վերնագիր

2
2

Սպիտակուցների մեկուսացումն ու մաքրումն իրականացվում է փուլերով։

1. Համասեռացում- սա կենսաքիմիական հետազոտության առարկաների մանրակրկիտ մանրացումն է միատարր, այսինքն՝ միատարր վիճակի, այսինքն՝ սպիտակուցները ենթարկվում են մանրակրկիտ քայքայման մինչև բջջային պատի քայքայումը:
Դրանով նրանք օգտագործում են.
Ա)Պատերազմական տիպի դանակների համասեռացուցիչներ;
բ) pestle homogenizers Potter - Elveheim;
V)գնդիկավոր և գլանային ջրաղացներ - ավելի խիտ օբյեկտների համար;
է)այլընտրանքային սառեցման և հալեցման մեթոդը, մինչդեռ բջջային պատի խզումը տեղի է ունենում սառցե բյուրեղների ազդեցության տակ.
ե)«Ազոտային ռումբի» մեթոդը - բարձր ճնշման տակ բջիջները հագեցվում են ազոտով, այնուհետև ճնշումը կտրուկ ազատվում է, արտանետվում է գազային ազոտ, որը, այսպես ասած, պայթում է բջիջը ներսից.
ե)Ուլտրաձայնային, տարբեր մամլիչ մեթոդներ, բջիջների պատերի մարսողություն ֆերմենտներով։ Շատ դեպքերում, միատարրացման ընթացքում ջերմություն է արտազատվում, մինչդեռ շատ սպիտակուցներ կարող են ապաակտիվացվել, ուստի բոլոր պրոցեդուրաներն իրականացվում են սառը սենյակներում t 0 ջերմաստիճանում կամ հումքը սառույցով սառեցնում են: Միևնույն ժամանակ, բջիջների քայքայման ծավալը և ժամանակը, ինչպես նաև գործառնական ճնշումը մանրակրկիտ վերահսկվում են: Իդեալական հոմոգենիզատորն այն է, որը կարող է հետագայում արդյունահանվել:

2. Սպիտակուցի արդյունահանում, այսինքն՝ դրանց տեղափոխումը լուծարված վիճակի. ամենից հաճախ արդյունահանումն իրականացվում է միաժամանակ մանրացման հետ միասին:

Արդյունահանումն իրականացվում է.
Ա)լուծարումը 8-10% աղի լուծույթներում;
բ)օգտագործելով բուֆերային լուծույթներ pH-ով թթվայինից մինչև թեթևակի ալկալային (բորատ, ֆոսֆատ, ցիտրատ, տրիս-բուֆեր. տրիսամինոմեթանի խառնուրդ NH2 - CH3 + HCl;
V)սպիտակուցների նստեցումը օրգանական լուծիչներով (էթանոլ, մեթանոլ, բութանոլ, ացետոն և դրանց համակցությունները), մինչդեռ սպիտակուց-լիպիդային և սպիտակուց-սպիտակուցային բաղադրիչները բաժանվում են, այսինքն՝ HSB-ի ոչնչացում։

3. Սպիտակուցների մաքրում և մասնատում:Արդյունահանումից հետո խառնուրդը բաժանվում կամ մասնատվում է առանձին սպիտակուցների և հետագայում մաքրվում.

ա) աղակալում- սա սպիտակուցների նստեցման գործընթացն է ալկալային չեզոք աղի լուծույթներով և հողալկալային մետաղներ.

աղի դուրսբերման մեխանիզմ– ավելացված անիոնները և կատիոնները ոչնչացնում են սպիտակուցների հիդրատացված սպիտակուցային շերտը, որը սպիտակուցային լուծույթների կայունության գործոններից է: Առավել հաճախ օգտագործվում են Na-ի և ամոնիումի սուլֆատների լուծույթներ։ Շատ սպիտակուցներ տարբերվում են հիդրացիոն շերտի չափսերով և լիցքի մեծությամբ։ Յուրաքանչյուր սպիտակուց ունի աղի արտանետման իր գոտին: Աղի հեռացումից հետո սպիտակուցը պահպանում է իր կենսաբանական ակտիվությունը և ֆիզիկաքիմիական հատկությունները: Կլինիկական պրակտիկայում աղակալման մեթոդն օգտագործվում է գլոբուլինների (50% ամոնիումի սուլֆատի լուծույթի (NH 4) 2SO 4-ի նստվածքի ավելացմամբ) և ալբումինների (100% ամոնիումի սուլֆատի լուծույթի (NH 4) 2SO հավելումով առանձնացնելու համար։ 4 ձևավորվում է նստվածք):

Աղի արտանետումը ազդում է.
1) աղի բնույթը և կոնցենտրացիան.
2) pH միջավայրեր.
3) ջերմաստիճան.

Հիմնական դերը խաղում են իոնների վալենտները։ Հետևաբար, աղի ազդեցությունը գնահատվում է μ լուծույթի իոնային ուժով.

, այսինքն՝ լուծույթի (μ) իոնային ուժը հավասար է յուրաքանչյուր իոնի (C) կոնցենտրացիայի ½-ի և նրա վալենտության քառակուսու (V) արտադրյալին։

Կոն մեթոդը աղակալման մի տեսակ է: Միաժամանակ տեղի են ունենում բաղադրիչների արդյունահանում և տեղումներ։ Հերթականորեն փոխելով ջերմաստիճանը (սովորաբար ցածր t o -0 + 8 o C), լուծույթի և խտացված էթանոլի pH-ը, արյան պլազմայից հաջորդաբար մեկուսացվում են մինչև 18 սպիտակուցային ֆրակցիաներ:

Կոն մեթոդօգտագործվում է դեղագործական արտադրության մեջ արյան փոխարինիչների արտադրության մեջ.
բ) քրոմատոգրաֆիայի մեթոդներ. Ռուս գիտնական Միխայիլ Ցվետը (1903) համարվում է անալիզի քրոմատոգրաֆիկ մեթոդների մշակման հիմնադիրը։ Ներկայումս դրա բազմաթիվ տեսակներ կան։ Մեթոդը հիմնված է նյութերի ունակության վրա՝ հատուկ ներծծվելու սյունակում փակված ներծծող նյութի վրա կամ տեղադրված որևէ կրիչի վրա: Երբ դա տեղի է ունենում, վերլուծված նյութերի բաժանումը և դրանց կոնցենտրացիան խստորեն սահմանված ներծծող շերտում: Այնուհետև սյունակով անցնում են համապատասխան լուծիչներ (լուծիչներ), որոնք թուլացնում են կլանման ուժերը և կլանում ներծծվող նյութերը սյունակից։ Նյութերը հավաքվում են ֆրակցիոն հավաքիչում:

Քրոմատագրության համար հիմնարար է բաշխման հարաբերակցությունը, որը հավասար է նյութի կոնցենտրացիայի հարաբերությանը շարժական փուլմեջ նյութի կոնցենտրացիան ստացիոնար փուլ(կամ ստացիոնար փուլ).

Ստացիոնար ստացիոնար փուլ- կարող է լինել պինդ կամ հեղուկ կամ պինդ և հեղուկի խառնուրդ:

շարժական փուլ- հեղուկ կամ գազային, այն հոսում է ստացիոնարի միջով կամ անցնում է դրա միջով:

Կախված անշարժ և շարժական փուլի տեսակից՝ տարբերվում են քրոմատոգրաֆիկ վերլուծության փոփոխությունները։

Ադսորբցիա- հիմնված է ներծծող նյութի կողմից սպիտակուցների կլանման տարբեր աստիճանի և համապատասխան լուծիչում դրանց լուծելիության վրա:

Օգտագործված adsorbents են silicic թթու, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, փայտածուխ: Ներծծող նյութը լուծիչով կասեցման տեսքով (սովորաբար բուֆերային լուծույթով) փաթեթավորված է սյունակում (ապակյա ուղղահայաց խողովակ): Նմուշը կիրառվում է սյունակի վրա, ապա դրա միջով անցնում են լուծիչ կամ լուծիչների խառնուրդ։

Տարանջատումը հիմնված է այն փաստի վրա, որ ավելի բարձր K բաշխում ունեցող նյութերը. (B) սյունակի երկայնքով շարժվելով ավելի արագ տեմպերով: Կոտորակները հավաքվում են կոտորակային կոլեկցիոների միջոցով:

Բաժանման քրոմատոգրաֆիա- հիմնված է երկու հեղուկ փուլերի միջև սպիտակուցների խառնուրդի բաշխման վրա: Տարանջատումը կարող է տեղի ունենալ հատուկ քրոմատոգրաֆիկ թղթի վրա, ինչպես նաև սյունակներում, ինչպես ադսորբցիայի ժամանակ։ Պինդ փուլն այս դեպքում ծառայում է միայն որպես հեղուկ ստացիոնար փուլի հենարան։ Քրոմատոգրաֆիկ թուղթն ունի իր ցելյուլոզային մանրաթելերի միջև ջուրը պահելու հատկություն։ Այս ջուրը անշարժ անշարժ փուլ է: Երբ ոչ ջրային լուծիչը (շարժական փուլ) շարժվում է թղթի միջով մազանոթ ուժերի ազդեցությամբ, թղթի վրա նստած նյութի մոլեկուլները բաշխվում են երկու փուլերի միջև՝ իրենց բաշխման գործակցի համաձայն: Որքան բարձր է նյութի լուծելիությունը շարժական փուլում, այնքան այն կշարժվի թղթի երկայնքով լուծիչի հետ միասին:
Սյունակի վրա քրոմատոգրաֆիայի բաշխման դեպքում կրողներն են ցելյուլոզը, օսլան, սիլիկա գելը և այլն, ստացիոնար փուլը ջուրն է։ Սյունակի վրա կիրառելիս խառնուրդի նյութերը սյունակի երկայնքով շարժվում են տարբեր արագություններով՝ հաշվի առնելով Կրասպը։

Ստանդարտ պայմաններում յուրաքանչյուր միացության համար Rf-ը հաստատուն արժեք է:
Իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիա - հիմնված է հակառակ լիցքավորված մասնիկների ներգրավման վրա: Դրա համար օգտագործվում են տարբեր իոնափոխանակման խեժեր. կատիոնափոխանակիչ խեժերը պարունակում են բացասական լիցքավորված խմբեր՝ սուլֆոնացված ստիրեններ և CMC, որոնք ներգրավում են ուսումնասիրվող նյութերի դրական լիցքավորված իոնները։ Դրանք նաև կոչվում են թթվային իոնափոխանակիչներ։
Անիոնափոխանակման խեժերը կամ հիմնական իոնափոխանակիչները պարունակում են դրական լիցքավորված խմբեր, որոնք գրավում են բացասական լիցքավորված սպիտակուցի մոլեկուլները։
Տրիմեթիլամինոստիրենը ստիրոլների և ցելյուլոզայի ածանցյալ է:
Կախված առանձնացվող սպիտակուցների q-ից՝ օգտագործվում են համապատասխան իոնափոխանակիչներ, որոնց հետ փոխազդում են որոշ սպիտակուցներ, իսկ մյուսներն ազատորեն հեռանում են սյունից։ Սյունակի վրա «նստեցված» սպիտակուցները հեռացվում են ավելի խտացված աղի լուծույթների միջոցով կամ էլյուենտի pH-ի փոփոխությամբ:
Աֆինիտե քրոմատոգրաֆիան (կամ հարաբերական քրոմատոգրաֆիան) հիմնված է սպիտակուցների կամ այլ մակրոմոլեկուլների ընտրովի փոխազդեցության սկզբունքի վրա՝ կրիչների՝ լիգանդների վրա անշարժացած հատուկ նյութերի հետ (սա կարող է լինել կոֆերմենտ, եթե մեկուսացված է ֆերմենտը, հակամարմինը, անտիգենը և այլն։ սպիտակուցների բարձր սպեցիֆիկություն, անշարժացված լիգանները դրան կցվում են միայն մեկ սպիտակուց յուրաքանչյուր խառնուրդի համար: Լվացվում է փոփոխված pH կամ փոփոխված իոնային ուժով բուֆերային խառնուրդներով:
Առավելությունը բարձր մաքրության տվյալ նյութը մեկ քայլով մեկուսացնելու հնարավորությունն է։
Գելային ֆիլտրման մեթոդը կամ մոլեկուլային մաղի մեթոդը ներթափանցման քրոմատոգրաֆիայի տեսակ է:
Մոլեկուլների բաժանումն ըստ չափի և ձևի հիմնված է մոլեկուլային մաղի հատկությունների վրա, որոնք ունեն շատ ծակոտկեն նյութեր, ինչպիսիք են օրգանական պոլիմերները եռաչափ ցանցային կառուցվածքով, որը նրանց տալիս է գելերի հատկություններ: Գելային ֆիլտրումը գելերի օգտագործմամբ նյութերի բաժանումն է՝ հիմնված մոլեկուլների չափերի տարբերությունների վրա (սեֆարոզ, սեֆադեքս, սեֆակրիլ, բիոգելներ և այլն): Էպիքլորոհիդրինի ազդեցությամբ դեքստրանի պոլիսախարիդային շղթաները (սինթեզված միկրոօրգանիզմների կողմից) խաչաձեւ կապակցվում են ցանցային կառուցվածքի մեջ, դառնում անլուծելի ջրում, բայց պահպանում են դրա նկատմամբ բարձր մերձեցում: Այս հիդրոֆիլության շնորհիվ ստացված հատիկները (կոչվում են Sephadex) ուժեղ ուռչում են՝ ձևավորելով գել, որը լցվում է սյունակի մեջ։ Մեթոդը հիմնված է այն բանի վրա, որ խոշոր մոլեկուլները չեն ներթափանցում ներքին ջրային փուլ, իսկ ավելի փոքր մոլեկուլները սկզբում ներթափանցում են «մաղի» ծակոտիները՝ կարծես խրված լինելով դրանց մեջ, ուստի շարժվում են ավելի ցածր արագությամբ։ Համապատասխանաբար, ավելի բարձր Mr-ով սպիտակուցներն առաջինն են մտնում ընդունիչ։ Վերջերս ծակոտկեն ապակե ուլունքները ավելի ու ավելի են օգտագործվում որպես մոլեկուլային մաղ ներթափանցման քրոմատագրության մեջ:
Կենսաքիմիայում էլեկտրաֆորետիկ մեթոդը հիմնված է էլեկտրական դաշտում մոլեկուլների շարժման արագության տարբերության վրա (ամինաթթուներ, պեպտիդներ, սպիտակուցներ, նուկլեինաթթուներ):
Արագության տարբերությունը կախված է.
1. մոլեկուլի q-ի վրա. որքան մեծ է մոլեկուլների շարժունակությունը, այնքան մեծ է ընդհանուր q-ն: q արժեքը կախված է pH-ից;
2. մոլեկուլների չափի վրա. որքան մեծ են մոլեկուլները, այնքան քիչ է նրանց շարժունակությունը: Դա պայմանավորված է շփման ուժերի և շրջակա միջավայրի հետ մեծ մոլեկուլների էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությամբ.
3. մոլեկուլների ձևի վրա՝ նույն չափի, բայց տարբեր ձևերի մոլեկուլները, օրինակ՝ մանրաթելերը և սպիտակուցային գնդիկները տարբեր արագություններ ունեն։ Դա պայմանավորված է շփման և էլեկտրաստատիկ փոխազդեցության ուժերի տարբերություններով:
Էլեկտրոֆորեզի տեսակները
ա) Իզոէլեկտրական կենտրոնացում. Տարանջատումը տեղի է ունենում ուղղահայաց սյունակի վրա աստիճաններով: ինչպես pH, այնպես էլ լարման: Ամֆոլիտների հատուկ կրիչների օգնությամբ սյունակում հաստատվում է կարկուտ։ pH 0-ից մինչև 14. Սյունակում տեղադրվում է նյութերի խառնուրդ, և էլեկտրական հոսանք է միացվում: Բաղադրիչներից յուրաքանչյուրը շարժվում է դեպի սյունակի այն հատվածը, որտեղ pH-ի արժեքը համապատասխանում է իր իզոէլեկտրական կետին և կանգ է առնում այնտեղ, այսինքն՝ կենտրոնացած է։
Առավելություն. մեկ քայլով բաժանում, մաքրում և նույնացնում է սպիտակուցները: Մեթոդն ունի բարձր լուծաչափ (0,02 pI):
բ) Իզոտախոֆորեզը էլեկտրոֆորեզ է օժանդակ միջավայրի վրա: Էլեկտրական հոսանքը միացնելուց հետո ամենաբարձր շարժունակություն ունեցող իոնները առաջինը շարժվում են դեպի համապատասխան էլեկտրոդ, իսկ ամենացածրը՝ վերջինը՝ միջանկյալ շարժունակությամբ, տեղակայվում են մեջտեղում։
գ) Սկավառակի էլեկտրոֆորեզ - սարքը բաղկացած է բուֆեր ունեցող երկու անոթից՝ վերին և ստորին, որոնք միացված են տարբեր ծակոտիների գել պարունակող ուղղահայաց խողովակներով: Երբ իոնացված մասնիկները շարժվում են էլեկտրական հոսանքի ազդեցության տակ: Ավելի բարձր ծակոտկենություն է գելի վերին մասում:
դ) իմունոէլեկտրոֆորեզ՝ էլեկտրոֆորեզը իմունոդիֆուզիայի հետ համատեղող մեթոդ (բարդ ֆիզիոլոգիական խառնուրդներում անտիգենների հայտնաբերման համար): Անտիգենների խառնուրդը և հակամարմինների խառնուրդը տեղադրվում են միմյանց ուղղահայաց հատուկ կրիչի վրա: Երբ էլեկտրական հոսանքը միացված է, դրանք բաժանվում են առանձին նյութերի և ցրվում գել կրիչի վրա։ Անտիգենի համապատասխան հակամարմինի հետ հանդիպման կետում տեղի է ունենում հատուկ տեղումների ռեակցիա՝ աղեղի տեսքով։ Ձևավորված աղեղների քանակը համապատասխանում է անտիգենների քանակին։

Mr սպիտակուցների որոշման մեթոդներ

ժամը մեծ թվովսպիտակուցներ, ամինաթթուների քիմիական կազմը և հաջորդականությունը հաստատված չէ (1010–1012 սպիտակուցներ), հետևաբար, պրն. Դրա համար օգտագործվում են տարբեր մեթոդներ.
ա) Նստվածքի մեթոդ - Mr-ի որոշումը կատարվում է հատուկ ցենտրիֆուգներում (առաջին ցենտրիֆուգն առաջարկել է շվեդ կենսաքիմիկոս Սվեդբերգը), որտեղ հնարավոր է ստեղծել կենտրոնախույս արագացում, որը գերազանցում է 200 հազարից ավելին և ավելին: երկրի ձգողականությունը. Mr որոշվում է մոլեկուլների V նստվածքից։ Երբ մոլեկուլները շարժվում են կենտրոնից դեպի ծայրամաս, սուր սահմանլուծիչ սպիտակուց: Նստվածքի արագությունը արտահայտվում է նստվածքի հաստատունով (S).

որտեղ V-ը սպիտակուց-լուծիչ միջերեսի շարժման արագությունն է (սմ/վ);
 ռոտորի անկյունային արագությունն է (rad/s);
-ն սպիտակուցի լուծույթով ռոտորի կենտրոնից մինչև բջջի կեսն է (սմ):
Նստվածքային հաստատուն S-ի արժեքը, որը հավասար է 110–13 C-ի, պայմանականորեն ընդունվում է որպես 1 և կոչվում է 1 Svedberg (S): S սպիտակուցների համար տատանվում է 1-50 S, երբեմն մինչև 100 S:
Սպիտակուցների պարոնը որոշվում է Սվեդբերգի հավասարմամբ.

որտեղ R-ը գազի համընդհանուր հաստատունն է.
T - բացարձակ ջերմաստիճանՔելվինի կողմից;
S-ը նստվածքի հաստատունն է.
D-ը դիֆուզիոն գործակիցն է.
 լուծիչի խտությունն է.
V-ը գազի մասնակի տեսակարար ծավալն է։
Այս մեթոդը թանկ է սարքավորումների օգտագործման պատճառով:
Ավելի պարզ և էժան.
բ) Գելի ֆիլտրում Sephadex-ի բարակ շերտով:
Սպիտակուցի ճանապարհի երկարությունը (մմ-ով) լոգարիթմական է Mr.
X - Ցանկալի սպիտակուցի Mr-ը չափաբերման գրաֆիկի վրա:
գ) Սկավառակի էլեկտրոֆորեզ պոլիակրիլամիդային շերտում - կա նաև կապ տրամաչափման սպիտակուցների Mr լոգարիթմի և դրանց ճանապարհի երկարության միջև:

Սպիտակուցների միատարրության որոշման մեթոդներ

Մեկուսացված սպիտակուցի մաքրության աստիճանը որոշվում է հետևյալով.

• ultracentrifugation;
• սկավառակ-էլեկտրոֆորեզի մեթոդ;
• տարբեր իմունաքիմիական մեթոդներ;
• Սպիտակուցի լուծելիության որոշումը (Նորթրոպի մեթոդ) հիմնված է փուլային կանոնի վրա, ըստ որի՝ տվյալ փորձարարական պայմաններում մաքուր նյութի լուծելիությունը կախված է միայն ջերմաստիճանից, բայց կախված չէ նյութի կոնցենտրացիայից պինդ փուլում։

Եթե ​​սպիտակուցը միատարր է, ապա (ա) գրաֆիկի վրա ստացվում է մեկ թեքություն, եթե կան սպիտակուցային կեղտեր (b, c), ապա կստանանք հագեցվածության կորի մի քանի թեքություն։ Բոլոր սպիտակուցներն ունեն իրենց անհատական ​​լուծելիության կորերը:

480 ռուբ. | 150 UAH | $7,5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Թեզ - 480 ռուբլի, առաքում 10 րոպեՕրը 24 ժամ, շաբաթը յոթ օր և արձակուրդներ

Կայշևա Աննա Լեոնիդովնա Սպիտակուցների և սպիտակուցային կոմպլեքսների զանգվածային սպեկտրաչափական նույնականացում ատոմային ուժային մանրադիտակի չիպերի վրա. ատենախոսություն... կենսաբանական գիտությունների թեկնածու՝ 03.01.04 / Kaisheva Anna Leonidovna; [Պահպանության վայրը՝ Nauch.-issled. in-t biomed. քիմիա դրանք. Վ.Ն. Orekhovich RAMS].- Մոսկվա, 2010.- 104 p.: հիվանդ. RSL OD, 61 10-3/1308

Ներածություն

Գլուխ 1 Գրականության տեսություն 10

1.1. Բարձր զգայուն պրոտեոմիկ տեխնոլոգիաների ոլորտում գիտական ​​և տեխնիկական հիմքերի վերլուծություն

1.2 Հեպատիտ C վիրուսի բնութագրում 20

1.2.1 Հեպատիտ C-ի ախտորոշման մեթոդներ 22

1.2.2 Հեպատիտ C-ի շճաբանական սպիտակուցային մարկերներ 25

Գլուխ 2. Նյութեր և մեթոդներ 28

2.1 ACM չիպեր 28

2.2 Սպիտակուցային պատրաստուկներ և ռեակտիվներ 29

2.3 AFM վերլուծություն 30

2.4 Նմուշի պատրաստում զանգվածային սպեկտրաչափական անալիզի համար 31

2.5 Զանգվածային սպեկտրաչափական վերլուծություն 33

2.5.1 MALDI-MS սպիտակուցների վերլուծություն AFM չիպի մակերեսի վրա 33

2.5.2 ESI-MS վերլուծություն AFM չիպի մակերեսի սպիտակուցների 34

Գլուխ 3 Արդյունքներ և քննարկում 35

3.1 MS - «քիմիական ձկնորսությամբ» բռնված սպիտակուցների նույնականացում AFM չիպի մակերեսին անալիտի լուծույթից

3.2 Անալիտի լուծույթից AFM չիպի մակերևույթի վրա կենսահատուկ կերպով գրավված սպիտակուցների MS նույնականացում

3.3 Արյան շիճուկի նմուշներից կենսահատուկ կերպով մեկուսացված AFM չիպի մակերեսին սպիտակուցների MS նույնականացում

Եզրակացություն 83

գրականություն

Աշխատանքի ներածություն

Աշխատանքի արդիականությունը.

Ժամանակակից կենսաքիմիայի առաջնահերթ ուղղություններից մեկը պրոտեոմիական վերլուծության արդյունավետ վերլուծական մեթոդների ստեղծումն է, որի հիմնական խնդիրն է հայտնաբերել և գույքագրել մարմնում սպիտակուցները, ուսումնասիրել դրանց կառուցվածքն ու գործառույթները և հայտնաբերել սպիտակուցների փոխազդեցությունները: Այս խնդրի լուծումը թույլ կտա ստեղծել հիվանդությունների ախտորոշման և բուժման նոր համակարգեր։ Ժամանակակից պրոտեոմիկ վերլուծության ստանդարտ մեթոդները հիմնված են բազմաբաղադրիչ սպիտակուցային խառնուրդների բաժանման վրա՝ օգտագործելով քրոմատագրություն, էլեկտրոֆորեզ՝ սպիտակուցի նույնականացման զանգվածային սպեկտրոմետրիկ մեթոդների (MS) հետ համատեղ: Չնայած ստանդարտ MS վերլուծության անկասկած առավելությունին սպիտակուցի մոլեկուլների նույնականացման արագության և հուսալիության առումով, այն ունի կիրառման զգալի սահմանափակումներ ցածր ցածր մակարդակի պատճառով:

վերլուծության կոնցենտրացիայի զգայունությունը 10" "10" M մակարդակում և կենսաբանական նյութում սպիտակուցի պարունակության բարձր դինամիկ միջակայք: Միևնույն ժամանակ, ֆունկցիոնալ սպիտակուցների ճնշող մեծամասնությունը, ներառյալ այնպիսի սոցիալական նշանակալի հիվանդությունների բիոմարկերներ, ինչպիսիք են վիրուսային հեպատիտ B-ը: և C-ն, ուռուցքային մարկերները և այլն, առկա են արյան պլազմայում 10" Mi պակաս կոնցենտրացիաներում:

Վերլուծության կոնցենտրացիայի զգայունության այս մեթոդաբանական սահմանափակումը հաղթահարելու ուղիներից մեկը կենսամոլեկուլային դետեկտորների օգտագործումն է, որոնք թույլ են տալիս հայտնաբերել առանձին մոլեկուլներ և դրանց համալիրներ և տեսականորեն չունեն կոնցենտրացիայի զգայունության սահմանափակումներ: Կենսամոլեկուլային դետեկտորները ներառում են դետեկտորներ, որոնք հիմնված են նանոտեխնոլոգիական սարքերի վրա, ինչպիսիք են ատոմային ուժային մանրադիտակները (AFM), նանոլարերի դետեկտորները, նանոծակերը և մի շարք այլ դետեկտորներ: AFM դետեկտորների յուրահատուկ զգայունությունը հնարավորություն է տալիս պատկերացնել առանձին սպիտակուցային մոլեկուլներ և հաշվել դրանց թիվը: AFM-ն որպես բիոմոլեկուլյար դետեկտոր օգտագործելիս անհրաժեշտ է օգտագործել հատուկ չիպեր, որոնք թույլ են տալիս կենսաբանական անալիտի մակրոմոլեկուլների կոնցենտրացիան ինկուբացիոն լուծույթի մեծ ծավալից սահմանափակ չիպի մակերեսի վրա: Ուսումնասիրված սպիտակուցային օբյեկտները կարող են կենտրոնանալ չիպի մակերեսի վրա և՛ ֆիզիկական կամ քիմիական կլանման, և՛ կենսասպեցիֆիկ փոխազդեցությունների շնորհիվ (AFM-biospecific fishing):

Այնուամենայնիվ, գործնականում AFM-ի վրա հիմնված նանոդետեկտորների օգտագործման սահմանափակումն այն է, որ, չնայած չիպի մակերեսի վրա առանձին սպիտակուցային մոլեկուլների պատկերացման հնարավորությանը, այդպիսի դետեկտորները չեն կարողանում նույնականացնել դրանք, ինչը հատկապես կարևոր է բարդ սպիտակուցի ուսումնասիրության մեջ: խառնուրդներ, ներառյալ կենսաբանական նյութեր. Հետևաբար, AFM մեթոդի հնարավորությունները լրացնող վերլուծության մեթոդի մշակումը հրատապ խնդիր է թվում: Մինչ օրս միակ պրոտեոմիկ մեթոդը, որը թույլ է տալիս միանշանակ և հուսալի նույնականացնել սպիտակուցի մոլեկուլները, MS անալիզն է: Ատենախոսական աշխատանքում մշակվել է մոտեցում, որը միավորում է AFM մեթոդի բարձր զգայունությունը և անալիտային լուծույթից սպիտակուցների և դրանց բարդույթների հայտնաբերման հուսալի MS նույնականացումը:

Ուսումնասիրության նպատակը և խնդիրները:

Այս աշխատանքի նպատակը ատոմային ուժի մանրադիտակի միջոցով կենսանյութում հայտնաբերված սպիտակուցների և սպիտակուցային համալիրների զանգվածային սպեկտրաչափական նույնականացումն էր:

Այս նպատակին հասնելու համար լուծվեցին հետևյալ խնդիրները.

Մշակվել է քիմիական կամ կենսահատուկ ձկնորսության միջոցով AFM չիպի մակերեսին բռնված սպիտակուցների MS նույնականացման սխեման.

Ստեղծվել են AFM չիպի մակերեսի վրա սպիտակուցների ֆերմենտային հիդրոլիզի պայմաններ՝ հետագա MS նույնականացման համար.

Կատարվել է AFM չիպի մակերեսի մոդելային սպիտակուցների MS նույնականացում;

Կատարվել է բազմաբաղադրիչ խառնուրդից (շիճուկից) կենսահատուկ կերպով մեկուսացված AFM չիպի մակերեսի սպիտակուցների MS նույնականացում:

Աշխատանքի գիտական ​​նորույթը .

Ատենախոսության մեջ մշակվել է սխեմա, որը թույլ է տալիս MS նույնականացնել սպիտակուցները և սպիտակուցային համալիրները, որոնք բռնվել են լուծույթից կամ բազմաբաղադրիչ խառնուրդից AFM չիպի մակերեսին: Դրա համար ընտրվել են նմուշի պատրաստման օպտիմալ պայմանները, ներառյալ AFM չիպի մակերեսին կովալենտորեն և ոչ կովալենտորեն անշարժացված սպիտակուցի մոլեկուլների հիդրոլիզի ռեժիմը (ջերմաստիճան, խոնավություն, տրիպսինոլիտիկ խառնուրդի բաղադրություն, տրիպսինոլիզի ժամանակ): Այս աշխատանքի առանձնահատկությունն այն էր, որ համեմատած ֆերմենտային հիդրոլիզի ստանդարտ պրոտեոմիկ արձանագրությունների հետ, MS վերլուծության համար նմուշների պատրաստումն իրականացվել է ոչ թե լուծույթով, այլ սահմանափակ տարածքում։

չիպային մակերես: Մշակված սխեման հնարավորություն տվեց արդյունավետ կերպով իրականացնել MS վերլուծություն և նույնականացնել ինչպես առանձին սպիտակուցներ, այնպես էլ սպիտակուցային համալիրներ AFM չիպի մակերեսին: Ուսումնասիրված սպիտակուցների պրոտեոտիպային պեպտիդների MS անալիզն իրականացվել է երկու տեսակի իոնացման միջոցով (ՄԱԼԴԻԵվ EST)և երկու տեսակի դետեկտորներ (TOF և ion trap): AFM-biospecific ձկնորսության և MS-ի միացման մշակված սխեման նույնպես հաջողությամբ փորձարկվել է արյան շիճուկի նմուշներում վիրուսային հեպատիտ C-ի (HCV) (HCVcoreAg և E2) սպիտակուցային մարկերների հայտնաբերման համար:

Աշխատանքի գործնական նշանակությունը .

Այս աշխատանքի արդյունքները հնարավորություն են տալիս ստեղծել բարձր զգայուն պրոտեոմային մեթոդներ՝ առանց պիտակների և նմուշների պատրաստման լրացուցիչ ընթացակարգերի՝ կենսաբանական նյութերում, ներառյալ արյան շիճուկում, ցածր կոնցենտրացիաներում հայտնաբերված սպիտակուցների հայտնաբերման համար: Առաջարկվել է ատոմային ուժային մանրադիտակի և զանգվածային սպեկտրոմետրիայի վրա հիմնված մոտեցում, որը հնարավորություն կտա հայտնաբերել և բացահայտել մարդու արյան շիճուկում հեպատիտ C վիրուսի սպիտակուցային մարկերները։

Մոտեցումը կարող է օգտագործվել մշակումների մեջ, որոնք ուղղված են նոր ախտորոշիչ չիպերի ստեղծմանը, սոցիալապես նշանակալի հիվանդությունների լայն շրջանակի բիոմարկերների որոնմանը:

Աշխատանքի հաստատում.

Հետազոտության հիմնական արդյունքները ներկայացվել են «1-ին, 2-րդ և 3-րդ միջազգային նանոտեխնոլոգիայի ֆորումում» (Մոսկվա, 2008-2010 թթ.); «Ռուսական կենսաքիմիկոսների ընկերության IV կոնգրես և մոլեկուլային կենսաբաններ», Նովոսիբիրսկ, 2008; «Մարդկային պրոտեոմ» միջազգային կոնգրեսում, Ամստերդամ, 2008 թ. «Մարդկային պրոտեոմ» միջազգային կոնգրեսում, Սիդնեյ, 2010 թ.

Հրապարակումներ.

Ատենախոսության կառուցվածքը և ծավալը.

Ատենախոսությունը բաղկացած է ներածությունից, գրականության ակնարկից, հետազոտության նյութերի և մեթոդների նկարագրությունից, հետազոտության արդյունքներից և դրանց քննարկումից, եզրակացությունից, եզրակացություններից և հղումների ցանկից: Աշխատանքը ներկայացված է 104 էջի վրա՝ պատկերազարդված 33 պատկերներով և 4 աղյուսակներով, հղումների ցանկը բաղկացած է 159 վերնագրից։

Բարձր զգայուն պրոտեոմիկ տեխնոլոգիաների ոլորտում գիտական ​​և տեխնիկական հիմքերի վերլուծություն

Հայաստանում առաջնահերթ ոլորտներից մեկը ժամանակակից գիտայն է բացահայտել և պարզաբանել տարբեր տեսակի սպիտակուցների դերը մարմնում, ինչպես նաև հասկանալ մոլեկուլային մեխանիզմները, որոնք հանգեցնում են հիվանդությունների զարգացմանը:

Չնայած պրոտեոմիկ մեթոդների մշտական ​​կատարելագործմանը, հիվանդության նոր հայտնաբերված բիոմարկերների թիվը մնում է գրեթե / անփոփոխ: վերջին տասնամյակում. Դա պայմանավորված է նրանով, որ ավանդական պրոտեոմիկ մեթոդների հայտնաբերման կոնցենտրացիայի սահմանը չի գերազանցում 10"9 Մ-ը: Միևնույն ժամանակ, պրոտեոմիկայի համար կարևոր է մշակել նոր վերլուծական մոտեցումներ ավելի ցածր կոնցենտրացիայի միջակայքում սպիտակուցների նույնականացման համար, մասնավորապես. սպիտակուցի մոլեկուլներ (10"13 M և պակաս կոնցենտրացիայով), ներառյալ կենսամարկերները կենսաբանական նյութում։ Քանի որ կարելի է ենթադրել, որ հենց այս կոնցենտրացիաների միջակայքում են հայտնաբերվել հիվանդությունների մեծ մասի սպիտակուցային մարկերները:

Ակտիվ զարգացող ոլորտներից մեկը, որը հնարավորություն է տալիս որոշակիորեն բարձրացնել վերլուծության կոնցենտրացիայի զգայունությունը, զանգվածային սպեկտրոմետրերի հետ համատեղելի նանոքրոմատոգրաֆիկ և նանոէլեկտրոֆորետիկ համակարգերի վրա հիմնված անալիտիկ համալիրների ստեղծումն է:

Նանոքրոմատոգրաֆիական համակարգը զանգվածային սպեկտրոմետրիայի և էլեկտրասփրեյի տիպի իոնացման հետ համատեղ հնարավորություն տվեց բարձրացնել սպիտակուցի հայտնաբերման զգայունությունը երկու կարգի մեծության՝ համեմատած քրոմատոգրաֆիայի հետ։ բարձր լուծում(HPLC) . Նման կոնյուգացված համակարգերի կոնցենտրացիայի զգայունության սահմանը սահմանափակվում է էլեկտրոֆորեզի/քրոմատոգրաֆիայի փուլի զգայունությամբ և չի գերազանցում 10-12 Մ-ը առանձին սպիտակուցների համար (օրինակ՝ ցիտոքրոմ C-ի և բրադիկինինի համար):

Ներկայումս քրոմատոգրաֆիկ մեթոդները վերածվել են առանձին անկախ տարածքների՝ SELDI MS վերլուծություն (մակերևույթի ուժեղացված լազերային դեզորբցիա և իոնացում/թռիչքի զանգվածային սպեկտրոմետրիա), սպիտակուցային ձկնորսության մեթոդներ՝ օգտագործելով մագնիսական միկրոմասնիկներ: Այս տեխնոլոգիաներում SELDI-չիպերի հիդրոֆոբ կամ լիցքավորված մակերեսներն են. կամ մագնիսական միկրոմասնիկները, զանգվածային սպեկտրաչափական անալիզով համակցությունները, հաջողությամբ օգտագործվում են՝ համար? հայտնաբերում և նույնականացում որպես առանձին տեսակներ. սպիտակուցներ և արյան շիճուկի սպիտակուցային/պեպտիդային պրոֆիլավորման համար [c, 8; \բ, 15]։ SEbDIi МЄ-ն հզոր մոտեցում է, որը թույլ է տալիս ուսումնասիրել կենսանյութը քիմիապես ակտիվացված բիոմոլեկուլների (սպիտակուցներ, պեպտիդներ) կլանման միջոցով: մակերեսին (կատիոնների/անիոնափոխանակման չիպսեր), որին հաջորդում է կլանված մոլեկուլների զանգվածային սպեկտրաչափական վերլուծությունը. Կիրառվում է SEEDPMЄ մոտեցումը; կենսանյութի սպիտակուցային պրոֆիլավորման համար; և վերջերս. այն օգտագործվել է որպես «ախտորոշում, օգտագործելով պրոտեոմիկ շտրիխ կոդեր» [17]։ Նման «շտրիխ ախտորոշման» էությունը նույնականացնելն է։ կենսաբանական նմուշի սպիտակուցային պրոֆիլի առանձնահատկությունները. կապված որոշակի հիվանդության հետ. Այո, հայտնի է; ինչ դ. Քաղցկեղային հիվանդություններ, կենսանյութի «պրոտեոմիկ շտրիխ-կոդը» էականորեն տարբերվում է առողջ1 խմբերի մարդկանցից. Հետևաբար, սպիտակուցի փոփոխությունների նկատմամբ վերահսկողություն. կենսանյութի բաղադրությունը կարող է հիմք դառնալ հիվանդությունների վաղ ախտորոշման համար։ Վրա; այսօր, օգտագործելով SELDI մոտեցումը: Հայտնաբերվել են МЄ մարկերներ: Ստամոքսի, ձվարանների, շագանակագեղձի և կրծքագեղձի քաղցկեղ. Այս մեթոդի սահմանափակումը5 բարձր լուծաչափով և ճշգրտությամբ սպիտակուցները նույնականացնելու անկարողությունն է, ինչը հատկապես կարևոր է. բազմաբաղադրիչ խառնուրդների վերլուծություն, ինչպիսիք են կենսաբանական նյութերը:

Ի լրումն առկա անալիտիկ համակարգերի ցածր կոնցենտրացիայի զգայունության խնդրին, կենսաբանական նյութի պրոտեոմիկ վերլուծության համար խոչընդոտ է դարձել սպիտակուցի կոնցենտրացիաների լայն դինամիկ տիրույթը, հատկապես արյան շիճուկում, որը տատանվում է 1 (G M-ից մինչև առանձին սպիտակուցի մոլեկուլներ): Բարձր օրինակով (հիմնական) սպիտակուցները խանգարում են նման համակարգերի հայտնաբերմանը և նույնականացմանը ցածր (փոքր) սպիտակուցներ:

Կենսանյութում սպիտակուցների կոնցենտրացիայի լայն շրջանակի խնդիրը կարող է լուծվել՝ կիրառելով արյան շիճուկը հիմնական սպիտակուցային ֆրակցիաներից, բազմաբաղադրիչ խառնուրդների առանձնացման մեթոդները և նանոտեխնոլոգիական մեթոդները, որոնք հիմնված են անալիտի սպիտակուցային մոլեկուլների բիոսպեցիֆիկ և քիմիական որսալու վրա բարդ խառնուրդներից։ չիպսերի մակերեսի վրա տարբեր բիոսենսորների կամ ակտիվացված մակերեսի վրա մագնիսական միկրոսֆերաներ.

Ավանդաբար, միաչափ, ավելի հաճախ երկչափ գելային էլեկտրոֆորեզը օգտագործվում է բազմաբաղադրիչ սպիտակուցային խառնուրդների առանձնացման համար: Երկչափ գելային էլեկտրոֆորեզով սպիտակուցների բաժանման սկզբունքը հիմնված է սպիտակուցների միջև եղած տարբերության վրա՝ ըստ մոլեկուլային կշիռների դրանց իզոէլեկտրական կետերի արժեքների՝ Hf: Պրոտեոմիկայի մեջ այս մոտեցումներն օգտագործվում են կենսանյութի (հյուսվածք, արյան պլազմա և այլն) սպիտակուցային քարտեզագրման համար։ 1D և/կամ 2D էլեկտրոֆորեզի համադրությունը զանգվածային սպեկտրոմետրիայի հետ թույլ է տալիս նույնականացնել առանձնացված և տեսանելի սպիտակուցները: Այնուամենայնիվ, երկչափ գելային էլեկտրոֆորեզի ընթացակարգը դեռ ավտոմատացված չէ, այն բավականին բարդ է և ժամանակատար, այն պահանջում է օպերատորի բարձր որակավորում, և վերլուծության արդյունքները հաճախ վատ են վերարտադրվում:

Ավելի հարմար է երկչափ էլեկտրոֆորեզի համեմատությամբ, սպիտակուցների տարանջատման կարգը բարձր արդյունավետության քրոմատոգրաֆիան է (HPLC); որը ավտոմատացված պրոցեդուրա է, որը թույլ է տալիս բարդ խառնուրդից հեռացնել բարձր պատճենող սպիտակուցները, որպեսզի հետագայում նույնականացվեն ցածր պատճենող սպիտակուցները:

Բարդ խառնուրդներում սպիտակուցներն ուղղակիորեն բացահայտելու համար քրոմատոգրաֆիկ սյունը կարող է միացված լինել զանգվածային սպեկտրոմետրին: Այնուամենայնիվ, անձեռնմխելի սպիտակուցները գործնականում չեն ենթարկվում բարձրորակ տարանջատման HPLC-ի միջոցով, քանի որ վերլուծության ընթացքում դրանք դեֆորմացվում են (օրգանական լուծիչների միջին և բարձր կոնցենտրացիայի ցածր pH արժեքների պատճառով), ինչպես նաև զանգվածային սպեկտրաչափական ցածր ճշգրտության պատճառով: վերլուծություն, հետևաբար, անձեռնմխելի սպիտակուցների մեծ մասի ուղղակի նույնականացումը, հատկապես 10 կԴա-ից ավելի մոլեկուլային քաշի դեպքում, հաճախ անհնար է: Անալիտիկ չափումների ճշգրտությունը կարող է բարելավվել սպիտակուցների հիդրոլիտիկ տրոհման միջոցով պեպտիդային բեկորներ, մոլեկուլային քաշը 700-ից մինչև 4000 Da՝ օգտագործելով պրոտեազներ; ինչպես օրինակ տրիպսինը (ներքևից վեր տեխնոլոգիա): Խառնուրդում սպիտակուցների որակական տարանջատման հասնելու համար օգտագործվում է մի քանի քրոմատոգրաֆիկ պրոցեդուրաների համադրություն, այսպես կոչված, բազմաչափ քրոմատագրություն։

Հեպատիտի ախտորոշման մեթոդներ

Ներկայումս հեպատիտ C-ի սպիտակուցային ախտորոշման համար օգտագործվում են հակա-HCVcore-ի հայտնաբերման թեստային համակարգեր: Առաջին ELISA թեստերը, որոնք հայտնաբերեցին հակա-HCVcore հակամարմինների առկայությունը, հասանելի դարձան 1990-ականների սկզբին, սակայն դրանք ունեին ցածր զգայունություն և ընտրողականություն: Ավելի ուշ՝ 1990-ականների վերջին, հայտնվեց հակա-HCVcore ELISA թեստերի նոր սերունդը, որն ուներ բավականին բարձր զգայունություն՝ մոտ 95-99% և կարող էր հայտնաբերել HCV վարակվելուց մի քանի ամիս անց:

Օրինակ, 1996-ին ռուսական շուկայում հայտնվեցին Vector-Best (Նովոսիբիրսկ) և Diagnostic Systems (Նիժնի Նովգորոդ) կողմից մշակված թեստային համակարգերը, որոնք հայտնաբերելու համար հակամարմիններ՝ IgM դասի հակա-HCV: IgM հակամարմինների դերը սերոախտորոշման մեջ բավականաչափ ուսումնասիրված չէ, այնուամենայնիվ, որոշ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել այս մարկերի կարևորությունը քրոնիկ հեպատիտ C-ի հայտնաբերման համար: Հաստատվել է նաև, որ հիվանդների մոտ վիրուսային ՌՆԹ-ի և հակա-HCV IgM-ի հայտնաբերման հարաբերակցությունը կազմում է 80-95%: Որոշելու վիրուսային հեպատիտ C-ի զարգացման փուլը Աֆանասիև Ա.Յու. և այլոք օգտագործեցին հիվանդների արյան մեջ հակա-HCV IgG-ի և հակա-HCV IgM-ի հարաբերակցությունը արտացոլող գործակից: Մինչ օրս մշակվել են բազմաթիվ ֆերմենտների հետ կապված իմունոսորբենտային վերլուծության (ELISA) համակարգեր, որոնք հայտնաբերում են հեպատիտ E-ի վիրուսի բազմաթիվ էպիտոպների շրջանառվող հակամարմինները:

Մոսկվայի բժշկական հաստատությունների մեծ մասում իրականացվում է վիրուսային հեպատիտ E-ի ժամանակակից լաբորատոր ախտորոշում. Ռուսաստանի Դաշնության Առողջապահության նախարարության և Առողջապահության դեպարտամենտի առկա հրամանների համաձայն. Մոսկվան և արդյոք որոշելու է իմունոգոլոբուլինները: հիվանդների արյան շիճուկում G դասից մինչև հեպատիտ E վիրուսը (anti-HGV IgG): Այս մարկերի նույնականացումը հնարավորություն է տալիս դատել ընթացիկ կամ անցյալ վարակի առկայության մասին:

Մեթոդների թերությունները; EISA-ի վրա հիմնված հայտնաբերումները, ի լրումն ցածր զգայունության (ավելի քան GO «12 M)j, պայմանավորված են նաև կեղծ հայտնաբերմամբ; վիրուսային հեպատիտ E հիվանդների մոտ՝ հետվարակիչ իմունիտետի պատճառով, հակամարմինների խաչաձև ռեակտիվության պատճառով, ինչպես. ինչպես նաև անբավարար զգայունություն սուր շրջանում) փուլ BFG BI LINKS. ՍԱ «հեպատիտ E-ի 1 մարկերների հայտնաբերման զգայուն, հատուկ, արագ և հեշտ կատարվող մեթոդների ակտիվ որոնում է:

Շիճուկում վիրուսային հեպատիտի հայտնաբերման մեթոդների մեկ այլ խումբ՝ արյունը-B_գրանցում, ՌՆԹ BEI՝ օգտագործելով PCR; ՌՆԹ-ի սահմանումը. BFG մեթոդներ; GAD-ը չի կարող օգտագործվել որպես առաջնային թեստ՝ հաստատման կամ բացառման համար. ախտորոշում; Բայց; Միգուցե; Օգտակար է ախտորոշումը հաստատելու համար. 1 BFG-ի ախտորոշումը կատարվում է 5' ոչ կոդավորող ՌՆԹ շրջանի վերլուծությամբ: Այնուամենայնիվ, վերլուծության արդյունքները տարբեր են տարբեր BFG գենոտիպերի միջև:

Ռուսական շուկայում հայտնվել են կենսաբանական միկրոչիպեր, որոնք հնարավորություն են տալիս իրականացնել - BFG գենոտիպավորում և - որոշել արդյունավետ հակավիրուսային սխեման; թերապիա. Այս բիոչիպը օլիգոնուկլեոտիդային չիպ է BFG-ի գենոտիպավորման համար՝ հիմնված NS5B տարածաշրջանի վերլուծության վրա: Ստացված արդյունքները ցույց են տալիս բիոչիպի կարողությունը նույնականացնելու HCV-ի բոլոր 6 գենոտիպերը և 36 ենթատեսակները, ներառյալ ամենավիրուլենտ և դեղակայուն ձևերը:

Մի կողմից, PCR վերլուծության մեթոդները գերզգայուն են և թույլ են տալիս հայտնաբերել և ուժեղացնել ազդանշանը նմուշում ընդամենը մեկ ՌՆԹ մոլեկուլից, բայց մյուս կողմից՝ այս մեթոդները բնութագրվում են կեղծ դրական արդյունքներով՝ նմուշների պատահական աղտոտվածության, կեղծ բացասական արդյունքների պատճառով: վիրուսի բարձր փոփոխականության և անալիզի համեմատաբար բարձր արժեքի պատճառով: Նույնիսկ նույն անձի մոտ HCV ՌՆԹ-ի մակարդակը կարող է պարբերաբար փոխվել ավելի քան մեկ միլիապատիկ անգամ, ինչը հանգեցնում է կեղծ բացասական արդյունքների, եթե ցածր է: վիրուսի վերարտադրությունը կամ եթե վիրուսը պահպանվում է հյուսվածքներում՝ առանց արյան մեջ մտնելու։ Տարբեր լաբորատորիաներում RIG-ի, HCV-ի քանակական որոշման արդյունքները բավականաչափ համընկնում չեն:

Հատկապես արժեքավոր են վիրուսային հեպատիտ C-ի վաղ հայտնաբերման համար Bt կենսանյութը HCV սպիտակուցի անտիգեններն են, քանի որ դրանք հայտնվում են արյան շիճուկում մի քանի շաբաթ առաջ, նույնիսկ մինչև մարմնի լիարժեք իմունային պատասխանի զարգացումը:

Հեպատիտ C-ի վիրուսի մակերևութային HCVcoreAg հակագենը հեպատիտ C-ի վիրուսով վարակման հիմնական մարկերն է: Այն հայտնաբերվում է արյան մեջ հակամարմինների հայտնվելուց 16 շաբաթ առաջ՝ մարմնի իմունային պատասխանի պատճառով և մինչև կլինիկական նշանների զարգացումը, մինչդեռ այն արձանագրվում է ինչպես սուր, այնպես էլ քրոնիկական փուլերում: Գոյություն ունի միայն մեկ արտասահմանյան առևտրային արտադրանք («Ortho Clinical Diagnostics») հեպատիտ C-ի սուր փուլում ELISA ախտորոշման համար՝ հիմնված HCVcoreAg-ի հայտնաբերման վրա:

Կառուցվածքային HCVcoreAg սպիտակուցը, որը բաղկացած է 121 ամինաթթուների մնացորդներից, գտնվում է պոլիպեպտիդի N-վերնամասում և ձևավորվում է բջջային պրոտեազների ազդեցության տակ։ Առաջին պրոտեոլիտիկ հիդրոլիզը տեղի է ունենում 191 և 192 մնացորդների միջև (տեղակայում C1) և հանգեցնում է E1 գլիկոպրոտեինի ձևավորմանը: Երկրորդ ճեղքման վայրը (C2) գտնվում է 174 և 191 ամինաթթուների միջև: Համապատասխան ճեղքման արտադրանքները կոչվում են p21 և p23: Մի շարք կաթնասունների բջիջներում արտահայտվածության վերլուծությունը ցույց է տվել, որ p21-ը հիմնական արտադրանքն է, մինչդեռ p23-ը հայտնաբերվում է փոքր քանակությամբ: Հնարավոր է, որ C1 և C2 տեղամասերում տրոհումը փոխկապակցված գործընթաց է, քանի որ p21-ը ձևավորվում է այն պայմաններում, երբ G2-ում հիդրոլիզ չի նկատվում [D45]: HCVcoreAg-ը ՌՆԹ կապող հիմնական սպիտակուցն է, որը, ըստ երևույթին, ձևավորում է վիրուսային նուկլեոկապսիդը: Այս սպիտակուցի կենսաքիմիական հատկությունները դեռ վատ են բնութագրվում: Հեպատիտ C-ի վիրուսի մասնիկների AFM ուսումնասիրությունները հնարավորություն են տվել ստանալ HCV կապսիդի պատկեր:

ASM չիպսեր

Աշխատանքի փորձարարական մասում օգտագործվել են երկու տեսակի AFM չիպեր. Առաջին տեսակն օգտագործվել է AFM չիպերի մակերեսի վրա մոդելային սպիտակուցների MS նույնականացման համար: Այս չիպսերը ֆունկցիոնալ ակտիվ քիմիական խմբերով ենթաշերտեր էին (այսուհետ՝ AFM չիպեր՝ քիմիական ակտիվացված մակերեսով), որոնց վրա ուսումնասիրված մոլեկուլները բռնվել և անդառնալիորեն անշարժացվել են կովալենտային կապերի պատճառով՝ այսպես կոչված «քիմիական ձկնորսության» ընթացակարգով։ AFM չիպերի երկրորդ տեսակը օգտագործվել է անալիտի լուծույթից կենսահատուկ կերպով մեկուսացված սպիտակուցների MS նույնականացման համար: Կենսաբանական զոնդերը նախկինում անշարժացվել են այդ չիպերի մակերեսին՝ աշխատանքային տարածքներում: Որպես կենսաբանական զոնդեր օգտագործվել են մոնոկլոնալ հակամարմիններ վիրուսային հեպատիտ B և C-ի մարկերային սպիտակուցների դեմ (BFB և BFC) կամ ապտամերրը gpl20 սպիտակուցի և թրոմբինի դեմ: Բիոսպեցիֆիկ ձկնորսական պրոցեդուրաների համար ինկուբացվել են կովալենտորեն անշարժացված զոնդերի մոլեկուլներով չիպեր: % անալիտի լուծույթում, որը պարունակում է միայն հայտնաբերելի սպիտակուց կամ արյան շիճուկի նմուշներ

Առաջին տիպի AFM չիպերի մակերևույթի վրա կովալենտորեն անշարժացված մոդելային սպիտակուցների MS նույնականացման առաջադրանքը կատարելու համար աշխատանքում օգտագործվել են հետևյալը՝ ավիդին (Agilent, ԱՄՆ), HSA (Agilent, ԱՄՆ), P450 VMZ (խնդրում ենք տրամադրել): Պրոֆեսոր Ա.Վ.Մունրոյի կողմից, Մանչեսթերի համալսարան, Մեծ Բրիտանիա), թրոմբին (Sigma, ԱՄՆ), a-FP և anti-a-FP (USBio, ԱՄՆ); Երկրորդ տիպի AFM չիպերի մակերևույթի սպիտակուցների MS նույնականացման առաջադրանքը կատարելու համար, որոնք կենսահատուկ կերպով մեկուսացված են անալիտային լուծույթից, որպես զոնդային մոլեկուլներ օգտագործվել են մոնոկլոնալ հակամարմիններ (MABs)՝ հակա-HCVcore (Virogen, ԱՄՆ), հակա-HBVcore: (Մոլեկուլային ախտորոշման գիտահետազոտական ​​ինստիտուտ, Մոսկվա), հակա-HBsAg (Ալդևրոն, ԱՄՆ), որպես թիրախային մոլեկուլներ՝ HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, ԱՄՆ) և HBsAg (Ալդևրոն, ԱՄՆ), gpl20 (Sigma, ԱՄՆ), տրոպոնին (USBio, ԱՄՆ).

Բացի այդ, աշխատանքում օգտագործվել են հետևյալ նյութերը՝ ացետոնիտրիլ, իզոպրոպանոլ, մրջնաթթու, թորած ջուր (Merck, ԱՄՆ), տրիֆտորքացախաթթու (TFA), ամոնիումի բիկարբոնատ (Սիգմա, ԱՄՆ), ա-ցիանո-4-հիդրօքսիցինամիկ թթու ( HCCA), դիհիդրօքսիբենզոյան թթու-(DHB) (Bruker Daltonics, Գերմանիա), տրիպսին (Promega, ԱՄՆ):

AFM հետազոտության համար արյան շիճուկի նմուշները տրամադրվել են Ռուսաստանի պետական ​​բժշկական համալսարանի երեխաների վարակիչ հիվանդությունների ամբիոնի կողմից, Ռոսպոտրեբնաձորի համաճարակաբանության կենտրոնական գիտահետազոտական ​​ինստիտուտի, MNIIIEM «n. Նմուշները հաստատվել են պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (PCR) մեթոդի միջոցով՝ օգտագործելով «Amplisens HCV Monitor» թեստային համակարգը (Ռուսաստանի Դաշնության Առողջապահության նախարարության Համաճարակաբանության Կենտրոնական Հետազոտական ​​Ինստիտուտ, Մոսկվա):

AFM վերլուծությունն իրականացվել է Նանոբիոտեխնոլոգիայի լաբորատորիայում՝ IBMC RAMS: AFM չիպի մակերեսին սպիտակուցների և անտիգեն/հակամարմինների համալիրների հաշվարկն իրականացվել է սպիտակուցների համապատասխան պատկերների և դրանց բարդույթների բարձրությունների հարաբերակցության հիման վրա, որոնք չափվում են AFM-ով, ըստ նկարագրված մեթոդի: Օգտագործվել է ACM NTEGRA-ի կողմից (NT-MDT, Ռուսաստան): AFM չափումները կատարվել են կիսակոնտակտային ռեժիմով: Որպես զոնդեր օգտագործվել են NT-MDT NSG10 շարքի կոնսերներ: Ասեղների կորության բնորոշ շառավիղը 10 նմ էր, իսկ ռեզոնանսային հաճախականությունը տատանվում էր 190-ից 325 կՀց: Չիպերի սկանավորման տարածքը 400 մկմ2 էր: Յուրաքանչյուր չափում կատարվել է առնվազն 3 անգամ։

AFM չիպի մակերեսին սպիտակուցների և ապտամերների անշարժացումն իրականացվել է հետևյալ ընթացակարգով.

2 մկլ ծավալով սպիտակուցային լուծույթին (0,1 մկՄ) ավելացրել են 8 մկլ NHS/EDC խառնուրդի լուծույթ (v/v=l/l) և մանրակրկիտ խառնել: Ստացված խառնուրդը քսել են սիլանացված չիպի մակերեսին և 2 րոպե ինկուբացրել սենյակային ջերմաստիճանում: Այնուհետև չիպը երկու անգամ լվանում է թերմոշարկիչով 1 մլ դեոնացված ջրով 800 պտ/րոպում և 37°C ջերմաստիճանում: AFM չիպի մակերեսին սպիտակուցի անշարժացման որակը վերահսկվել է ատոմային ուժի մանրադիտակով:

AEM չիպի քիմիական ակտիվացված մակերեսի վրա ապտամերների անշարժացումն իրականացվել է հետևյալ կերպ. DMSO/էթանոլում (v/v=l/l) 4-ում 1,2 մՄ կոնցենտրացիայում DSP-ի պաշարային լուծույթին ավելացվել է PBS բուֆերի 50 մՄ լուծույթ (pH 7,4) նաև 1/1 ծավալային հարաբերակցությամբ: Այսպիսով ստացված աշխատանքային լուծույթը կիրառվել է AFM չիպի մակերեսին և 10 րոպե ինկուբացվել: Դրանից հետո 10 րոպե 15C ջերմաստիճանում 1 մլ ծավալով էթանոլի 50% լուծույթով լվացվել է: AFM չիպի ակտիվացված գոտու վրա կիրառվել է ապտամերային լուծույթ 3 JIM կոնցենտրացիայով և 4 րոպե ինկուբացրել՝ 800 պտ/րոպե արագությամբ խառնելով: DSP խաչաձև կապող ամինո խմբերի արգելափակումն իրականացվել է 5 մՄ տրիս-HCl լուծույթի առկայության դեպքում 10 րոպե 37°C ջերմաստիճանում: Լվացքի վերջնական փուլն իրականացվել է երկու անգամ: ջրային լուծույթծավալը 1 մլ 10 րոպե 25C ջերմաստիճանում։

Տրիպսինոլիտիկ խառնուրդ, որը պարունակում է 150 մՄ NH4HCO3 բուֆերային լուծույթ, ացետոնիտրիլ, 0,5 Մ գուանիդինի հիդրոքլորիդ և գլիցերին (pH 7,4) անշարժացված զոնդ մոլեկուլներով կիրառվել է AFM չիպի մակերեսին: Այնուհետև բուֆերային լուծույթին ավելացվել է 0,5 մկլ խոզի տրիփսինի ձևափոխված լուծույթ 0,1 մկմ կոնցենտրացմամբ: AFM չիպը 2 ժամ ինկուբացվել է խոնավ միջավայրում 45C մշտական ​​ջերմաստիճանում, դրա մակերեսին կրկին ավելացվել է 0,5 մկլ տրիփսինի լուծույթ (0,1 մկՄ), և ինկուբացիան շարունակվել է ևս 12 ժամ: Տրիպսինոլիտիկ խառնուրդը լվացվել է AFM չիպի մակերեսից 10 մկլ լուծույթով, որը պարունակում է 70% ացետոնիտրիլ 0,7% տրիֆտորքացախաթթվի (TFA): AFM չիպի մակերևույթից ստացված հիդրոլիզատը չորացվել է վակուումային գոլորշիչում 45°C և 4200 պտ/րոպե արագությամբ: Այնուհետև, պեպտիդային խառնուրդը լուծարվեց 10 մկլ 5% մրջնաթթվի լուծույթում կամ 10 մկլ 0,7% TFA լուծույթում՝ հետագա MS վերլուծության համար:

MALDI տեսակի իոնացման MS վերլուծության ժամանակ նմուշները պատրաստվել են հետևյալ կերպ. 10 մկլ ծավալով 0,7% TFA լուծույթում լուծված նմուշները խտացվել և աղազրկվել են ZipTip C18 միկրոթափերով (Միլիպոր, ԱՄՆ)՝ ըստ արտադրողի արձանագրության և խառնվել HCCA կամ DHB պարունակող մատրիցայի հագեցած լուծույթի հետ 50% ացետոնիտրիլի լուծույթով։ 0 .7% TFA: Ստացված խառնուրդը կիրառվել է MTP չափի MALDI թիրախի վրա:

- «քիմիական ձկնորսությամբ» բռնված սպիտակուցների նույնականացում AFM չիպի մակերեսին անալիտի լուծույթից

Վրա այս փուլը փորձարարական աշխատանք MS սպեկտրները ստացվել են մոդելային սպիտակուցների համար, որոնք քիմիապես անշարժացած են AFM չիպերի մակերեսին անալիտի լուծույթից: Ուսումնասիրված սպիտակուցների կոնցենտրացիաների շրջանակը ավիդինի, HSA-ի, հակա-aFP-ի անալիտային լուծույթում եղել է 10"-10"9 Մ, տրոպոնին, aFP և P450 VMZ՝ 10"6-10"8 Մ:

Կատարվել է MS վերլուծություն 6 տեսակի սպիտակուցների համար՝ տարբեր իրենց ծագմամբ, մոլեկուլային քաշով, տրիպսինոլիզի տեղամասերի քանակով և տարածական հասանելիությամբ, ամինաթթուների հաջորդականության հիդրոֆոբության աստիճանով (հիդրոֆոբ ամինաթթուների և հիդրոֆիլների հարաբերակցությունը), որոնք կովալենտորեն անշարժացվել են AFM չիպի մակերեսին անալիտի լուծույթից (Աղյուսակ 1): Այս փորձարկումներում օգտագործվել են AFM չիպեր, որոնք պարունակում էին աշխատանքային և վերահսկման գոտիները։ Աշխատանքային գոտին AFM չիպի մակերեսի քիմիապես ակտիվացված տարածք էր, որի վրա մոդելային սպիտակուցները «քիմիապես ձկնորսվեցին». Վերահսկիչ գոտին չիպի մակերեսի քիմիապես ոչ ակտիվ շրջանն էր: Վիզուալացված գրավված մոլեկուլների հաշվարկը գրանցվել է AFM-ի միջոցով: Վերոնշյալ մոդելային սպիտակուցների համար ստացված AFM վերլուծության փորձարարական տվյալները, մասնավորապես, AFM չիպի աշխատանքային տարածքի մակերեսին բռնված մոլեկուլների քանակը ներկայացված են Աղյուսակ 2. սպիտակուցը անալիտային լուծույթում:

Ինչպես երևում է Աղյուսակ 2-ից, ներկայացված բոլոր սպիտակուցների համար AFM չիպի աշխատանքային տարածքում գրանցված մոլեկուլների թիվը եղել է -1040 մոլեկուլ: MS դետեկտորների զգայունության սահմանը մոտ 105 մոլեկուլ է: Այսպիսով, ներկայացված մոդելային սպիտակուցների համար իրականացվել է AFM չիպի մակերեսի հաջող անդառնալի անշարժացում, և AFM-ում գրանցված սպիտակուցային օբյեկտների թիվը բավարար է հետագա MS նույնականացման համար: Միևնույն ժամանակ, մոդելային սպիտակուցների նվազագույն գրանցված կոնցենտրացիան ինկուբացիոն լուծույթում եղել է բավականին ցածր՝ 10"-10" Մ.

Նմուշների զանգվածային սպեկտրաչափական անալիզը կատարվել է MALDI և ESI իոնացման տեսակների միջոցով: AFM չիպը 10"9 Մ կոնցենտրացիայով ավիդինի համապատասխան լուծույթում ինկուբացիայից հետո: Այս սպեկտրների վերլուծությունը հնարավորություն տվեց հուսալիորեն նույնականացնել ավիդինը (Gallus Gallus) նրա երկու պրոտեոտիպային պեպտիդներով՝ SSVNDIGDDWK (m/z=618.6) և VGINIFTR: (m/z= 460.4): Երկու պեպտիդներն ունեին իրենց կրկնակի լիցքավորված իոնների հստակ գագաթներ (MS-սպեկտրներ): AFM-MS վերլուծության միջոցով AFM-չիպի ​​քիմիապես ակտիվացված աշխատանքային գոտու անալիտի լուծույթում ինկուբացիայից հետո 10"8 Մ կոնցենտրացիայով սպիտակուց, հայտնաբերվել է ևս մեկ փոքր սպիտակուց՝ տրոպոնին I։ MS և MS/MS սպեկտրները, որոնք համապատասխանում են պեպտիդին կրկնակի լիցքավորված 1449 Da իոնին, ներկայացված են Նկար 3-ում։ հնարավոր է արժանահավատորեն նույնականացնել և նույնականացնել մարդու տրոպոնինը (gi 2460249) AFM չիպի մակերեսին ավելի քան 95% հավանականությամբ:

Նկար 5-ը ցույց է տալիս գնդային սպիտակուցի՝ մարդու շիճուկի ալբումինի (HSA) տանդեմի մասնատման սպեկտրները, որոնք տրանսպորտային գործառույթներ են կատարում արյան պլազմայում: Սպեկտրները ստացվել են AFM չիպի քիմիապես ակտիվացված աշխատանքային գոտուց ինկուբացիայից հետո 10"9 Մ կոնցենտրացիայով համապատասխան ալբումինի լուծույթում: Այս սպեկտրների վերլուծությունը հնարավորություն է տվել հուսալիորեն նույնականացնել մարդու ալբումինը նրա երկու պրոտեոտիպային պեպտիդներով՝ VPQVSTPTLVEVSR: (m/z=756.5) և YLYEIAR (m/z=464.3) Երկու պեպտիդներն էլ ունեին իրենց կրկնակի լիցքավորված իոնների լավ սահմանված գագաթները (MS սպեկտրներ):

Մարդու շիճուկի ալբումինի լուծույթում ինկուբացված AFM չիպի քիմիապես ակտիվացված մակերևույթից տրիպսինացված առարկաների MS/MS սպեկտրը (C=10 9 M): VPQVSTPTLVEVSR պեպտիդ՝ m/z=756,5 (A), YLYEIAR պեպտիդ՝ m/z=464,3 (B): Փորձարարական պայմաններ. չափումները կատարվել են LC/MSD Trap XCT Ultra զանգվածային սպեկտրոմետրի վրա (Agilent):

Այսպիսով, MS վերլուծությունը հնարավորություն տվեց բացահայտել AFM-ի միջոցով հայտնաբերված սպիտակուցները: Ստացված տվյալների հիման վրա բացահայտվել է կապ AFM չիպի մակերեսի վրա հայտնաբերված պրոտեոտիպային պեպտիդների քանակի և անալիտի լուծույթում ցանկալի սպիտակուցի պարունակության միջև: Նման կախվածությունը, օրինակ, P450 VMZ և HSA սպիտակուցների համար, որոնք կովալենտորեն անշարժացված են AFM չիպի քիմիական ակտիվացված մակերեսի վրա, ցույց է տրված Նկար 6-ում: Ինչպես երևում է Նկար 6-ում, այնքան բարձր է սպիտակուցի կոնցենտրացիան անալիտի լուծույթում ( -KG6 M), այնքան մեծ է պեպտիդների թիվը, որը կարող է հուսալիորեն նույնականացվել ինչպես MALDI-MS, այնպես էլ ESI-MS վերլուծության դեպքում: Անալիտի լուծույթում վերլուծված սպիտակուցների միջև 10"6-10"9 Մ կոնցենտրացիայի միջակայքում հայտնաբերված պեպտիդների քանակի միջև զգալի տարբերություններ չեն նկատվել:

Անալիտի մոլեկուլների հայտնաբերված պեպտիդների քանակի կախվածությունը ինկուբացիոն լուծույթում սպիտակուցի կոնցենտրացիայից: (A) - HSA, VMZ մոդելային սպիտակուցների պեպտիդների խառնուրդի վերլուծություն զանգվածային սպեկտրոմետրերի վրա MALDI տիպի իոնացմամբ Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Գերմանիա) և Autoflex III (Bruker Daltonics, Գերմանիա); (B) - HSA, VMZ մոդելային սպիտակուցների պեպտիդների խառնուրդի վերլուծություն զանգվածային սպեկտրոմետրի վրա ESI տիպի իոնացման LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent, ԱՄՆ):

Ստացված արդյունքները թույլ տվեցին եզրակացնել, որ AFM-MS (MALDI և ESI) հնարավորություն է տալիս հայտնաբերել և նույնականացնել AFM չիպի մակերևույթի անալիտային լուծույթից կովալենտորեն արդյունահանված սպիտակուցի մոլեկուլները, որոնք տարբերվում են իրենց ֆիզիկաքիմիական հատկություններով:

Միևնույն ժամանակ, AFM չիպի կառավարման գոտում (չակտիվացված) անալիտային լուծույթում ինկուբացիայից հետո AFM մեթոդը չի հայտնաբերել սպիտակուցի մոլեկուլներին բարձրությամբ համապատասխանող առարկաների առկայություն չիպի մակերեսի վրա: MS վերլուծությունը նույնպես չի հայտնաբերել սպիտակուցային բնույթի առարկաներ: Այսպիսով, փորձնականորեն ապացուցվեց, որ AFM-ն համարժեք կերպով գրանցում է ցանկալի առարկաները՝ անալիտի սպիտակուցային մոլեկուլները։

Այս աշխատանքի հաջորդ փուլը AFM-MS համակցված սխեմայի մշակումն էր za-ի լուծույթից վերականգնված սպիտակուցների նույնականացման համար: biospecific փոխազդեցությունների միջոցով:

Զանգվածային սպեկտրոմետրիկ վերլուծության սխեման լուծույթից սպիտակուցներ բիոսպեցիֆիկ AFM ձկնորսության դեպքում ներկայացված է Նկար 7-ում: Համաձայն վերոհիշյալ սխեմայի, զոնդի մոլեկուլները նախ անշարժացվել են AFM չիպերի աշխատանքային տարածքի մակերեսին, որոնք մոնոկլոնալ1 հակամարմիններ վիրուսային հեպատիտ B և C սպիտակուցային մարկերների դեմ կամ ապտամերներ ՄԻԱՎ-1 գլիկոպրոտեին gpl20-ի և թրոմբինի սպիտակուցների դեմ, մինչդեռ վերահսկման գոտու մակերեսը չի պարունակում անշարժացված զոնդի մոլեկուլներ: Զոնդի մոլեկուլների անշարժացման որակի հսկողությունն իրականացվել է AGM-visualization-ով: Այնուհետև նման չիպը ինկուբացվել է հետազոտվող սպիտակուցը պարունակող անալիտային լուծույթում: Չիպի մակերեսի վրա ոչ հատուկ կլանված մոլեկուլների լվացման փուլից և AFM չիպի մակերեսի հետագա զանգվածային սպեկտրոմետրիկ վերլուծության համար նմուշի պատրաստման փուլից հետո իրականացվել է AFM հայտնաբերված սպիտակուցների MS վերլուծություն:

Այս բաժնի փորձարարական մասը ներառում էր վերլուծության երկու փուլ: Առաջին փուլում անհրաժեշտ էր իրականացնել AFM չիպի վրա կովալենտորեն անշարժացված սպիտակուցային զոնդերի մոլեկուլների MS նույնականացում, իսկ երկրորդ փուլում՝ համապատասխան գործընկեր մոլեկուլների վրա բռնված թիրախային սպիտակուցներ լուծույթից կամ արյան շիճուկի նմուշներից՝ կենսասպեցիֆիկության պատճառով: փոխազդեցություններ. Այդ նպատակով իրականացվել է AFM չիպերի մակերևույթի վրա կովալենտորեն անշարժացած MCA-ի MS վերլուծություն HCV և HBV մարկերային սպիտակուցների դեմ՝ anti-HCVcore և anti-HBVcore: Anti-HCVcore և anti-HBVcore սպիտակուցների դեմ mAbs-ների համար այս աշխատանքում առաջին անգամ ստացվել են տանդեմ մասնատման սպեկտրներ և պեպտիդային քարտեզի սպեկտրներ:

պահեստավորման բարձր հզորություն, որը երաշխավորում է դրանց ակտիվ կենսաբանական սկզբունքը:

ԳՐԱԿԱՆՈՒԹՅՈՒՆ

1. Կլիչկովա Գ.Յու. Կաղամարի, սաղմոնի և թառափի աճառային հյուսվածքից համալիր պատրաստման տեխնոլոգիայի մշակում // Vseros-ի նյութեր. Ինտերնետ կոնֆ. երիտասարդ գիտնականներ. - Vladivostok: TIN-RO-Center, 2004. - S. 164-170:

2. Metzler D. Biochemistry. T. 2. - M., 1980. - 605 p.

3. Սուխովերխովա Գ.Յու. Հիդրոբիոնտների աճառային հյուսվածքի կենսաքիմիական բնութագրերը և սննդի համար սննդային հավելումների տեխնոլոգիան. ... cand. տեխ. գիտություններ. - Վլադիվոստոկ, 2006. - 157 էջ.

4. Սիտովա Մ.Վ. Ամուրի թառափաձկան համալիր վերամշակման գիտական ​​հիմնավորումը՝ թեզի համառոտագիր. դիս. ... cand. տեխ. գիտություններ

M.: VNIRO, 2005. - 24 p.

Սննդի կենսատեխնոլոգիայի բաժին

Ստացվել է 07.02.07թ

ԿԵՐԱՏԻՆ ֆերմենտային հիդրոլիզատի սպիտակուցային բաղադրիչների նույնականացում

Չ.Յու. ՇԱՄԽԱՆՈՎ, Լ.Վ. ԱՆՏԻՊՈՎԱ

Գրոզնիի պետական ​​նավթային ինստիտուտ Վորոնեժի պետական ​​տեխնոլոգիական ակադեմիա

Մսի և թռչնամսի վերամշակման արդյունաբերության երկրորդային ռեսուրսների վերամշակման ամենաարդյունավետ միջոցներից մեկը սննդի հիդրոլիզատորներ ստանալու ժամանակակից կենսատեխնոլոգիական մեթոդների օգտագործումն է: Ստացված արտադրանքի ֆունկցիոնալ և տեխնոլոգիական հատկությունները կախված են դրա սպիտակուցային բաղադրիչների կենսաքիմիական բաղադրությունից և մոլեկուլային քաշից:

Սպիտակուցների մոլեկուլային քաշը որոշելու ֆիզիկաքիմիական մեթոդների կիրառման ժամանակ արդյունքը կախված է ոչ միայն զանգվածից, այլև սպիտակուցի մոլեկուլի էլեկտրական լիցքից և ձևից, հատկապես սպիտակուցի դիֆուզիայի արագությունը փոխելիս, ձգողականության մեջ նստվածքի արագությունը: դաշտ. Այս առումով սպիտակուցների մոլեկուլային կշիռները որոշելիս նախընտրելի է օգտագործել վիճակագրական մեթոդներերբ սպիտակուցի լուծույթը գտնվում է հավասարակշռության մեջ, օրինակ՝ այն գելով լցված սյունակի միջով անցնելիս։

Աշխատանքի նպատակն է որոշել կերատինային ֆերմենտային հիդրոլիզատի սպիտակուցային բաղադրիչների M մոլեկուլային զանգվածը և նրա կենսաքիմիական բաղադրությունը։

Կերատինի հիդրոլիզատի սպիտակուցային բաղադրիչների մոլեկուլային քաշը որոշելու համար օգտագործվել է գել ֆիլտրման մեթոդը: Sephadex v-100 (միջին, մասնիկների տրամագիծը 40-120 մկմ) օգտագործվել է մասնատման սահմաններով 4000-150000 Da:

46,0 x 1,9 սմ սյունակ լցված է Sephadex-ով, որը մշակվել է 0,02 Մ ունիվերսալ բուֆերով, pH 7,0: Վրան քսել են 1,5 սմ3 -7 մգ/սմ3 լուծույթ՝ կերատինի հիդրոլիզատ և ողողել նույն ունիվերսալ բուֆերով՝ 12 սմ3/ժ արագությամբ: Հավաքվել են 3 սմ3 ֆրակցիաներ, այնուհետև դրանցում սպիտակուցի պարունակությունը որոշվել է սպեկտրոֆոտոմետրիկ եղանակով SF-46-ի վրա 280 նմ տիրույթում: Կերատինի հիդրոլիզատի ֆրակցիաների մոլեկուլային քաշը որոշելու համար Sephadex-ով սյունակը նախապես տրամաչափվել է նույն պայմաններում՝ օգտագործելով մի քանի մաքուր (մարկեր) սպիտակուցներ հայտնի M-ով: Կալիբրացիայի կորը կառուցվել է ^ M-ի և ծավալի միջև գծային հարաբերությունների միջոցով:

eluate Ye, ազատված սյունակից: Աղյուսակում. 1-ը ցույց է տալիս մարկերային սպիտակուցների որոշ ֆիզիկաքիմիական բնութագրեր:

Աղյուսակ 1

Մարկերային սպիտակուց M, Այո 1§ m V, սմ3

Լիզոզիմ 13930 4.143 54

Տրիպսին 25700 4.409 48

Պերօքսիդազ 34000 4.531 45

Տավարի ալբումին 68000 4.832 36

Կապույտ դեքստրան 2000000 6.301 21

Ջրում լուծվող մասնաբաժինը

կերոպեպտիդ<10000 2,845 72

Կերատինի հիդրոլիզատի ջրում լուծվող մասնաբաժինը թողնում է սյունը շատ ավելի փոքր ծավալով, քան նվազագույն մոլեկուլային քաշ ունեցող մարկերային սպիտակուցի լիզոզիմը: Հետևաբար, կերատինի հիդրոլիզատում (կերոպեպտիդ) չկան սպիտակուցային ֆրակցիաներ M> 13930 Da-ով: Հիդրոլիզի արտադրանքի մոտավոր զանգվածը 10000 Da-ից ցածր է, որը որոշվում է Sephadex B-100 մարկերային սպիտակուցների վրա գելային ֆիլտրացմամբ: Գծային կախվածությունՍպիտակուցների ^ M-ի և սյունակից ազատված էլուատի Ye ծավալի միջև ներկայացված է նկ. 1 (1 - կապույտ դեքստրան; 2 - տավարի ալբումին; 3 - պերօքսիդազ; 4 - տրիպսին; 5 - լիզոզիմ; 6 - կերոպեպտիդի ջրում լուծվող մասնաբաժին):

Ուսումնասիրված 10000-5000 Da միջակայքում մարկերային սպիտակուցների բացակայության պատճառով ջրում լուծվող սպիտակուցային ֆրակցիայի որոնումն իրականացվել է ծակոտկեն օգտագործմամբ

աղյուսակ 2

M, Այո Լուծվող սպիտակուցներ և պեպտիդներ, մգ/սմ3 Ընդհանուր պեպտիդներ և ամինաթթուներ, μg/cm3 տիրոզին, μmol/cm3 վերականգնող նյութեր, μg/cm3

0-10000 5,64 7337 7,835 2815

0-5000 4,21 5278 5,960 2272

% ելակետային 74.6 71.9 76.1 80.7

UPM-100 և UAM-50 դասերի թաղանթներ լաբորատոր ուլտրաֆիլտրացիոն միավորի վրա (ՓԲԸ NPO Tekhkon): Սխեման ներառում էր ինքնին տեղադրումը կերոպեպտիդի 5% լուծույթով, որը դրված էր մագնիսական խառնիչի վրա դրա մշտական ​​խառնման համար: Սպիտակուցի լուծույթի արդյունավետ տարանջատման համար սեղմված օդը մատակարարվում էր ապարատի վերին մասում ճնշման տակ: Հիդրոլիզի արտադրանքը անցնում էր ծակոտկեն թաղանթներով, հերթափոխով փոխարինվում՝ կախված ուլտրաֆիլտրատի ցանկալի մոլեկուլային քաշից, դեպի ապարատի ստորին հատվածը և հավաքված ընդունող անոթում: Ստացված ուլտրաֆիլտրատներում որոշվել են մի շարք կենսաքիմիական պարամետրեր, որոնք հնարավորություն են տվել գնահատել հիդրոլիզի արտադրանքի բաշխումն ըստ մոլեկուլային քաշի (Աղյուսակ 2):

Կերոպեպտիդը պարունակում է ցածր մոլեկուլային քաշի սպիտակուցներ՝ M 5000-10000 Da: Նրանց զանգվածային բաժինը գնահատվում է որպես 0-10000 և 0-5000 Da կոտորակների ցուցումների տարբերություն և կազմում է 1,43 մգ/սմ3: Այս մասնաբաժինը նաև դրական արձագանք է տվել նինհիդրինային ռեակցիային (2059 մկգ/սմ3), թիրոզինին (1,875 մկմոլ/սմ3) և վերականգնող նյութերին (543 մկգ/սմ3)։ Այնուամենայնիվ, հիդրոլիզի արտադրանքի հիմնական մասնաբաժինը կենտրոնացած է Մ-ի ցածր մոլեկուլային զանգվածում< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.

Կերոպեպտիդի ջրում լուծվող սպիտակուցային ֆրակցիաների մոլեկուլային քաշի հետագա որոշումն իրականացվել է Sephadex B-25-ի վրա (միջին, մասնիկների տրամագիծը 50-150 մկմ), ինչը թույլ է տալիս այն սահմանել 1000-5000 Da ֆրակցիոն տիրույթում: Գելի ֆիլտրման պայմանները մնացել են անփոփոխ: Ըստ

Ֆրակցիաներում սպիտակուցի որոշման արդյունքներն օգտագործվել են էյուցիոն պրոֆիլի կառուցման համար: Բոլոր ֆրակցիաներում, բացի սպիտակուցից, որոշվել է ցածր մոլեկուլային զանգվածի նյութերի պարունակությունը նինհիդրին մեթոդով, թիրոզինով և վերականգնող նյութերով (RS), որոշվել է նաև սպիտակուցային ֆրակցիաների քանակական բաշխումը։ Նկ. Նկար 2-ը ցույց է տալիս ֆերմենտային կերատինի հիդրոլիզատի գելային քրոմատոգրամը Sephadex B-25-ի միջոցով (կոր 1 - սպիտակուց; 2 - նինհիդրինի թեստ; 3 - թիրոզին; 4 - PB):

Այս դեպքում սպիտակուցը հայտնաբերվում է երկու փոքր գագաթների տեսքով գրեթե հենց առաջին ֆրակցիաներում։ Սպիտակուցի զանգվածային բաժինը թիվ 1-8 ֆրակցիաներում 3-24 սմ3-ից

ունի բավականին բարձր արժեքներ և կազմում է 0,12-0,18 մգ/սմ3 (կոր 1):

Արտադրանքի հիմնական մասը դուրս է եկել սյունակից որպես սպիտակուցի առավելագույն գագաթ՝ 27 սմ3 էլուատ ծավալով (ֆրակցիա թիվ 9, յուրաքանչյուրը 3 սմ3 էլուատ)։ Այս ֆրակցիայում սպիտակուցի զանգվածային բաժինը գրանցվել է 0,66 մգ/սմ3 մակարդակում, որը 3-4 անգամ ավելի է, քան մյուս ուսումնասիրված ֆրակցիաներում։

Կերոպեպտիդի հետագա էլյուցիան 36-96 սմ3 ծավալային միջակայքում հայտնաբերել է երեք գագաթ՝ դրանցում սպիտակուցի զանգվածային մասի նվազմամբ 0,08 մգ/սմ3-ից ոչ ավելի: Կերոպեպտիդային ամբողջական լուծույթը զտվում է 96 սմ3 վերջնական ծավալով:

Թիվ 9 ֆրակցիայում հայտնաբերվել է առկա ՌՍ-ի ողջ քանակությունը՝ 66 մկգ/սմ3 զանգվածային բաժիններ (կոր 4): Նինհիդրինի ռեակցիան օգտագործվել է գելային քրոմատագրության մեջ՝ պարզելու հիդրոլիզի արտադրանքի բաշխումն ըստ մոլեկուլային քաշի: Պարզվել է, որ երբ նինհիդրինի և սպիտակուցային արտադրանքի ավելցուկային քանակությունը փոխազդում է ազատ MH2 խմբի հետ, և կախված այդ խմբերի քանակից, հնարավոր է գտնել սպիտակուցը:

RV, μg/cm3 175 co D 5 o l s; .7 0

100 125 X - 3 co o o. 0.5

80 § 100 2 _ n 0.4

60 1 իսին, 7 սլ 0.3

40 1 լ 5 o - (P 2 o I- 0.2

20 25 _ 2 այ Օ 0,1

6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 Վ, սմ

ածանցյալներ սեֆադեքսի միջոցով էլյույացիայի միջոցով: Այսպիսով, նինհիդրինի ցածր զանգվածային բաժինը (4–6 մկգ/սմ3) շատ ճշգրիտ արտացոլում է ազատ ամինային խմբերի քանակը և որոշում Մ 3000–5000 Da-ով բարձր մոլեկուլային պեպտիդների առկայությունը J# 1–8 ֆրակցիաներում (կոր 2) . Հայտնի է, որ հիդրոլիզի արտադրանքի մոլեկուլային քաշի չափման տիրույթում< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Այո: Նինհիդրինի նմուշի էլյուցիոն պրոֆիլի հետագա վերլուծությունը (ֆրակցիաներ թիվ 12-36) բացահայտեց գագաթնակետ, որը չէր համապատասխանում նրա սպիտակուցի կոնցենտրացիային, ինչպես նկատվել էր նախորդ ֆրակցիաների պեպտիդների համար: Ցածր մոլեկուլային զանգվածի նյութերի զանգվածային բաժինը No23 ֆրակցիայում կազմել է 157 մկգ/սմ3, որն ավելի քան 2 անգամ ավելի է, քան թիվ 9 ֆրակցիայի պեպտիդների համարը: Հիդրոլիզի արտադրանքի առկայությունը ազատ ամինաթթուների տեսքով վերջին կոտորակ. Նրան պատկանելը և թիրոզին ամինաթթվին (0,06 մկմոլ/սմ3) նշված դիրքորոշման ևս մեկ ապացույց է։

Այսպիսով, կերատինի հիդրոլիզատի գելային զտումը Sephadex G-100 և G-25 միջոցով ցույց է տալիս դրա մեջ ցածր մոլեկուլային քաշի լուծույթի առկայությունը:

իմ սպիտակուցը (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Այո: Այս դեպքում սպիտակուցային շղթաները պարունակում են 5-20 ամինաթթուների մնացորդներ։ Կարևոր է ընդգծել, որ թիվ 9 ֆրակցիան միաժամանակ ռեակցիաներ է տալիս բիուրետային կապին, նինհիդրինին, թիրոզինին և ՌՎ-ին։ Այս հատկանիշը ենթադրում է ածխաջրերի առկայությունը կերատինային սպիտակուցում և դրանց անմիջական կապը սպիտակուցի հետ որպես մեկ համալիրի մաս:

ԳՐԱԿԱՆՈՒԹՅՈՒՆ

1. Անտիպովա Լ.Վ., Պաշչենկո Լ.Պ., Շամխանով Չ.Յու., Կուրիլովա Է.Ս. Սննդի կերատինի հիդրոլիզատի ստացում և բնութագրում // Գյուղատնտեսական հումքի պահպանում և մշակում. - 2003. - թիվ 7:

2. Անտիպովա Լ.Վ., Շամխանով Չ.Յու., Օսմինին Օ.Ս., Պոժալովա Ն.Ա. Կերատին պարունակող հումքի ֆերմենտային հիդրոլիզի գործընթացի կենսաքիմիական բնութագրերը թռչնաբուծության վերամշակման արդյունաբերությունում Izv. համալսարանները։ Սննդի տեխնոլոգիա. - 2003. - Թիվ 5-6:

3. Անտիպովա Լ.Վ., Շամխանով Չ.Յու., Օսմինին Օ.Ս. Համա-

Կերոպեպտիդների արտադրության տեխնոլոգիայի բարելավում փետուր հումքից // Մսի արդյունաբերություն. - 2004. - No 3. - S. 44-47.

4. Ռոգով Ի.Ա., Անտիպովա Լ.Վ., Դունչենկո Ն.Ի., Ժերեբ-ցով Ն.Ա. Սննդի քիմիա. 2 գրքում. Գիրք. 1. Սպիտակուցներ՝ կառուցվածք, գործառույթներ, դեր սնուցման մեջ։ - Մ.: Կոլոս, 2000. - 384 էջ.

5. Օստերման Լ.Ա. Սպիտակուցների և նուկլեինաթթուների քրոմատոգրաֆիա: - Մ.: Նաուկա, 1985. - 536 էջ.

6. Կոչետով Գ.Ա. Գործնական ուղեցույց ֆերմենտաբանության համար. - 2-րդ հրատ., վերանայված: և լրացուցիչ - Մ.: Ավելի բարձր: դպրոց, 1980. - 272 էջ.

Սննդի տեխնոլոգիաների բաժին Մսի և մսամթերքի տեխնոլոգիայի բաժին

Ստացե՞լ եք 0S.02.0: Գ.

ԾԽԵԼՈՎ ԷՔՍՏՐԱՏՆԵՐԻ ԲԱՂԱԴՐԻՉՆԵՐԻ ՊԱՀՊԱՆՄԱՆ ԱԿՑԻԱՅԻ ՄԵԽԱՆԻԶՄԻ ՏԵՍԱԿԱՆ ՀԻՄՆԱՑՈՒՄԸ.

Ս.Վ. ԶՈԼՈՏՈԿՈՊՈՎԱ, Ի.Ա. ՊԱԼԱԳԻՆԱ

Աստրախանի պետական ​​տեխնիկական համալսարան Սարատովի պետական ​​սոցիալ-տնտեսական համալսարանի Աստրախանի մասնաճյուղ

Վերջին տարիների հետազոտությունների կարևոր ոլորտը տարբեր սննդային հավելումների ազդեցության ուսումնասիրությունն է ոչ միայն համի և բույրի, այլև սննդամթերքի պահպանման ժամկետի ավելացման վրա: Հին ժամանակներից կծու բույսերը օգտագործվել են պահածոյացման համար, սեղանի աղ, ծխելը և այլն։ Վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ ներկայումս շուկան գրավում են ծխի մզվածքները։ Բնակչության շրջանում հատկապես տարածված են ապխտած համով մթերքները, իսկ ավանդական ծխելը կորցնում է իր դիրքերը՝ դառնալով չծխող:

Էկոլոգիապես օգտակար և խոստումնալից են քաղվածքները, որոնք ստացվում են մեղմ պայմաններում:

G.I.-ն տասնամյակներ շարունակ աշխատել է արդյունահանման տեխնոլոգիայի բարելավման վրա: Կասյանով - Ռուսաստանի Դաշնության գիտության և տեխնիկայի վաստակավոր գործիչ, Ռուսաստանի Դաշնության վաստակավոր գյուտարար, տեխնիկական գիտությունների դոկտոր, պրոֆեսոր, Կուբանի նահանգի մսի և ձկնամթերքի տեխնոլոգիայի ամբիոնի վարիչ տեխնոլոգիական համալսարան. KubGTU-ում և նրա ղեկավարությամբ Կրասնոդարի գյուղատնտեսական մթերքների պահպանման և վերամշակման գիտահետազոտական ​​ինստիտուտում գործող «Հեղուկ և սեղմված գազերով բուսական և կենդանական ծագման հումքի վերամշակման տեսություն և պրակտիկա» գիտական ​​և մանկավարժական դպրոցը զբաղվում է նրա ղեկավարությամբ. տարբեր հումքի վերամշակման արդյունավետությունը, ինչը հնարավորություն է տալիս բարելավել արտադրանքի որակը, նվազեցնել վերամշակման ժամանակը և միևնույն ժամանակ նվազեցնել էներգիայի ծախսերը:

աղակալումտեղումներ ալկալիների, հողալկալիական մետաղների աղերով (նատրիումի քլորիդ, մագնեզիումի սուլֆատ), ամոնիումի սուլֆատ; միևնույն ժամանակ, սպիտակուցի առաջնային կառուցվածքը չի խախտվում.

տեղումներՋրազրկող նյութերի օգտագործումը՝ սպիրտ կամ ացետոն ցածր ջերմաստիճանում (մոտ -20°C):

Այս մեթոդների կիրառման ժամանակ սպիտակուցները կորցնում են իրենց խոնավեցնող շերտը և նստում են լուծույթում:

Դենատուրացիա- սպիտակուցների տարածական կառուցվածքի խախտում (մոլեկուլի առաջնային կառուցվածքը պահպանվում է): Այն կարող է լինել շրջելի (սպիտակուցի կառուցվածքը վերականգնվում է դենատուրացնող նյութի հեռացումից հետո) կամ անշրջելի (մոլեկուլի տարածական կառուցվածքը չի վերականգնվում, օրինակ, երբ սպիտակուցները նստում են խտացված հանքային թթուներով, ծանր մետաղների աղերով):

Սպիտակուցների տարանջատման մեթոդներ Սպիտակուցների բաժանում ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտերից

Դիալիզ

Օգտագործվում է հատուկ պոլիմերային թաղանթ, որն ունի որոշակի չափի ծակոտիներ։ Փոքր մոլեկուլները (ցածր մոլեկուլային քաշի կեղտը) անցնում են թաղանթի ծակոտիներով, մինչդեռ մեծ մոլեկուլները (սպիտակուցները) պահպանվում են: Այսպիսով, սպիտակուցները լվանում են կեղտից:

Սպիտակուցների բաժանումը մոլեկուլային քաշով

Գելային քրոմատոգրաֆիա

Քրոմատոգրաֆիկ սյունակը լցված է գելային հատիկներով (Sephadex), որն ունի որոշակի չափի ծակոտիներ։ Սյունակում ավելացվում է սպիտակուցների խառնուրդ։ Սպիտակուցները, որոնց չափերը ավելի փոքր են, քան Sephadex ծակոտիները, պահվում են սյունակում, քանի որ դրանք «խրվում են» ծակոտիների մեջ, իսկ մնացածը ազատորեն դուրս է գալիս սյունից (նկ. 2.1): Սպիտակուցի չափը կախված է նրա մոլեկուլային քաշից։

Բրինձ. 2.1.Սպիտակուցների բաժանում գել ֆիլտրման միջոցով

Ուլտրակենտրոնիֆուգացիա

Այս մեթոդը հիմնված է տարբեր խտության գրադիենտներով լուծույթներում (սախարոզա բուֆեր կամ ցեզիումի քլորիդ) սպիտակուցի մոլեկուլների նստվածքի (տեղացումների) տարբեր արագությունների վրա (նկ. 2.2):

Բրինձ. 2.2.Սպիտակուցների բաժանում ուլտրակենտրոնացման միջոցով

էլեկտրոֆորեզ

Այս մեթոդը հիմնված է էլեկտրական դաշտում սպիտակուցների և պեպտիդների միգրացիայի տարբեր տեմպերի վրա՝ կախված լիցքից:

Գելերը, ցելյուլոզայի ացետատը, ագարը կարող են ծառայել որպես էլեկտրոֆորեզի կրիչներ։ Առանձնացվելիք մոլեկուլները շարժվում են գելի մեջ՝ կախված իրենց չափսերից. նրանք, որոնք ավելի մեծ են, հետ կպահվեն, երբ անցնում են գելի ծակոտիներով: Փոքր մոլեկուլները կհանդիպեն ավելի քիչ դիմադրության և, հետևաբար, ավելի արագ կշարժվեն: Արդյունքում, էլեկտրոֆորեզից հետո ավելի մեծ մոլեկուլները կմոտենան սկզբին, քան փոքրերը (նկ. 2.3):

Բրինձ. 2.3. Սպիտակուցների բաժանում գելային էլեկտրոֆորեզով

Սպիտակուցները կարելի է բաժանել նաև էլեկտրոֆորեզի միջոցով՝ ըստ մոլեկուլային քաշի։Այս օգտագործման համար էլեկտրոֆորեզ PAAG-ում նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատի առկայությամբ (SDS-Na).

Առանձին սպիտակուցների մեկուսացում

Affinity քրոմատոգրաֆիա

Մեթոդը հիմնված է ոչ կովալենտային կապերի միջոցով տարբեր մոլեկուլների հետ տարբեր մոլեկուլների հետ կապված սպիտակուցների ունակության վրա։ Օգտագործվում է ֆերմենտների, իմունոգոլոբուլինների, ընկալիչների սպիտակուցների մեկուսացման և մաքրման համար։

Նյութերի մոլեկուլները (լիգանդներ), որոնց հետ որոշակի սպիտակուցներ հատուկ կապվում են, կովալենտորեն միացվում են իներտ նյութի մասնիկների հետ։ Սյունակում ավելացվում է սպիտակուցների խառնուրդ, իսկ ցանկալի սպիտակուցը ամուր կցվում է լիգանդին։ Մնացած սպիտակուցները ազատորեն դուրս են գալիս սյունակից: Այնուհետև պահպանված սպիտակուցը կարող է լվանալ սյունակից ազատ լիգանդ պարունակող բուֆերով: Այս խիստ զգայուն մեթոդը թույլ է տալիս շատ փոքր քանակությամբ մաքուր սպիտակուց մեկուսացնել հարյուրավոր այլ սպիտակուցներ պարունակող բջջային էքստրակտից:

Իզոէլեկտրական կենտրոնացում

Մեթոդը հիմնված է սպիտակուցների տարբեր IEP արժեքների վրա: Սպիտակուցները բաժանվում են էլեկտրոֆորեզով ամֆոլինով ափսեի վրա (սա մի նյութ է, որն ունի նախապես ձևավորված pH գրադիենտ 3-ից 10-ի սահմաններում): Էլեկտրաֆորեզի ժամանակ սպիտակուցներն առանձնացվում են ըստ իրենց IEP-ի արժեքի (IEP-ում սպիտակուցի լիցքը զրո կլինի, իսկ էլեկտրական դաշտում այն ​​չի շարժվի)։

2D էլեկտրոֆորեզ

Այն իզոէլեկտրական ֆոկուսավորման և էլեկտրոֆորեզի համադրություն է SDS-Na-ի հետ: Նախ, էլեկտրոֆորեզն իրականացվում է ամֆոլինով ափսեի վրա հորիզոնական ուղղությամբ: Սպիտակուցները բաժանվում են՝ կախված լիցքից (CEP): Այնուհետև ափսեը մշակվում է SDS-Na լուծույթով և ուղղահայաց ուղղությամբ կատարվում է էլեկտրոֆորեզ։ Սպիտակուցները դասակարգվում են՝ ելնելով մոլեկուլային քաշից:

Իմունոէլեկտրոֆորեզ (Western blot)

Անալիտիկ մեթոդ, որն օգտագործվում է նմուշում հատուկ սպիտակուցներ որոշելու համար (Նկար 2.4):

Սպիտակուցների մեկուսացում կենսաբանական նյութերից:

Սպիտակուցների բաժանումը մոլեկուլային քաշով էլեկտրոֆորեզով PAAG-ում SDS-Na-ով:

Գելից սպիտակուցների տեղափոխում պոլիմերային ափսե՝ հետագա աշխատանքը հեշտացնելու համար:

Ափսեի մշակում ոչ սպեցիֆիկ սպիտակուցային լուծույթով՝ մնացած ծակոտիները լրացնելու համար։

Այսպիսով, այս փուլից հետո ստացվել է ափսե, որի ծակոտիները պարունակում են առանձնացված սպիտակուցներ, և նրանց միջև տարածությունը լցված է ոչ սպեցիֆիկ սպիտակուցով։ Այժմ մենք պետք է պարզենք, թե արդյոք այն սպիտակուցների շարքում, որոնք մենք փնտրում ենք, պատասխանատու են ինչ-որ հիվանդության համար: Բացահայտման համար օգտագործվում է հակամարմինների բուժում: Տակ առաջնային հակամարմինները հասկանալ հակամարմինները ցանկալի սպիտակուցին: Երկրորդական հակամարմիններ ասելով նշանակում է հակամարմիններ առաջնային հակամարմիններին: Լրացուցիչ հատուկ պիտակ (այսպես կոչված մոլեկուլային զոնդ) ավելացվում է երկրորդական հակամարմինների բաղադրությանը, որպեսզի հետագայում արդյունքները տեսանելի լինեն: Ռադիոակտիվ ֆոսֆատը կամ երկրորդական հակամարմինին սերտորեն կապված ֆերմենտը օգտագործվում է որպես պիտակ: Նախ՝ առաջնային, իսկ հետո երկրորդական հակամարմիններին կապելը երկու նպատակ ունի՝ ստանդարտացնել մեթոդը և բարելավել արդյունքները:

Առաջնային հակամարմինների լուծույթով մշակումը  կապը տեղի է ունենում ափսեի տեղում, որտեղ կա հակագեն (ցանկալի սպիտակուց):

Չկապված հակամարմինների հեռացում (լվացում):

Բուժում պիտակավորված երկրորդական հակամարմինների լուծույթով հետագա զարգացման համար:

Չկապված երկրորդական հակամարմինների հեռացում (լվացում):

Բրինձ. 2.4. Իմունոէլեկտրոֆորեզ (Western blot)

Կենսաբանական նյութում ցանկալի սպիտակուցի առկայության դեպքում ափսեի վրա հայտնվում է ժապավեն, որը ցույց է տալիս այս սպիտակուցի կապը համապատասխան հակամարմիններին։

Սպիտակուցների առավել բնորոշ ֆիզիկաքիմիական հատկություններն են՝ լուծույթների բարձր մածուցիկություն, թեթև դիֆուզիոն, լայն տիրույթում ուռելու ունակություն, օպտիկական ակտիվություն, շարժունակություն էլեկտրական դաշտում, ցածր օսմոտիկ ճնշում և բարձր օնկոտիկ ճնշում, ուլտրամանուշակագույն ճառագայթները կլանելու ունակություն։ 280 նմ (սա վերջին հատկությունը, սպիտակուցներում արոմատիկ ամինաթթուների առկայության պատճառով, օգտագործվում է սպիտակուցների քանակականացման համար):

Սպիտակուցները, ինչպես ամինաթթուները, ամֆոտեր են՝ ազատ NH2 և COOH խմբերի առկայության պատճառով և բնութագրվում են համապատասխանաբար թթուների և հիմքերի բոլոր հատկություններով։

Սպիտակուցներն ունեն ընդգծված հիդրոֆիլ հատկություններ։ Նրանց լուծույթներն ունեն շատ ցածր օսմոտիկ ճնշում, բարձր մածուցիկություն և փոքր դիֆուզիոն։ Սպիտակուցները շատ մեծ չափով ունակ են ուռչելու։

Ռադը կապված է սպիտակուցների կոլոիդային վիճակի հետ։ բնորոշ հատկություններ, մասնավորապես լույսի ցրման երեւույթը, որը ընկած է նեֆելոմետրիայի միջոցով սպիտակուցների քանակական որոշման հիմքում։ Այս էֆեկտը կիրառվում է նաև ժամանակակից մեթոդներ, կենսաբանական օբյեկտների մանրադիտակ. Սպիտակուցի մոլեկուլները չեն կարողանում անցնել կիսաթափանցիկ արհեստական ​​թաղանթներով (ցելոֆան, մագաղաթ, կոլոդիոն), ինչպես նաև բուսական և կենդանական հյուսվածքների կենսամեմբրաններով, չնայած օրգանական ախտահարումներով, ինչպիսիք են երիկամները, երիկամային գլոմերուլուսի պարկուճը (Շումլյանսկի-Բոումեն): ) դառնում է թափանցելի արյան շիճուկի ալբումինների համար, և դրանք հայտնվում են մեզի մեջ։

Սպիտակուցների դենատուրացիա Տարբեր ֆիզիկական և քիմիական գործոնների ազդեցության տակ սպիտակուցները ենթարկվում են կոագուլյացիայի և նստվածքի՝ կորցնելով իրենց բնածին հատկությունները։ Այսպիսով, դենատուրացիան պետք է հասկանալ որպես ընդհանուր պլանի խախտում՝ բնիկ սպիտակուցի մոլեկուլի եզակի կառուցվածքը, որը հանգեցնում է նրա բնորոշ հատկությունների կորստի (լուծելիություն, էլեկտրոֆորետիկ շարժունակություն, կենսաբանական ակտիվություն և այլն): Սպիտակուցների մեծամասնությունը 50-60 ° C-ից բարձր լուծույթով տաքացնելիս դենատացվում է: Դենատուրացիայի արտաքին դրսևորումները վերածվում են լուծելիության կորստի, հատկապես իզոէլեկտրական կետում, սպիտակուցային լուծույթների մածուցիկության բարձրացում, ազատ ֆունկցիոնալ քանակի ավելացում: SH-rpypp և ռենտգենյան ճառագայթների ցրման բնույթի փոփոխություն: Դենատուրացիայի ամենաբնորոշ նշանը սպիտակուցի կողմից կենսաբանական ակտիվության կտրուկ նվազումն է կամ ամբողջական կորուստը (կատալիտիկ հակագենային կամ հորմոնալ): պեպտիդային կապերպոլիպեպտիդային շղթայի ողնաշարի բուն ողնաշարը Միևնույն ժամանակ բացվում են բնածին սպիտակուցային մոլեկուլների գնդիկներ և ձևավորվում են պատահական և խանգարված կառուցվածքներ: