiepenia (C2) je medzi aminokyselinami 174 a 191. Zodpovedajúce produkty štiepenia sú označené ako p21 a p23. Analýza expresie v mnohých cicavčích bunkách ukázala, že p21 je hlavným produktom, zatiaľ čo p23 sa nachádza v malých množstvách. Je možné, že štiepenie na miestach C1 a C2 je vzájomne súvisiaci proces, pretože p21 sa tvorí za podmienok, keď nie je pozorovaná hydrolýza na G2 [D45]. HCVcoreAg je hlavný proteín viažuci RNA, ktorý zrejme tvorí vírusový nukleokapsid. Biochemické vlastnosti tohto proteínu sú stále nedostatočne charakterizované. AFM štúdie častíc vírusu hepatitídy C umožnili získať obraz HCV kapsidy.
ASM čipy
V experimentálnej časti práce boli použité dva typy AFM čipov. Prvý typ bol použitý na MS identifikáciu modelových proteínov na povrchu AFM čipov. Išlo o substráty s funkčne aktívnymi chemickými skupinami (ďalej len AFM čipy s chemicky aktivovaným povrchom), na ktorých boli študované molekuly zachytené a nevratne imobilizované vďaka kovalentným väzbám, tzv. postup „chemical fishing“. Druhý typ AFM čipov bol použitý na MS identifikáciu na ich povrchu proteínov biošpecificky izolovaných z roztoku analytu. Biologické sondy boli predtým imobilizované na povrchu týchto čipov - v pracovných priestoroch. Ako biologické sondy boli použité monoklonálne protilátky proti markerovým proteínom vírusovej hepatitídy B a C (BFB a BFC) alebo aptamerr proti proteínu gpl20 a trombínu. Pre biošpecifické rybárske postupy sa inkubovali čipy s kovalentne imobilizovanými molekulami sondy. v % roztoku analytu obsahujúceho iba detegovateľný proteín alebo vzorky krvného séra
Na splnenie úlohy MS identifikácie modelových proteínov kovalentne imobilizovaných na povrchu AFM čipov prvého typu boli v práci použité: avidín (Agilent, USA), HSA (Agilent, USA), P450 VMZ (láskavo poskytnuté od profesora A.V. Munra, University of Manchester, UK), trombín (Sigma, USA), a-FP a anti-a-FP (USBio, USA); Na splnenie úlohy MS identifikácie proteínov na povrchu AFM čipov druhého typu, biošpecificky izolovaných z roztoku analytu, boli ako molekuly sondy použité monoklonálne protilátky (MAB): anti-HCVcore (Virogen, USA), anti-HBVcore (Výskumný ústav molekulárnej diagnostiky, Moskva), anti-HBsAg (Aldevron, USA), ako cieľové molekuly: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, USA) a HBsAg (Aldevron, USA), gpl20 (Sigma, USA), troponín (USBio, USA).
Okrem toho boli v práci použité tieto látky: acetonitril, izopropanol, kyselina mravčia, destilovaná voda (Merck, USA), kyselina trifluóroctová (TFA), hydrogénuhličitan amónny (Sigma, USA), kyselina a-kyano-4-hydroxyškoricová ( HCCA), kyselina dihydroxybenzoová (DHB) (Bruker Daltonics, Nemecko), trypsín (Promega, USA).
Vzorky krvného séra pre štúdiu AFM poskytlo oddelenie infekčných chorôb u detí Ruskej štátnej lekárskej univerzity, Centrálny výskumný ústav epidemiológie Rospotrebnadzor, MNIIEM "n. Gabrichevsky: Prítomnosť častíc vírusu hepatitídy C (HCV) v krvnom sére vzoriek bola potvrdená metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) pomocou testovacieho systému „Amplisens HCV Monitor“ (Ústredný výskumný ústav epidemiológie Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie, Moskva).
AFM analýza sa uskutočnila v Laboratóriu nanobiotechnológie, IBMC RAMS. Výpočet proteínov a komplexov antigén/protilátka na povrchu čipu AFM sa uskutočnil na základe korelácie výšok zodpovedajúcich obrazov proteínov a ich komplexov, meraných pomocou AFM, podľa metódy opísanej v . Používala ho ACM NTEGRA (NT-MDT, Rusko). Merania AFM sa uskutočňovali v polokontaktnom režime. Ako sondy boli použité konzoly série NSG10 od NT-MDT. Typický polomer zakrivenia ihiel bol 10 nm a rezonančná frekvencia sa pohybovala od 190 do 325 kHz. Čipová skenovacia plocha bola 400 um2. Každé meranie sa uskutočnilo najmenej 3 krát.
Imobilizácia proteínov a aptamérov na povrchu AFM čipu sa uskutočnila podľa nasledujúceho postupu.
K proteínovému roztoku (0,1 uM) s objemom 2 ul sa pridalo 8 ul roztoku zmesi NHS/EDC (v/v=l/l) a dôkladne sa premiešalo. Výsledná zmes sa naniesla na povrch silanizovaného čipu a inkubovala sa 2 minúty pri teplote miestnosti. Čip sa potom dvakrát premyl v termotrepačke s 1 ml deionizovanej vody pri 800 otáčkach za minútu a 37 °C. Kvalita imobilizácie proteínu na povrchu AFM čipu bola sledovaná mikroskopiou atómovej sily.
Imobilizácia aptamérov na chemicky aktivovanom povrchu AEM čipu sa uskutočnila nasledovne. K zásobnému roztoku DSP s koncentráciou 1,2 mM v DMSO/etanol (obj./obj. = 1/1)4 bol pridaný roztok PBS pufra 50 mM (pH 7,4) tiež v objemovom pomere 1/1. Takto získaný pracovný roztok sa naniesol na povrch AFM čipu a inkuboval sa 10 minút. Potom sa uskutočnilo premývanie 50 % roztokom etanolu vo vode s objemom 1 ml pri 15 °C počas 10 minút. Na aktivovanú zónu AFM čipu sa aplikoval roztok aptaméru s koncentráciou 3 JIM a inkuboval sa 4 minúty za miešania pri rýchlosti 800 ot./min. Blokovanie nezreagovaných aminoskupín DSP sieťovacieho činidla sa uskutočňovalo v prítomnosti 5 mM roztoku Tris-HCl počas 10 minút pri 37 ° C. Konečný krok premývania sa uskutočnil dvakrát vodný roztok objem 1 ml počas 10 minút pri 25 °C.
Trypsinolytická zmes obsahujúca tlmivý roztok 150 mM NH4HC03, acetonitril, 0,5 M guanidín hydrochlorid a glycerol (pH 7,4) sa naniesla na povrch AFM čipu s imobilizovanými molekulami sondy. Potom sa do tlmivého roztoku pridalo 0,5 μl modifikovaného roztoku prasačieho trypsínu s koncentráciou 0,1 μM. Čip AFM sa inkuboval vo vlhkom prostredí počas 2 hodín pri konštantnej teplote 45 °C, na jeho povrch sa opäť pridalo 0,5 ul roztoku trypsínu (0,1 uM) a inkubácia pokračovala ďalších 12 hodín. Trypsinolytická zmes sa zmyla z povrchu AFM čipu 10 ul elučného roztoku obsahujúceho 70 % acetonitrilu v 0,7 % kyseline trifluóroctovej (TFA). Takto získaný hydrolyzát z povrchu čipu AFM sa vysušil vo vákuovej odparke pri 45 °C a 4200 ot./min. Ďalej sa zmes peptidov rozpustila v 10 ul 5 % roztoku kyseliny mravčej alebo v 10 ul 0,7 % roztoku TFA na následnú MS analýzu.
Počas MS analýzy s ionizáciou typu MALDI boli vzorky pripravené nasledovne. Vzorky rozpustené v 0,7 % roztoku TFA s objemom 10 ul sa zahustili a odsolili pomocou mikrošpičiek ZipTip C18 (Millipore, USA) podľa protokolu výrobcu a zmiešali sa s nasýteným roztokom matrice obsahujúcej HCCA alebo DHB v 50 % roztoku acetonitrilu s 0,7 % TFA. Výsledná zmes sa aplikovala na MALDI cieľ veľkosti MTP.
-identifikácia proteínov zachytených „chemickým rybolovom“ na povrchu čipu AFM z roztoku analytu
Zapnuté tejto fáze experimentálna práca MS spektrá boli získané pre modelové proteíny chemicky imobilizované na povrchu AFM čipov z roztoku analytu. Rozsah koncentrácií študovaných proteínov v roztoku analytu pre avidín, HSA, anti-aFP bol 10"-10"9 M, troponín, aFP a P450 VMZ - 10"6-10"8 M.
MS analýza bola vykonaná pre 6 typov proteínov, ktoré sa líšia pôvodom, molekulovou hmotnosťou, počtom miest trypsinolýzy a ich priestorovou dostupnosťou, stupňom hydrofóbnosti sekvencie aminokyselín (pomer hydrofóbnych aminokyselín k hydrofilným), ktoré boli kovalentne imobilizované na povrchu AFM čipu z roztoku analytu (tabuľka 1). V týchto experimentoch boli použité čipy AFM, ktoré obsahovali pracovnú a kontrolnú zónu. Pracovná zóna bola chemicky aktivovaná oblasť povrchu čipu AFM, na ktorej boli „chemicky vylovené“ modelové proteíny; kontrolná zóna bola chemicky neaktívna oblasť povrchu čipu. Počet vizualizovaných zachytených molekúl sa zaznamenal pomocou AFM. Experimentálne údaje analýzy AFM získané pre vyššie uvedené modelové proteíny, konkrétne počet molekúl zachytených na povrchu pracovnej oblasti čipu AFM, sú uvedené v tabuľke 2. proteín v roztoku analytu.
Ako je možné vidieť z tabuľky 2, počet molekúl registrovaných v pracovnej oblasti čipu AFM pre všetky prezentované proteíny bol -1040 molekúl. Hranica citlivosti MS detektorov je asi 105 molekúl. Pre prezentované modelové proteíny sa teda uskutočnila úspešná ireverzibilná imobilizácia na povrchu AFM čipu a počet AFM-registrovaných proteínových objektov bol dostatočný na následnú MS identifikáciu. Súčasne bola minimálna zaznamenaná koncentrácia modelových proteínov v inkubačnom roztoku pomerne nízka, 10 "-10" M.
Hmotnostná spektrometrická analýza vzoriek bola uskutočnená s použitím typov ionizácie MALDI a ESI. AFM čip po inkubácii vo vhodnom roztoku avidínu s koncentráciou 10"9 M. Analýza týchto spektier umožnila spoľahlivo identifikovať avidín (Gallus Gallus) podľa jeho dvoch proteotypických peptidov: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) a VGINIFTR (m/z= 460,4). Oba peptidy mali dobre definované píky svojich dvojnásobne nabitých iónov (MS-spektrá).Pomocou AFM-MS analýzy chemicky aktivovanej pracovnej zóny AFM-čipu po inkubácii v roztoku analytu proteínu s koncentráciou 10"8 M bol detegovaný ďalší malý proteín - troponín I. MS a MS/MS spektrá zodpovedajúce peptidu s dvojitým nábojom 1449 Da sú znázornené na obrázku 3. MS analýza experimentálne získaných spektier umožnila možné spoľahlivo identifikovať a identifikovať ľudský troponín (gi 2460249) na povrchu AFM čipu s pravdepodobnosťou vyššou ako 95 % .
Obrázok 5 ukazuje spektrá tandemovej fragmentácie globulárneho proteínu, ľudského sérového albumínu (HSA), ktorý vykonáva transportné funkcie v krvnej plazme. Spektrá boli získané z chemicky aktivovanej pracovnej zóny AFM čipu po inkubácii vo vhodnom roztoku albumínu s koncentráciou 10"9 M. Analýza týchto spektier umožnila spoľahlivo identifikovať ľudský albumín podľa jeho dvoch proteotypických peptidov: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756,5) a YLYEIAR (m/z=464,3) Oba peptidy mali dobre definované píky svojich dvojito nabitých iónov (MS spektrá).
MS/MS spektrá trypsinizovaných predmetov z chemicky aktivovaného povrchu AFM čipu inkubovaného v roztoku ľudského sérového albumínu (C=109 M). Peptid VPQVSTPTLVEVSR s m/z = 756,5 (A), peptid YLYEIAR s m/z = 464,3 (B). Experimentálne podmienky: merania sa uskutočňovali na hmotnostnom spektrometri LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent).
Analýza MS teda umožnila identifikovať proteíny detegované pomocou AFM. Na základe získaných údajov bol odhalený vzťah medzi počtom identifikovaných proteotypických peptidov na povrchu AFM čipu a obsahom požadovaného proteínu v roztoku analytu. Takáto závislosť, napríklad pre proteíny P450 VMZ a HSA kovalentne imobilizované na chemicky aktivovanom povrchu čipu AFM, je znázornená na obrázku 6. Ako je možné vidieť na obrázku 6, čím vyššia je koncentrácia proteínu v roztoku analytu ( -KG6 M), tým väčší počet peptidov je možné spoľahlivo identifikovať v prípade MALDI-MS aj ESI-MS analýzy. Významné rozdiely medzi počtom identifikovaných peptidov v koncentračnom rozsahu 10"6-10"9M medzi analyzovanými proteínmi v roztoku analytu neboli pozorované.
Závislosti počtu identifikovaných peptidov molekúl analytu od koncentrácie proteínu v inkubačnom roztoku. (A) - analýza zmesi peptidov modelových proteínov HSA, VMZ na hmotnostných spektrometroch s ionizáciou typu MALDI Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Nemecko) a Autoflex III (Bruker Daltonics, Nemecko); (B) - analýza zmesi peptidov modelových proteínov HSA, VMZ na hmotnostnom spektrometri s ionizáciou typu ESI LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent, USA).
Získané výsledky umožnili konštatovať, že AFM-MS (MALDI a ESI) umožňuje detekovať a identifikovať proteínové molekuly kovalentne extrahované z roztoku analytu na povrchu čipu AFM, ktoré sa líšia svojimi fyzikálno-chemickými vlastnosťami.
Zároveň v kontrolnej zóne čipu AFM (neaktivovaného) po jeho inkubácii v roztoku analytu metóda AFM nezistila na povrchu čipu prítomnosť predmetov zodpovedajúcich výške proteínovým molekulám. MS analýza tiež neodhalila objekty proteínovej povahy. Experimentálne sa teda dokázalo, že AFM adekvátne registruje požadované objekty – proteínové molekuly analytu.
Ďalšou etapou tejto práce bol vývoj kombinovanej schémy AFM-MS na identifikáciu proteínov získaných z roztoku za. prostredníctvom biošpecifických interakcií.
Schéma hmotnostnej spektrometrickej analýzy v prípade biošpecifického AFM lovu proteínov z roztoku je znázornená na obrázku 7. Podľa vyššie uvedenej schémy boli molekuly sondy najskôr imobilizované na povrchu pracovnej plochy čipov AFM, ktoré boli monoklonálne1 protilátky proti proteínovým markerom vírusovej hepatitídy B a C alebo aptaméry proti proteínom HIV-1 glykoproteínu gpl20 a trombínu, pričom povrch kontrolnej zóny neobsahoval imobilizované molekuly sondy. Kontrola kvality imobilizácie molekúl sondy sa uskutočnila pomocou AGM vizualizácie. Potom sa takýto čip inkuboval v roztoku analytu obsahujúcom skúmaný proteín. Po fáze vymývania nešpecificky adsorbovaných molekúl na povrchu čipu a fáze prípravy vzorky na následnú hmotnostnú spektrometrickú analýzu na povrchu čipu AFM sa uskutočnila MS analýza proteínov detegovaných AFM.
Experimentálna časť tejto časti zahŕňala dve fázy analýzy. V prvej fáze bolo potrebné vykonať MS identifikáciu molekúl proteínovej sondy kovalentne imobilizovaných na AFM čipe a v druhej fáze cieľové proteíny zachytené na zodpovedajúcich partnerských molekulách z roztoku alebo zo vzoriek krvného séra v dôsledku biošpecifickosti interakcie. Na tento účel sa uskutočnila MS analýza MCA kovalentne imobilizovanej na povrchu AFM čipov proti HCV a HBV markerovým proteínom: anti-HCVcore a anti-HBVcore. Pre mAb proti anti-HCV a anti-HBV jadrovým proteínom boli v tejto práci po prvýkrát získané spektrá tandemovej fragmentácie a spektrá peptidovej mapy.
vysoká skladovacia kapacita, ktorá zaručuje ich aktívny biologický princíp.
LITERATÚRA
1. Klychkova G.Yu. Vývoj technológie pre komplexný prípravok z chrupavkového tkaniva chobotnice, lososa a jesetera // Materials of Vseros. Internetová konf. mladých vedcov. - Vladivostok: TIN-RO-Center, 2004. - S. 164-170.
2. Metzler D. Biochemistry. T. 2. - M., 1980. - 605 s.
3. Suchoverkhova G.Yu. Biochemická charakteristika chrupavkového tkaniva hydrobiontov a technológia potravinových doplnkov: Dis. ... cukrík. tech. vedy. - Vladivostok, 2006. - 157 s.
4. Sytová M.V. Vedecké zdôvodnenie komplexného spracovania jesetera amurského: Abstrakt práce. dis. ... cukrík. tech. vedy
M.: VNIRO, 2005. - 24 s.
Katedra biotechnológie potravín
Prijaté 07.02.07
IDENTIFIKÁCIA PROTEÍNOVÝCH KOMPONENTOV KERATINENZYMATICKÉHO HYDROLYZÁTU
Ch.Yu. ŠAMCHANOV, L.V. ANTIPOVA
Štátny ropný inštitút Groznyj Voronežská Štátna technologická akadémia
Jedným z najefektívnejších spôsobov spracovania druhotných zdrojov mäsového a hydinového priemyslu je využitie moderných biotechnologických metód na získanie hydrolyzátov potravín. Funkčné a technologické vlastnosti získaných produktov závisia od biochemického zloženia a molekulovej hmotnosti jeho proteínových zložiek.
Pri použití fyzikálno-chemických metód na stanovenie molekulovej hmotnosti bielkovín závisí výsledok nielen od hmotnosti, ale aj od elektrického náboja a tvaru molekuly proteínu, najmä pri zmene rýchlosti difúzie bielkovín, rýchlosti sedimentácie v gravitačnom lúka. V tomto ohľade je pri určovaní molekulových hmotností proteínov výhodné použiť štatistické metódy keď je proteínový roztok v rovnováhe, napríklad keď prechádza cez kolónu naplnenú gélom.
Cieľom práce je určiť molekulovú hmotnosť M proteínových zložiek keratínového enzymatického hydrolyzátu a jeho biochemické zloženie.
Na stanovenie molekulovej hmotnosti proteínových zložiek keratínového hydrolyzátu bola použitá metóda gélovej filtrácie. Použil sa Sephadex v-100 (médium, priemer častíc 40-120 um) s frakcionačnými limitmi 4000-150000 Da.
Kolóna 46,0 x 1,9 cm bola naplnená Sephadexom ošetreným 0,02 M univerzálnym pufrom, pH 7,0. Aplikovalo sa naň 1,5 cm3 roztoku -7 mg/cm3 hydrolyzátu keratínu a eluovalo sa rovnakým univerzálnym pufrom rýchlosťou 12 cm3/h. Frakcie s objemom 3 cm3 sa odobrali a potom sa v nich spektrofotometricky stanovil obsah proteínu na SF-46 pri 280 nm. Na stanovenie molekulovej hmotnosti frakcií keratínového hydrolyzátu bola kolóna so Sephadexom predkalibrovaná za rovnakých podmienok s použitím niekoľkých čistých (markerových) proteínov so známym M. Kalibračná krivka bola zostavená pomocou lineárneho vzťahu medzi ^ M a objemom
eluát Ye, uvoľnený z kolóny. V tabuľke. 1 ukazuje niektoré fyzikálno-chemické charakteristiky markerových proteínov.
stôl 1
Markerový proteín M, Áno 1§ m V, cm3
lyzozým 13930 4,143 54
Trypsín 25700 4,409 48
Peroxidáza 34000 4,531 45
Hovädzí albumín 68000 4,832 36
Modrý dextrán 2000000 6,301 21
Vo vode rozpustná frakcia
keropeptid<10000 2,845 72
Vo vode rozpustná frakcia keratínového hydrolyzátu opúšťa kolónu v oveľa menšom objeme ako markerový proteínový lyzozým s najnižšou molekulovou hmotnosťou. Preto v keratínovom hydrolyzáte (keropeptide) nie sú žiadne proteínové frakcie s M > 13930 Da. Približná hmotnosť produktov hydrolýzy je pod 10 000 Da, stanovená gélovou filtráciou na markerových proteínoch Sephadex B-100. Lineárna závislosť medzi ^ M proteínov a objemom eluátu Ye, uvoľneného z kolóny, je znázornený na obr. 1 (1 - modrý dextrán; 2 - hovädzí albumín; 3 - peroxidáza; 4 - trypsín; 5 - lyzozým; 6 - vo vode rozpustná frakcia keropeptidu).
Vzhľadom na neprítomnosť markerových proteínov v študovanom rozsahu 10 000 – 5 000 Da sa hľadanie vo vode rozpustnej proteínovej frakcie uskutočnilo pomocou poréznej
tabuľka 2
M, Áno Rozpustný proteín a peptidy, mg/cm3 Celkové peptidy a aminokyseliny, µg/cm3 Tyrozín, µmol/cm3 Redukujúce látky, µg/cm3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% východiskovej hodnoty 74,6 71,9 76,1 80,7
membrány tried UPM-100 a UAM-50 na laboratórnej ultrafiltračnej jednotke (CJSC NPO Tekhkon). Schéma zahŕňala samotnú inštaláciu s 5% roztokom keropeptidu umiestneným na magnetickom miešadle pre jeho neustále miešanie. Pre účinnú separáciu proteínového roztoku bol do hornej časti aparatúry pod tlakom privádzaný stlačený vzduch.Produkty hydrolýzy prechádzali cez porézne membrány, striedavo vymieňané v závislosti od požadovanej molekulovej hmotnosti ultrafiltrátu, do spodnej časti aparatúry a zhromaždené v prijímacej nádobe. Vo výsledných ultrafiltrátoch sa stanovilo množstvo biochemických parametrov, ktoré umožnili vyhodnotiť distribúciu produktov hydrolýzy podľa molekulovej hmotnosti (tab. 2).
Keropeptid obsahuje proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou s M 5000-10000 Da. Ich hmotnostný zlomok sa odhaduje ako rozdiel v odčítaní pre frakcie 0-10000 a 0-5000 Da a je 1,43 mg/cm3. Táto frakcia tiež poskytla pozitívnu reakciu na ninhydrínovú reakciu (2059 µg/cm3), tyrozín (1,875 µmol/cm3) a redukujúce látky (543 µg/cm3). Hlavný podiel produktov hydrolýzy sa však koncentruje vo frakcii s nižšou molekulovou hmotnosťou s М< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
Ďalšie stanovenie molekulovej hmotnosti vo vode rozpustných proteínových frakcií keropeptidu sa uskutočnilo na Sephadexe B-25 (priemer, priemer častíc 50-150 μm), čo umožňuje nastavenie v rozsahu frakcionácie 1000-5000 Da. Podmienky gélovej filtrácie zostali nezmenené. Autor:
Výsledky stanovenia proteínov vo frakciách sa použili na zostavenie elučného profilu. Vo všetkých frakciách bol okrem bielkovín stanovený ninhydrínovou metódou aj obsah nízkomolekulových látok, tyrozínu, redukujúcich látok (RS) a bola stanovená aj kvantitatívna distribúcia proteínových frakcií. Na obr. Obrázok 2 ukazuje gélový chromatogram enzymatického hydrolyzátu keratínu cez Sephadex B-25 (krivka 1 - proteín; 2 - ninhydrínový test; 3 - tyrozín; 4 - PB).
V tomto prípade je proteín detegovaný vo forme dvoch malých píkov takmer v prvých frakciách. Hmotnostný podiel bielkovín vo frakciách č. 1-8 od 3-24 cm3
má pomerne vysoké hodnoty a dosahuje 0,12-0,18 mg/cm3 (krivka 1).
Prevažná časť produktu vyšla z kolóny ako maximálny proteínový pík s objemom 27 cm3 eluátu (frakcia č. 9, každá po 3 cm3 eluátu). Hmotnostný podiel bielkovín v tejto frakcii bol zaznamenaný na úrovni 0,66 mg/cm3, čo je 3-4 krát viac ako v ostatných študovaných frakciách.
Ďalšia elúcia keropeptidu v objemovom rozsahu 36-96 cm3 odhalila tri vrcholy so znížením hmotnostného podielu proteínu v nich nie viac ako 0,08 mg/cm3. Kompletný roztok keropeptidu sa eluuje v konečnom objeme 96 cm3.
Vo frakcii č.9 sa našlo celé množstvo dostupného RS, hmotnostné frakcie 66 μg/cm3 (krivka 4). Ninhydrínová reakcia sa použila v gélovej chromatografii na identifikáciu distribúcie produktov hydrolýzy podľa molekulovej hmotnosti. Zistilo sa, že keď nadbytočné množstvo ninhydrínu a proteínových produktov interaguje s voľnou MH2 skupinou a v závislosti od počtu týchto skupín, je možné lokalizovať proteín
RV, μg/cm3 175 co D 5 o l s; 0,7 0
100 125 X - 3 ko o o. 0,5
80 § 100 2 _ n 0.4
60 1 isin, 7 sl 0,3
40 1 l 5 o - (P 2 o I- 0,2
20 25 _ 2 ai O 0,1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, cm
deriváty elúciou cez Sephadex. Nízka hmotnostná frakcia ninhydrínu (4–6 µg/cm3) teda veľmi presne odráža množstvo voľných aminoskupín a určuje prítomnosť peptidov s vysokou molekulovou hmotnosťou s M 3000–5000 Da vo frakciách J# 1–8 (krivka 2) . Je známe, že v rozsahu merania molekulovej hmotnosti produktov hydrolýzy< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Áno. Ďalšia analýza elučného profilu pre vzorku ninhydrínu (frakcie č. 12-36) odhalila vrchol, ktorý nezodpovedal jeho proteínovej koncentrácii, ako bolo pozorované pre peptidy v predchádzajúcich frakciách. Hmotnostný podiel nízkomolekulárnych látok vo frakcii č. 23 bol 157 µg/cm3, čo je viac ako 2-krát viac ako u peptidov vo frakcii č. 9. prítomnosť produktov hydrolýzy vo forme voľných aminokyselín v posledný zlomok. Príslušnosť k nemu a aminokyselina tyrozín (0,06 µmol/cm3) je ďalším dôkazom uvedenej polohy.
Gélová filtrácia keratínového hydrolyzátu cez Sephadex G-100 a G-25 teda indikuje prítomnosť nízkomolekulárnej rozpustenej látky v ňom.
môj proteín (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Áno. V tomto prípade proteínové reťazce obsahujú 5-20 aminokyselinových zvyškov. Je dôležité zdôrazniť, že frakcia č. 9 súčasne dáva reakcie na biuretovú väzbu, ninhydrín, tyrozín a RV. Táto charakteristika naznačuje prítomnosť sacharidov v keratínovom proteíne a ich priame spojenie s proteínom ako súčasť jedného komplexu.
LITERATÚRA
1. Antipova L.V., Pashchenko L.P., Shamkhanov Ch.Yu., Kurilova E.S. Získavanie a charakterizácia potravinárskeho keratínového hydrolyzátu // Skladovanie a spracovanie poľnohospodárskych surovín. - 2003. - Č. 7.
2. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S., Pozhalova N.A. Biochemické charakteristiky procesu enzymatickej hydrolýzy surovín obsahujúcich keratín v hydinárskom priemysle Izv. univerzity. Technológia potravín. - 2003. - č.5-6.
3. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S. Co -
zlepšenie technológie výroby keropeptidu zo surovín z peria // Mäsový priemysel. - 2004. - č. 3. - S. 44-47.
4. Rogov I.A., Antipova L.V., Dunchenko N.I., Zhereb-tsov N.A. Chémia potravín. V 2 knihách. Kniha. 1. Bielkoviny: štruktúra, funkcie, úloha vo výžive. - M.: Kolos, 2000. - 384 s.
5. Osterman L.A. Chromatografia proteínov a nukleových kyselín. - M.: Nauka, 1985. - 536 s.
6. Kochetov G.A. Praktický sprievodca enzymológiou. - 2. vyd., prepracované. a dodatočné - M.: Vyššie. škola, 1980. - 272 s.
Katedra technológie potravín Katedra technológie mäsa a mäsových výrobkov
Prijaté 0S.02.0? G.
TEORETICKÉ ZDÔVODNENIE MECHANIZMU KONZERVAČNÉHO PÔSOBENIA ZLOŽIEK VÝŤAŽKOV Z fajčenia
S.V. ZOLOTOKOPOVÁ, I.A. PALAGINA
Astrachánska štátna technická univerzita Astrachánská pobočka Saratovskej štátnej sociálno-ekonomickej univerzity
Dôležitou oblasťou výskumu posledných rokov je štúdium vplyvu rôznych potravinárskych prídavných látok nielen na chuť a vôňu, ale aj na zvýšenie trvanlivosti potravinárskych výrobkov. Od dávnych čias sa korenené rastliny používali na konzervovanie, stolová soľ, fajčenie atď. Analýza ukazuje, že v súčasnosti je trh dobytý dymovými extraktmi. Medzi obyvateľstvom sú obľúbené najmä potraviny s údenou príchuťou a tradičné údenie stráca svoje pozície na bezdymové.
Environmentálne prospešné a perspektívne sú extrakty získané za šetrných podmienok.
G.I. už desaťročia pracuje na zlepšovaní technológie extrakcie. Kasyanov - ctený pracovník vedy a techniky Ruskej federácie, ctený vynálezca Ruskej federácie, doktor technických vied, profesor, vedúci katedry technológie mäsa a rybích výrobkov štátu Kuban technologická univerzita. Vedecko-pedagogická škola „Teória a prax spracovania surovín rastlinného a živočíšneho pôvodu skvapalnenými a stlačenými plynmi“ pôsobiaca pri KubGTU a Krasnodarský výskumný ústav skladovania a spracovania poľnohospodárskych produktov pod jeho vedením sa zaoberá problémami zvyšovania tzv. efektívnosť spracovania rôznych surovín, ktoré umožňujú zlepšiť kvalitu produktov, skrátiť časy spracovania a zároveň znížiť náklady na energiu.
vysolenie: zrážanie so soľami alkalických kovov, kovov alkalických zemín (chlorid sodný, síran horečnatý), síran amónny; zároveň nie je narušená primárna štruktúra proteínu;
zrážok: použitie odvodňovacích prostriedkov: alkohol alebo acetón pri nízkych teplotách (asi -20°C).
Pri použití týchto metód strácajú proteíny svoj hydratačný obal a zrážajú sa v roztoku.
Denaturácia- porušenie priestorovej štruktúry bielkovín (primárna štruktúra molekuly je zachovaná). Môže byť reverzibilná (po odstránení denaturačného činidla sa obnoví bielkovinová štruktúra) alebo ireverzibilná (neobnoví sa priestorová štruktúra molekuly napr. pri vyzrážaní bielkovín koncentrovanými minerálnymi kyselinami, soľami ťažkých kovov).
Metódy separácie bielkovín Separácia bielkovín od nečistôt s nízkou molekulovou hmotnosťou
Dialýza
Používa sa špeciálna polymérová membrána, ktorá má póry určitej veľkosti. Malé molekuly (nečistoty s nízkou molekulovou hmotnosťou) prechádzajú cez póry v membráne, zatiaľ čo veľké molekuly (proteíny) sú zadržané. Bielkoviny sa teda vymyjú od nečistôt.
Separácia proteínov podľa molekulovej hmotnosti
Gélová chromatografia
Chromatografická kolóna je naplnená gélovým granulátom (Sephadex), ktorý má póry určitej veľkosti. Do kolóny sa pridá zmes proteínov. Proteíny, ktorých veľkosť je menšia ako veľkosť pórov Sephadexu, sú zadržané v stĺpci, pretože sa „zaseknú“ v póroch a zvyšok voľne opúšťa stĺpec (obr. 2.1). Veľkosť proteínu závisí od jeho molekulovej hmotnosti.
Ryža. 2.1. Separácia proteínov gélovou filtráciou
Ultracentrifugácia
Táto metóda je založená na rôznych rýchlostiach sedimentácie (precipitácie) molekúl proteínov v roztokoch s rôznym gradientom hustoty (sacharózový pufor alebo chlorid cézny) (obr. 2.2).
Ryža. 2.2. Separácia proteínov ultracentrifugáciou
elektroforéza
Táto metóda je založená na rôznych rýchlostiach migrácie proteínov a peptidov v elektrickom poli v závislosti od náboja.
Ako nosiče pre elektroforézu môžu slúžiť gély, acetát celulózy, agar. Molekuly, ktoré sa majú oddeliť, sa pohybujú v géli v závislosti od ich veľkosti: tie, ktoré sú väčšie, budú pri prechode cez póry gélu zadržané. Menšie molekuly budú čeliť menšiemu odporu, a preto sa budú pohybovať rýchlejšie. Výsledkom je, že po elektroforéze budú väčšie molekuly bližšie k štartu ako menšie (obr. 2.3).
Ryža. 2.3. Separácia proteínov gélovou elektroforézou
Proteíny môžu byť tiež oddelené elektroforézou podľa molekulovej hmotnosti. Na toto použitie elektroforéza v PAAG v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-Na).
Izolácia jednotlivých proteínov
Afinitná chromatografia
Metóda je založená na schopnosti proteínov silne sa viazať na rôzne molekuly nekovalentnými väzbami. Používa sa na izoláciu a čistenie enzýmov, imunoglobulínov, receptorových proteínov.
Molekuly látok (ligandy), s ktorými sa špecificky viažu určité proteíny, sú kovalentne spojené s časticami inertnej látky. Do kolóny sa pridá zmes proteínov a požadovaný proteín sa pevne pripojí k ligandu. Zvyšné proteíny voľne opúšťajú kolónu. Zadržaný proteín môže byť potom z kolóny vymytý pufrom obsahujúcim voľný ligand. Táto vysoko citlivá metóda umožňuje izolovať veľmi malé množstvá čistého proteínu z bunkového extraktu obsahujúceho stovky iných proteínov.
Izoelektrické zaostrovanie
Metóda je založená na rôznych hodnotách IEP bielkovín. Proteíny sa oddeľujú elektroforézou na platni s amfolínom (ide o látku, ktorá má vopred vytvorený gradient pH v rozmedzí od 3 do 10). Počas elektroforézy sa proteíny separujú podľa hodnoty ich IEP (v IEP bude náboj proteínu nulový a nebude sa pohybovať v elektrickom poli).
2D elektroforéza
Ide o kombináciu izoelektrickej fokusácie a elektroforézy s SDS-Na. Najprv sa uskutoční elektroforéza v horizontálnom smere na platni s amfolínom. Proteíny sa oddeľujú v závislosti od náboja (CEP). Potom sa platňa ošetrí roztokom SDS-Na a uskutoční sa elektroforéza vo vertikálnom smere. Proteíny sú klasifikované na základe molekulovej hmotnosti.
Imunoelektroforéza (Western blot)
Analytická metóda používaná na stanovenie špecifických proteínov vo vzorke (obrázok 2.4).
Izolácia proteínov z biologického materiálu.
Separácia proteínov podľa molekulovej hmotnosti elektroforézou v PAAG s SDS-Na.
Prenos proteínov z gélu na polymérnu platňu za účelom uľahčenia ďalšej práce.
Ošetrenie platne nešpecifickým proteínovým roztokom na vyplnenie zostávajúcich pórov.
Po tejto fáze sa teda získala platňa, ktorej póry obsahujú oddelené proteíny a priestor medzi nimi je vyplnený nešpecifickým proteínom. Teraz musíme zistiť, či medzi proteínmi, ktoré hľadáme, nie je zodpovedný za nejaký druh choroby. Na detekciu sa používa liečba protilátkami. Pod primárnymi protilátkami rozumieme protilátky proti požadovanému proteínu. Sekundárnymi protilátkami sa rozumejú protilátky k primárnym protilátkam. K zloženiu sekundárnych protilátok sa pridáva dodatočná špeciálna značka (takzvaná molekulárna sonda), aby bolo možné neskôr vizualizovať výsledky. Ako značka sa používa rádioaktívny fosfát alebo enzým pevne naviazaný na sekundárnu protilátku. Väzba najprv na primárne a potom na sekundárne protilátky má dva ciele: štandardizovať metódu a zlepšiť výsledky.
Spracovanie roztokom primárnych protilátok väzba nastáva v mieste platničky, kde je antigén (žiadaný proteín).
Odstránenie nenaviazaných protilátok (premývanie).
Liečba roztokom značených sekundárnych protilátok pre následný vývoj.
Odstránenie nenaviazaných sekundárnych protilátok (premývanie).
Ryža. 2.4. Imunoelektroforéza (Western blot)
V prípade prítomnosti požadovaného proteínu v biologickom materiáli sa na platni objaví pás, ktorý indikuje väzbu tohto proteínu na zodpovedajúce protilátky.
Najcharakteristickejšie fyzikálno-chemické vlastnosti bielkovín sú: vysoká viskozita roztokov, mierna difúzia, schopnosť napučať v širokom rozsahu, optická aktivita, pohyblivosť v elektrickom poli, nízky osmotický tlak a vysoký onkotický tlak, schopnosť absorbovať UV lúče pri 280 nm (táto posledná vlastnosť sa v dôsledku prítomnosti aromatických aminokyselín v proteínoch používa na kvantifikáciu proteínov).
Proteíny, podobne ako aminokyseliny, sú amfotérne v dôsledku prítomnosti voľných skupín NH2 a COOH a vyznačujú sa všetkými vlastnosťami kyselín a zásad.
Proteíny majú výrazné hydrofilné vlastnosti. Ich roztoky majú veľmi nízky osmotický tlak, vysokú viskozitu a malú difuzivitu. Proteíny sú schopné vo veľkej miere napučať.
Rad je spojený s koloidným stavom proteínov. charakteristické vlastnosti, najmä fenomén rozptylu svetla, ktorý je základom kvantitatívneho stanovenia proteínov nefelometriou. Tento efekt sa využíva aj v moderné metódy, mikroskopia biologických objektov. Molekuly bielkovín nie sú schopné prechádzať cez polopriepustné umelé membrány (celofán, pergamen, kolódium), ako aj biomembrány rastlinných a živočíšnych tkanív, aj keď s organickými léziami, ako sú obličky, puzdro obličkového glomerulu (Shumlyansky-Bowman ) sa stáva priepustným pre albumíny krvného séra a objavujú sa v moči.
Denaturácia proteínov Pod vplyvom rôznych fyzikálnych a chemických faktorov sa proteíny podrobujú koagulácii a zrážaniu, čím strácajú svoje prirodzené vlastnosti. Denaturácia by sa teda mala chápať ako porušenie všeobecného plánu - jedinečnej štruktúry molekuly natívneho proteínu, čo vedie k strate jej charakteristických vlastností (rozpustnosť, elektroforetická pohyblivosť, biologická aktivita atď.). Väčšina bielkovín denaturuje pri zahrievaní s roztokom nad 50-60°C. Vonkajšie prejavy denaturácie sa redukujú na stratu rozpustnosti najmä v izoelektrickom bode, zvýšenie viskozity proteínových roztokov, zvýšenie množstva voľných funkčných SH-rpypp a zmena charakteru rozptylu röntgenového žiarenia. Najcharakteristickejším znakom denaturácie je prudký pokles alebo úplná strata biologickej aktivity proteínu (katalytická antigénna alebo hormonálna). peptidové väzby samotnej kostry polypeptidového reťazca Súčasne sa rozvinú globule molekúl natívneho proteínu a vznikajú náhodné a neusporiadané štruktúry.
