fejléc

2
2

A fehérjék izolálása és tisztítása szakaszosan történik.

1. Homogenizálás- ez a biokémiai kutatás tárgyainak alapos homogén, azaz homogén állapotba őrlése, vagyis a fehérjék alapos szétesésen mennek keresztül egészen a sejtfal pusztulásáig.
Ennek során a következőket használják:
A) Harc típusú késes homogenizátorok;
b) mozsártörő homogenizátorok Potter - Elveheim;
V) golyós- és görgős malmok - sűrűbb tárgyakhoz;
G) a váltakozó fagyasztás és felolvasztás módszere, miközben a sejtfal felszakadása jégkristályok hatására következik be;
e) a "nitrogénbomba" módszere - nagy nyomás alatt a sejteket nitrogénnel telítik, majd a nyomás hirtelen felszabadul, gáznemű nitrogén szabadul fel, ami a sejtet belülről felrobbantja;
e) Ultrahang, különféle présmódszerek, sejtfalak emésztése enzimekkel. A legtöbb esetben a homogenizálás során hő szabadul fel, miközben sok fehérje inaktiválható, ezért minden eljárást hidegkamrákban végeznek t 0 hőmérsékleten, vagy az alapanyagokat jéggel hűtik. Ugyanakkor gondosan ellenőrzik a sejtpusztulás térfogatát és idejét, valamint az üzemi nyomást. Ideális homogenizátum az, amely tovább extrahálható.

2. Fehérje kivonás, azaz oldott állapotba való átvitelük; leggyakrabban az extrakciót egyidejű őrléssel együtt végzik.

Az extrakciót végzik:
A) oldás 8-10%-os sóoldatokban;
b) savas vagy enyhén lúgos pH-jú pufferoldatok (borát, foszfát, citrát, trisz-puffer: triszamino-metán és NH2 - CH3 + HCl keveréke);
V) fehérjék kicsapása szerves oldószerekkel (etanol, metanol, butanol, aceton és ezek kombinációi), miközben a fehérje-lipid és fehérje-fehérje komponensek kettéválnak, azaz a HSB elpusztítása.

3. Fehérjék tisztítása és frakcionálása. Az extrakció után a keveréket elválasztják vagy frakcionálják egyedi fehérjékre, és tovább tisztítják:

a) kisózzuk- ez a fehérjék kicsapásának folyamata lúgos és semleges sóoldatokkal alkáliföldfémek.

kisózási mechanizmus– a hozzáadott anionok és kationok tönkreteszik a fehérjék hidratált fehérjehéját, ami a fehérjeoldatok egyik stabilitási tényezője. Leggyakrabban Na és ammónium-szulfát oldatokat használnak. Sok fehérje különbözik a hidratáló héj méretében és a töltés nagyságában. Minden fehérjének megvan a saját sózási zónája. A kisózószer eltávolítása után a fehérje megőrzi biológiai aktivitását és fizikai-kémiai tulajdonságait. A klinikai gyakorlatban a kisózási módszert alkalmazzák a globulinok (50%-os ammónium-szulfát-oldat (NH 4) 2SO 4 hozzáadásával csapadék képződik) és albuminok (100%-os ammónium-szulfát-oldat (NH 4) 2SO 4 hozzáadásával csapadék képződik) elválasztására.

A kisózást a következők befolyásolják:
1) a só jellege és koncentrációja;
2) pH-környezet;
3) hőmérséklet.

A fő szerepet az ionok vegyértéke játssza. Ezért a só hatását az oldat ionerősségével μ értékeljük:

, azaz az oldat ionerőssége (μ) egyenlő az egyes ionok koncentrációjának (C) ½ és vegyértékének négyzetének (V) szorzatával.

A Kohn-módszer a kisózás egy fajtája. Ezzel egyidejűleg megtörténik a komponensek extrakciója és kicsapása. A hőmérséklet (általában alacsony t o -0 + 8 o C), az oldat pH-értékének és a tömény etanol egymás utáni változtatásával akár 18 fehérjefrakciót is izolálunk egymás után a vérplazmából.

Kohn módszer gyógyszergyártásban használják vérpótlók gyártásában;
b) kromatográfiás módszerek. Mihail Tsvet orosz tudóst (1903) tartják a kromatográfiás elemzési módszerek fejlesztésének megalapítójának. Jelenleg sok fajta létezik belőle. A módszer az anyagok azon képességén alapul, hogy egy oszlopba zárt vagy valamilyen hordozóra helyezett adszorbensen specifikusan adszorbeálódjanak. Amikor ez megtörténik, az elemzett anyagok szétválasztása és koncentrációjuk egy szigorúan meghatározott adszorbens rétegben. Ezután megfelelő eluenseket (oldószereket) vezetnek át az oszlopon, amelyek gyengítik az adszorpciós erőket és kimossák az adszorbeált anyagokat az oszlopról. Az anyagokat a frakciógyűjtőben gyűjtik össze.

A kromatográfia alapja eloszlási arány, amely megegyezik egy anyag koncentrációjának arányával mobil fázis az anyag koncentrációjához állófázis(vagy állófázis).

Álló stacionárius fázis– lehet szilárd vagy folyékony vagy szilárd és folyékony keverék.

mobil fázis- folyékony vagy gáz halmazállapotú, átfolyik az állón, vagy áthalad rajta.

Az álló és mozgófázis típusától függően a kromatográfiás analízisnek különféle módosításai vannak.

Adszorpció- a fehérjék adszorbens általi adszorpciójának eltérő fokán és a megfelelő oldószerben való oldhatóságán alapul.

Adszorbensként kovasav, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, szén. Az adszorbenst oldószerrel (általában pufferoldattal) szuszpenzió formájában egy oszlopba (üveg függőleges cső) töltik. A mintát az oszlopra visszük, majd oldószert vagy oldószerkeveréket engedünk át rajta.

Az elkülönítés azon alapul, hogy a magasabb K-eloszlású anyagok. (B) gyorsabban mozog az oszlop mentén. A frakciókat frakciógyűjtővel gyűjtjük össze.

Megoszlási kromatográfia- a fehérjék keverékének két folyadékfázis közötti eloszlásán alapul. Az elválasztás történhet speciális kromatográfiás papíron, valamint oszlopokban, akárcsak az adszorpciónál. A szilárd fázis ebben az esetben csak a folyékony állófázis hordozójaként szolgál. A kromatográfiás papírnak megvan az a tulajdonsága, hogy vizet tart a cellulózszálai között. Ez a víz egy álló, állófázis. Amikor egy nemvizes oldószer (mozgófázis) kapilláris erők hatására áthalad a papíron, a papíron lerakódott anyag molekulái eloszlási együtthatójuknak megfelelően eloszlanak a két fázis között. Minél nagyobb az anyag oldhatósága a mozgófázisban, annál tovább fog mozogni a papír mentén az oldószerrel együtt.
A kromatográfia oszlopon történő elosztása esetén a hordozóanyag cellulóz, keményítő, szilikagél stb., az állófázis a víz. Az oszlopra felhordva a keverék anyagai a Krasp figyelembevételével különböző sebességgel mozognak az oszlop mentén.

Az Rf minden vegyületre standard körülmények között állandó érték.
Ioncserélő kromatográfia - ellentétes töltésű részecskék vonzásán alapul. Ehhez különféle ioncserélő gyantákat használnak: a kationcserélő gyanták negatív töltésű csoportokat tartalmaznak - szulfonált sztirolokat és CMC-t, amelyek vonzzák a vizsgált anyagok pozitív töltésű ionjait. Ezeket savas ioncserélőknek is nevezik.
Az anioncserélő gyanták vagy bázikus ioncserélők pozitív töltésű csoportokat tartalmaznak, amelyek vonzzák a negatív töltésű fehérjemolekulákat.
A trimetilaminosztirol sztirolok és cellulóz származéka.
Az elválasztandó fehérjék q-jától függően megfelelő ioncserélőket alkalmaznak, amelyekkel bizonyos fehérjék kölcsönhatásba lépnek, míg mások szabadon hagyják el az oszlopot. Az oszlopon "kicsapódott" fehérjéket töményebb sóoldattal vagy az eluens pH-értékének megváltoztatásával távolítjuk el.
Az affinitáskromatográfia (vagy affinitáskromatográfia) a fehérjék vagy más makromolekulák szelektív kölcsönhatásának elvén alapul, hordozókon - ligandumon - rögzített specifikus anyagokkal (ez lehet koenzim, ha enzimet, antitestet, antigént stb. izolálnak. A fehérjék nagy specifitása miatt a fehérjék nagy specifitása miatt csak egy pH-t kapcsolnak le a bufferelegyből, vagy csak egy fehérjét kapcsolnak ki a keverékből. megváltozott az ionerősség.
Előnye, hogy egy adott, nagy tisztaságú anyagot egy lépésben el lehet különíteni.
A gélszűrési módszer vagy molekulaszita módszer a permeációs kromatográfia egyik fajtája.
A molekulák méret és forma szerinti szétválasztása a molekulaszita tulajdonságain alapul, amelyekkel sok porózus anyag rendelkezik, mint például a szerves polimerek, amelyek háromdimenziós hálózatszerkezettel rendelkeznek, amely a gél tulajdonságait adja. A gélszűrés az anyagok szétválasztása gélek segítségével a molekulák méretbeli különbségei alapján (sepharose, sephadex, sephacryl, biogél stb.). Az epiklórhidrin hatására a dextrán poliszacharid láncai (mikroorganizmusok által szintetizálva) térhálósodnak hálózati struktúrává, vízben oldhatatlanná válnak, de megőrzik az iránta nagy affinitást. Ennek a hidrofilitásnak köszönhetően a keletkező szemcsék (úgynevezett Sephadex) erősen megduzzadnak, és gélt képeznek, amelyet az oszlopba töltenek. A módszer azon alapszik, hogy a nagy molekulák nem hatolnak be a belső vizes fázisba, a kisebb molekulák pedig először a "szita" pórusaiba hatolnak be, mintha azokon ragadnának, és ezért kisebb sebességgel mozognak. Ennek megfelelően a magasabb Mr-értékkel rendelkező fehérjék lépnek be először a vevőegységbe. Az utóbbi időben a porózus üveggyöngyöket egyre gyakrabban használják molekulaszitaként a permeációs kromatográfiában.
Az elektroforetikus módszer a biokémiában a molekulák elektromos térben (aminosavak, peptidek, fehérjék, nukleinsavak) mozgási sebességének különbségén alapul.
A sebességkülönbség a következőktől függ:
1. a molekula q-ján: minél nagyobb a molekulák mobilitása, annál nagyobb a teljes q. A q érték a pH-tól függ;
2. a molekulák méretéről: minél nagyobbak a molekulák, annál kisebb a mobilitásuk. Ez a súrlódási erők növekedésének és a nagy molekuláknak a környezettel való elektrosztatikus kölcsönhatásainak köszönhető;
3. a molekulák alakjáról: azonos méretű, de eltérő alakú molekulák, például a fibrillák és a fehérjegömbök különböző sebességűek. Ennek oka a súrlódási erők és az elektrosztatikus kölcsönhatás különbsége.
Az elektroforézis típusai
a) Izoelektromos fókuszálás. Az elválasztás egy függőleges oszlopon történik fokban. pH és feszültség egyaránt. Speciális amfolithordozók segítségével jégeső alakul ki az oszlopban. pH 0-14. Anyagkeveréket helyezünk az oszlopba, és elektromos áramot csatlakoztatunk. A komponensek mindegyike az oszlop azon részére kerül, ahol a pH érték megfelel az izoelektromos pontjának, és ott megáll, vagyis fókuszálódik.
Előny: egy lépésben szétválasztja, tisztítja és azonosítja a fehérjéket. A módszer nagy felbontású (0,02 pI).
b) Az izotachoforézis hordozó közegen végzett elektroforézis. Az elektromos áram bekapcsolása után a legnagyobb mobilitású ionok először a megfelelő elektródához érkeznek, a legalacsonyabb - az utolsó, közepes mobilitású - középen.
c) Lemezelektroforézis - a készülék két pufferrel ellátott edényből áll - felső és alsó, amelyeket függőleges csövek kötnek össze, amelyek különböző pórusú gélt tartalmaznak. Ahogy az ionizált részecskék elektromos áram hatására mozognak. A nagyobb porozitás a gél tetején található.
d) Immunelektroforézis - az elektroforézist immundiffúzióval kombináló módszer (antigének kimutatására komplex fiziológiai keverékekben). Az antigének keverékét és az antitestek keverékét egymásra merőlegesen helyezzük egy speciális hordozóra. Amikor az elektromos áramot bekapcsolják, ezek különálló anyagokra válnak szét, és a gélhordozóra diffundálnak. Az antigén és a megfelelő antitest találkozási pontján egy speciális kicsapódási reakció megy végbe ív formájában. A kialakult ívek száma megfelel az antigének számának.

Az Mr fehérjék meghatározásának módszerei

Nál nél egy nagy szám fehérjék, az aminosavak kémiai összetétele és sorrendje nem állapítható meg (1010-1012 fehérje), ezért Mr. Ehhez különféle módszereket alkalmaznak.
a) Ülepítési módszer - az Mr meghatározását speciális centrifugákban végzik (az első centrifugát Svedberg svéd biokémikus javasolta), amelyben lehetőség van olyan centrifugális gyorsulás létrehozására, amely több mint 200 ezerszerese vagy több a föld gravitációs gyorsulásának. Az Mr-t a molekulák V ülepedéséből határozzuk meg. Ahogy a molekulák a központból a perifériára mozognak, éles határ oldószer fehérje. Az ülepedési sebességet az ülepedési állandóval (S) fejezzük ki:

ahol V a fehérje-oldószer határfelület mozgási sebessége (cm/s);
 a forgórész szögsebessége (rad/s);
 a rotor középpontja és a sejt közepe közötti távolság a fehérjeoldattal (cm).
Az S ülepedési állandó értékét, amely 110–13 C, feltételesen 1-nek vesszük, és 1 Svedberg-nek (S) nevezzük. A fehérjék S értéke 1-50 S, néha 100 S-ig terjed.
A fehérjék Mr-jét a Svedberg-egyenlet határozza meg:

ahol R az univerzális gázállandó;
T - abszolút hőmérséklet Kelvintől;
S az ülepedési állandó;
D a diffúziós együttható;
 az oldószer sűrűsége;
V a gáz részleges fajlagos térfogata.
Ez a módszer drága a berendezések használata miatt.
Egyszerűbb és olcsóbb:
b) Gélszűrés vékony Sephadex rétegben.
A fehérjeút hossza (mm-ben) logaritmikus Mr.
X – Mr a kívánt fehérje a kalibrációs grafikonon.
c) Korongelektroforézis poliakrilamid rétegben - összefüggés van a kalibrációs fehérjék Mr logaritmusa és úthosszuk között is.

A fehérjék homogenitásának meghatározására szolgáló módszerek

Az izolált fehérje tisztasági fokát a következők határozzák meg:

• ultracentrifugálás;
• korong-elektroforézis módszer;
• különböző immunkémiai módszerek;
• a fehérje oldhatóságának meghatározása (a Northrop-módszer) a fázisszabályon alapul, amely szerint a tiszta anyag oldhatósága adott kísérleti körülmények között csak a hőmérséklettől függ, de nem függ a szilárd fázisban lévő anyag koncentrációjától.

Ha a fehérje homogén, akkor az (a) grafikonon egy inflexiót kapunk, ha fehérjeszennyeződések (b, c), akkor a telítési görbe több inflexióját kapjuk. Minden fehérjének megvan a maga egyedi oldhatósági görbéje.

480 dörzsölje. | 150 UAH | 7,5 USD ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Szakdolgozat - 480 rubel, szállítás 10 perc A nap 24 órájában, a hét minden napján és ünnepnapokon

Kaiseva Anna Leonidovna Fehérjék és fehérjekomplexek tömegspektrometriás azonosítása atomerőmikroszkóp chipjein: disszertáció... a biológiai tudományok kandidátusa: 04.01.03 / Kaisheva Anna Leonidovna; [A védelem helye: Nauch.-issled. in-t biomed. kémia őket. V.N. Orekhovich RAMS].- Moszkva, 2010.- 104 p.: ill. RSL OD, 61 10-3/1308

Bevezetés

1. fejezet Irodalmi áttekintés 10

1.1. Tudományos és műszaki alapmunkák elemzése a rendkívül érzékeny proteomikai technológiák területén

1.2 A hepatitis C vírus jellemzése 20

1.2.1 A hepatitis C diagnosztizálásának módszerei 22

1.2.2 A hepatitis C 25 szerológiai fehérjemarkerei

2. fejezet Anyagok és módszerek 28

2.1 ACM chipek 28

2.2 Fehérjekészítmények és reagensek 29

2.3 AFM elemzés 30

2.4 A minta előkészítése tömegspektrometriás elemzéshez 31

2.5 Tömegspektrometriás elemzés 33

2.5.1 Az AFM chip felületén lévő fehérjék MALDI-MS elemzése 33

2.5.2 Az AFM chip felületén lévő fehérjék ESI-MS elemzése 34

3. fejezet Eredmények és megbeszélés 35

3.1 MS - "kémiai halászattal" fogott fehérjék azonosítása az AFM chip felületén az analitikus oldatból

3.2 Analit oldatból AFM chip felületén biospecifikusan befogott fehérjék MS azonosítása

3.3 Fehérjék MS azonosítása vérszérummintákból biospecifikusan izolált AFM chip felületén

83. következtetés

Irodalom

Bevezetés a munkába

A mű relevanciája.

A modern biokémia egyik kiemelt területe a hatékony analitikai módszerek megalkotása a proteomikai analízishez, melynek fő feladata a fehérjék kimutatása és leltározása a szervezetben, szerkezetük és funkcióik tanulmányozása, valamint a fehérjekölcsönhatások azonosítása. A probléma megoldása lehetővé teszi új rendszerek létrehozását a betegségek diagnosztizálására és kezelésére. A modern proteomikai analízis standard módszerei a többkomponensű fehérjekeverékek szétválasztásán alapulnak kromatográfiával, elektroforézissel kombinálva tömegspektrometriás módszerekkel (MS) a fehérje azonosítására. Annak ellenére, hogy a standard MS analízis kétségtelen előnye a fehérjemolekulák azonosításának sebessége és megbízhatósága tekintetében, jelentős alkalmazási korlátai vannak az alacsony

az analízis koncentrációérzékenysége 10" "10" M szinten és a biológiai anyag fehérjetartalmának magas dinamikus tartománya. Ugyanakkor a funkcionális fehérjék túlnyomó többsége, beleértve az olyan társadalmilag jelentős betegségek biomarkereit, mint a vírusos hepatitis B és C, tumormarkerek stb., 10" Mi-el kevesebb koncentrációtartományban van jelen a vérplazmában.

Az elemzés koncentrációérzékenységének ezen módszertani korlátjának leküzdésének egyik módja a biomolekuláris detektorok alkalmazása, amelyek lehetővé teszik egyedi molekulák és komplexeik kimutatását, és elméletileg nincsenek koncentrációérzékenységi korlátai. A biomolekuláris detektorok közé tartoznak a nanotechnológiai eszközökön alapuló detektorok, mint például az atomerőmikroszkópok (AFM), a nanohuzalos detektorok, a nanopórusok és számos más detektor. Az AFM detektorok egyedülálló érzékenysége lehetővé teszi az egyes fehérjemolekulák megjelenítését és számuk megszámlálását. Ha az AFM-et biomolekuláris detektorként használjuk, speciális chipek használata szükséges, amelyek lehetővé teszik a biológiai elemző makromolekulák koncentrálását nagy térfogatú inkubációs oldatból korlátozott chip felületen. A vizsgált fehérjeobjektumok mind fizikai vagy kémiai adszorpció, mind biospecifikus kölcsönhatások (AFM-biospecifikus horgászat) következtében koncentrálódhatnak a chip felületén.

A gyakorlatban azonban az AFM alapú nanodetektorok használatának korlátja, hogy hiába lehetséges a chip felületén az egyes fehérjemolekulák vizualizálása, az ilyen detektorok nem képesek azonosítani azokat, ami különösen fontos a komplex fehérjekeverékek, ezen belül a biológiai anyagok vizsgálatánál. Ezért sürgető feladatnak tűnik egy olyan elemzési módszer kidolgozása, amely kiegészíti az AFM módszer képességeit. A mai napig az egyetlen proteomikai módszer, amely lehetővé teszi a fehérjemolekulák egyértelmű és megbízható azonosítását, az MS analízis. A disszertációban az AFM módszer nagy érzékenységét és a megbízható MS azonosítást ötvöző megközelítést dolgoztam ki fehérjék és komplexeik analitikus oldatból történő kimutatására.

A tanulmány célja és célkitűzései.

A munka célja a bioanyagban kimutatott fehérjék és fehérjekomplexek tömegspektrometriás azonosítása volt atomerőmikroszkóppal.

A cél elérése érdekében a következő feladatokat oldották meg:

Kidolgoztak egy sémát az AFM-chip felületére fogott fehérjék MS azonosítására kémiai vagy biospecifikus halászat segítségével;

Kidolgozták a fehérjék enzimatikus hidrolízisének feltételeit egy AFM chip felületén a későbbi MS azonosításhoz;

Az AFM chip felületén lévő modellfehérjék MS-azonosítását végeztük el;

Többkomponensű keverékből (szérumból) biospecifikusan izolált AFM chip felületén lévő fehérjék MS-azonosítását végeztük el.

A munka tudományos újdonsága .

A disszertációban egy olyan sémát dolgoztak ki, amely lehetővé teszi az oldatból vagy többkomponensű keverékből kifogott fehérjék és fehérjekomplexek MS azonosítását egy AFM chip felületén. Ehhez kiválasztottuk a minta-előkészítés optimális körülményeit, beleértve az AFM chip felületén kovalensen és nem kovalensen rögzített fehérjemolekulák hidrolízisének módját (hőmérséklet, páratartalom, a tripszinolitikus keverék összetétele, tripszinolízis ideje). A munka sajátossága az volt, hogy az enzimatikus hidrolízis standard proteomikai protokolljaihoz képest az MS analízishez szükséges minták előkészítése nem oldatban, hanem korlátozott területen történt.

forgács felület. A kidolgozott séma lehetővé tette az MS analízis hatékony elvégzését és az AFM chip felületén lévő egyedi fehérjék és fehérjekomplexek azonosítását. A vizsgált fehérjék proteotípusos peptidjeinek MS analízisét kétféle ionizációs módszerrel végeztem (MALDIÉs EST)és kétféle detektor (TOF és ioncsapda). Az AFM-biospecifikus horgászat és az MS összekapcsolására kidolgozott sémát sikeresen tesztelték a vírusos hepatitis C (HCV) fehérjemarkereinek (HCVcoreAg és E2) kimutatására vérszérummintákban.

A munka gyakorlati jelentősége .

A munka eredményei lehetővé teszik rendkívül érzékeny proteomikai módszerek létrehozását címkék és további minta-előkészítési eljárások alkalmazása nélkül a biológiai anyagokban, így a vérszérumban is alacsony koncentrációban található fehérjék kimutatására. Atomerőmikroszkópián és tömegspektrometrián alapuló megközelítést javasoltak, amely lehetővé teszi a hepatitis C vírus fehérjemarkereinek kimutatását és azonosítását emberi vérszérumban.

A megközelítés alkalmazható új diagnosztikai chipek létrehozását célzó fejlesztésekben, a társadalmilag jelentős betegségek széles körének biomarkereinek felkutatásában.

A munka jóváhagyása.

A tanulmány főbb eredményeit az „1., 2. és 3. Nemzetközi Nanotechnológiai Fórumon” mutatták be (Moszkva, 2008-2010); "Az Orosz Biokémikus Társaság IV. Kongresszusa és molekuláris biológusok”, Novoszibirszk, 2008; a „Human Proteome” Nemzetközi Kongresszuson, Amszterdam, 2008; a "Human Proteome" Nemzetközi Kongresszuson, Sydneyben, 2010.

Publikációk.

A dolgozat felépítése és terjedelme.

A disszertáció bevezetőből, szakirodalmi áttekintésből, a kutatási anyagok és módszerek leírásából, a kutatási eredményekből és azok tárgyalásából, következtetésekből, következtetésekből és irodalomjegyzékből áll. A mű 104 oldalon, 33 ábrával és 4 táblázattal illusztrálva, 159 címből áll.

Tudományos és műszaki alapmunkák elemzése a rendkívül érzékeny proteomikai technológiák területén

Az egyik kiemelt terület modern tudomány célja a különböző típusú fehérjék szervezetben betöltött szerepének felfedezése és tisztázása, valamint a betegségek kialakulásához vezető molekuláris mechanizmusok megértése.

A proteomikai módszerek folyamatos fejlesztése ellenére az újonnan felfedezett betegségbiomarkerek száma szinte/változatlan elmúlt évtizedben. Ez annak köszönhető, hogy a hagyományos proteomikai módszerek koncentráció-detektálási határa nem haladja meg a 10"9 M-ot. Ugyanakkor a proteomika számára fontos, hogy új analitikai megközelítéseket dolgozzon ki az alacsonyabb koncentráció-tartományban lévő fehérjék azonosítására, különös tekintettel az alacsony kópiaszámú (10"13 M vagy annál kisebb koncentrációjú) fehérjemolekulák azonosítására, beleértve a biológiai anyagokban lévő biomarkereket is. Mivel feltételezhető, hogy ezekben a koncentráció-tartományokban találhatók meg a legtöbb betegség fehérjemarkerei.

Az egyik aktívan fejlődő terület, amely lehetővé teszi az elemzés koncentráció-érzékenységének kismértékű növelését, a tömegspektrométerekkel kompatibilis nanokromatográfiás és nanoelektroforetikus rendszereken alapuló analitikai komplexek létrehozása.

A nanokromatográfiás rendszer tömegspektrometriával és elektrospray típusú ionizációval kombinálva lehetővé tette a fehérjedetektálás érzékenységének két nagyságrenddel történő növelését a kromatográfiához képest nagy felbontású(HPLC) . Az ilyen konjugált rendszerek koncentráció-érzékenységi határát az elektroforézis/kromatográfiás szakasz érzékenysége korlátozza, és nem haladja meg a 10-12 M értéket az egyes fehérjék esetében (például a citokróm C és a bradikinin esetében).

Jelenleg a kromatográfiás módszerek különálló, független területekké fejlődtek - SELDI MS analízis (felszíni fokozott lézeres deszorpció és ionizáció/repülési idő tömegspektrometria), fehérjehalászati ​​módszerek mágneses mikrorészecskéket alkalmazva. Ezekben a technológiákban a SELDI-chipek hidrofób vagy töltött felületei az. vagy mágneses mikrorészecskéket, tömegspektrometriás analízissel kombinálva sikeresen alkalmazzák: for? felderítés és azonosítás, mint külön típusok; fehérjékhez, valamint a vérszérum fehérje/peptid profiljához [c, 8; \b, 15]. A SEbDIi МЄ: egy hatékony megközelítés, amely lehetővé teszi egy bioanyag tanulmányozását biomolekulák (fehérjék, peptidek) adszorpciója révén egy kémiailag aktivált? felület (kation/anioncserélő chipek), majd tömegspektrometriás analízis az adszorbeált: molekulák:. SEEDPMЄ megközelítést alkalmaznak; bioanyag fehérjeprofil meghatározásához; és a közelmúltban: „proteomikus vonalkódokat használó diagnózisként” [17] használták.. Az ilyen „vonalkód-diagnózis” lényege, hogy azonosítani? a biológiai minta fehérjeprofiljának jellemzői; egy adott betegséggel kapcsolatos: Igen, ismert; mit d at. rákos megbetegedések esetén a bioanyag „proteomikus vonalkódja” jelentősen eltér az egészséges1 egyedcsoportokétól: Ezért a fehérje változásainak kontrollja; A bioanyag összetétele a betegségek korai diagnózisának alapja lehet. A; ma a SELDI megközelítést alkalmazva? A МЄ markereket azonosították. gyomor-, petefészek-, prosztata- és emlőrák: ennek a módszernek5 a korlátja, hogy nem lehet nagy felbontással és pontossággal azonosítani a fehérjéket, ami különösen fontos a; többkomponensű keverékek, például biológiai anyagok elemzése.

A meglévő analitikai rendszerek alacsony koncentrációérzékenységének problémája mellett a biológiai anyagok proteomikai analízisének akadálya a fehérjekoncentrációk széles dinamikus tartománya, különösen a vérszérumban, amely 1 (GM M)-től az egyes fehérjemolekulákig terjed. Az ilyen rendszerekben található nagy kópiaszámú (fő) fehérjék megakadályozzák az ilyen rendszerekben a fehérje kimutatását és azonosítását (kis vagy alacsony kópiaszámú rendszerek azonosítását).

A bioanyagban található fehérjék széles koncentrációs tartományának problémája megoldható a főbb fehérjefrakciókból a vérszérum kiürítésének módszereivel, a többkomponensű keverékek elválasztására szolgáló módszerekkel, valamint az analit fehérjemolekuláinak biospecifikus és kémiai halászatán alapuló nanotechnológiai módszerekkel a chipek felületén lévő komplex keverékekből különböző bioszenzorokra vagy mágneses mikrogömbök aktivált felületére.

Hagyományosan egydimenziós, gyakrabban kétdimenziós gélelektroforézist alkalmaznak a többkomponensű fehérjekeverékek szétválasztására. A fehérjék kétdimenziós gélelektroforézissel történő elválasztásának elve a fehérjék közötti különbségen alapul, a molekulatömeg Hf izoelektromos pontjainak értékei szerint. A proteomikában ezeket a megközelítéseket bioanyag (szövet, vérplazma stb.) fehérjetérképezésére használják. Az 1D és/vagy 2D elektroforézis tömegspektrometriával való kombinációja lehetővé teszi az elkülönített és látható fehérjék azonosítását. A kétdimenziós gélelektroforézis eljárása azonban még mindig nem automatizált, végrehajtása meglehetősen bonyolult és időigényes, magas kezelői képesítést igényel, és az elemzési eredmények gyakran rosszul reprodukálhatók.

A kétdimenziós elektroforézissel összehasonlítva kényelmesebb, a fehérjék elválasztására szolgáló eljárás a nagy teljesítményű kromatográfia (HPLC); amely egy olyan automatizált eljárás, amely lehetővé teszi a magas kópiaszámú fehérjék eltávolítását egy összetett keverékből az alacsony kópiaszámú fehérjék későbbi azonosítása érdekében.

A komplex keverékekben lévő fehérjék közvetlen azonosítása érdekében egy kromatográfiás oszlop csatlakoztatható tömegspektrométerhez. Az érintetlen fehérjék azonban gyakorlatilag nem alkalmasak a HPLC-vel történő jó minőségű elválasztásra, mivel az elemzés során denaturálódnak (a tápközeg alacsony pH-értéke és a szerves oldószerek magas koncentrációja miatt), valamint a tömegspektrometriás elemzés alacsony pontossága miatt, ezért a legtöbb ép fehérjék, különösen a 10 kDa-t meghaladó molekulatömegűek közvetlen azonosítása gyakran lehetetlen. Az analitikai mérési pontosság javítható a fehérjék 700-4000 Da molekulatömegű peptidfragmensekre történő hidrolitikus hasításával proteázok segítségével; mint például a tripszin (alulról felfelé építkező technológia). A keverékben lévő fehérjék minőségi elválasztásához több kromatográfiás eljárás kombinációját alkalmazzák, az úgynevezett többdimenziós kromatográfiát.

A hepatitis diagnosztizálásának módszerei

Jelenleg a hepatitis C fehérjediagnózisára az anti-HCVcore kimutatására szolgáló tesztrendszereket használnak. Az 1990-es évek elején jelentek meg az első ELISA-tesztek, amelyek kimutatták az anti-HCVcore antitestek jelenlétét, de alacsony érzékenységgel és szelektivitással rendelkeztek. Később, az 1990-es évek végén megjelent az anti-HCVcore ELISA tesztek új generációja, amely meglehetősen magas, körülbelül 95-99%-os szenzitivitással rendelkezik, és több hónappal a fertőzés után kimutathatta a HCV-t.

Például 1996-ban megjelentek az orosz piacon a Vector-Best (Novoszibirszk) és a Diagnostic Systems (Nyizsnyij Novgorod) által kifejlesztett tesztrendszerek az antitestek kimutatására - az IgM osztályú anti-HCV. Az IgM antitestek szerodiagnózisban betöltött szerepét nem vizsgálták kellőképpen, azonban néhány tanulmány kimutatta ennek a markernek a jelentőségét a krónikus hepatitis C kimutatásában. Azt is megállapították, hogy a korreláció a vírus RNS és az anti-HCV IgM kimutatása között 80-95%. A vírusos hepatitis C fejlődési szakaszának meghatározása Afanasyev A.Yu. és munkatársai olyan együtthatót használtak, amely tükrözi az anti-HCV IgG és az anti-HCV IgM arányát a betegek vérében. A mai napig számos enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) rendszert fejlesztettek ki, amelyek kimutatják a keringő antitesteket a hepatitis E vírus számos epitópja ellen.

Modern laboratóriumi diagnosztikát végeznek: vírusos hepatitis E a legtöbb moszkvai egészségügyi intézményben; összhangban az Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériumának és az Egészségügyi Minisztériummal: Moszkva meglévő utasításaival és az immunglobulinok meghatározása? G osztályú hepatitis E vírus (anti-HGV IgG) a betegek vérszérumában. Ennek a markernek az azonosítása lehetővé teszi egy jelenlegi vagy múltbeli fertőzés jelenlétének megítélését.

A módszerek hátrányai; Az EEISA alapú kimutatások az alacsony érzékenység mellett (több mint GO "12 M)j a hamis kimutatásnak is köszönhetőek; vírusos hepatitis E betegeknél - a fertőzés utáni immunitás miatt,., az antitestek keresztreaktivitása, valamint a BFG fázis akut periódusának elégtelen érzékenysége. "hetsii1markers.

A vírusos hepatitis kimutatására szolgáló módszerek másik csoportja a szérumban: a vér - B_regisztráció, RNS BEI PCR segítségével; Az RNS meghatározása. BFG módszerek; A GAD nem használható elsődleges tesztként - megerősítésre vagy kizárásra; diagnózis; De; Lehet; Hasznos a diagnózis megerősítéséhez: 1 BFG diagnózisa az 5' nem kódoló RNS-régió elemzésével történik. Az elemzés eredményei azonban a különböző BFG genotípusok között változnak.

Az orosz piacon megjelentek a biológiai mikrochipek, amelyek lehetővé teszik - BFG genotipizálást és - hatékony vírusellenes rendszer meghatározását; terápia. Ez a biochip egy oligonukleotid chip a BFG genotipizáláshoz, amely az NS5B régió elemzésén alapul. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a biochip képes mind a 6 HCV genotípus és 36 altípus azonosítására, beleértve a legvirulensebb és gyógyszerrezisztens formákat is.

A PCR-elemzési módszerek egyrészt szuperérzékenyek, és lehetővé teszik a mintában lévő egyetlen RNS-molekula jelének kimutatását és erősítését, másrészt ezeket a módszereket a minták véletlenszerű szennyezettsége miatti hamis pozitív eredmények, a vírus nagy mutabilitása miatti hamis negatív eredmények és a viszonylag magas elemzési költségek jellemzik. Még ugyanabban a személyben is a HCV RNS szintje időszakonként több mint egy milliszeres ingadozást okozhat, ami hamis negatív eredményhez vezethet, ha alacsony? vírus replikációja, vagy ha a vírus a vérbe jutás nélkül megmarad a szövetekben. A különböző laboratóriumokban végzett RIG, HCV kvantitatív meghatározásának eredményei nem egyeznek eléggé.

A vírusos hepatitis C Bt bioanyagának korai felismerésében különösen értékesek a HCV fehérje antigének, mivel néhány héttel korábban, még a szervezet teljes értékű immunválaszának kialakulása előtt megjelennek1 a vérszérumban.

A hepatitis C vírus fertőzésének fő markere a hepatitis C vírus HCVcoreAg felületi antigénje, amelyet 16 héttel a szervezet immunválasza miatti antitestek megjelenése előtt a vérben és a klinikai tünetek kialakulása előtt mutatnak ki, míg a betegség akut és krónikus szakaszában egyaránt. Egyetlen külföldi kereskedelmi termék („Ortho Clinical Diagnostics”) létezik a hepatitis C akut fázisban történő ELISA-diagnosztikájára, amely a HCVcoreAg kimutatásán alapul.

A HCVcoreAg szerkezeti fehérje, amely 121 aminosavból áll, a polipeptid N-terminálisán helyezkedik el, és celluláris proteázok hatására jön létre. Az első proteolitikus hidrolízis a 191. és 192. aminosav között (C1 hely) megy végbe, és E1 glikoprotein képződéséhez vezet. A második hasítási hely (C2) a 174. és 191. aminosav között található. A megfelelő hasítási termékeket p21-nek és p23-nak nevezzük. Számos emlős sejtben az expresszió elemzése kimutatta, hogy a p21 a fő termék, míg a p23 kis mennyiségben található. Lehetséges, hogy a C1 és C2 helyeken történő hasítás egymással összefüggő folyamat, mivel a p21 olyan körülmények között képződik, amikor a G2-nél nem figyelhető meg hidrolízis [D45]. A HCVcoreAg a fő RNS-kötő fehérje, amely úgy tűnik, hogy a vírus nukleokapszidját képezi. Ennek a fehérjének a biokémiai tulajdonságai még mindig rosszul jellemezhetők. A hepatitis C vírus részecskéinek AFM-vizsgálatai lehetővé tették a HCV-kapszid képének elkészítését.

ASM chipek

A munka kísérleti részében kétféle AFM chipet használtunk. Az első típust modellfehérjék MS azonosítására használták AFM chipek felületén. Ezek a chipek funkcionálisan aktív kémiai csoportokat tartalmazó szubsztrátok voltak (a továbbiakban AFM chipek kémiailag aktivált felülettel), amelyeken a vizsgált molekulák felfogták és a kovalens kötések következtében visszafordíthatatlanul immobilizálódtak, az úgynevezett „kémiai halászat” eljárás. A második típusú AFM chipeket a vizsgálandó oldatból biospecifikusan izolált fehérjék felületén történő MS azonosítására használták. A biológiai szondákat korábban ezeknek a chipeknek a felületén rögzítették - a munkaterületeken. Biológiai próbaként a vírusos hepatitis B és C markerfehérjéi (BFB és BFC) elleni monoklonális antitesteket vagy a gpl20 fehérje és trombin elleni aptamereket használtuk. A biospecifikus halászati ​​eljárásokhoz kovalensen immobilizált próbamolekulákkal ellátott chipeket inkubáltak. %-os analit oldatban, amely csak kimutatható fehérjét, vagy vérszérummintákat tartalmaz

Az első típusú AFM chipek felületén kovalensen immobilizált modellfehérjék MS azonosításának feladatához a következőket használtuk a munkában: avidin (Agilent, USA), HSA (Agilent, USA), P450 VMZ (A.V. Munro professzor, Manchesteri Egyetem és FPB (Egyesült Királyság), thrombin a-a-FPB, USA); Az elemzőoldatból biospecifikusan izolált második típusú AFM chipek felületén lévő fehérjék MS azonosításának feladatához monoklonális antitesteket (MAB) használtak próbamolekulákként: anti-HCVcore (Virogen, USA), anti-HBVcore (Research Institute of Molecular Diagnostics, USA), HBV (Research Institute of Molecular Diagnostics, USA), HBV (Molekuláris Diagnosztikai Kutatóintézet, USA), HBVB, anti-HBVB. HCVcoreAg (Virogen, USA) és HBsAg (Aldevron, USA), gpl20 (Sigma, USA), troponin (USBio, USA).

Ezen kívül a következő anyagokat használtuk fel a munkában: acetonitril, izopropanol, hangyasav, desztillált víz (Merck, USA), trifluor-ecetsav (TFA), ammónium-hidrogén-karbonát (Sigma, USA), α-ciano-4-hidroxifahéjsav (HCCA), dihidroxibenzoesav), Németország (Pro-DHB) (sB, (DHB) tryps, USA).

Az AFM-vizsgálathoz szükséges vérszérummintákat az Orosz Állami Orvostudományi Egyetem Gyermekfertőző Betegségek Osztálya biztosította, a Roszpotrebnadzor Központi Epidemiológiai Kutatóintézete, MNIIEM "n. Gabrichevsky: A hepatitis C vírus (HCV) részecskék vérszérummintáiban való jelenlétét az Egészségügyi Minisztérium Monitoring Intézete (PCR) polimeráz láncreakció (PCR) vizsgálati rendszere segítségével igazolták a vérszérummintákban. RF, Moszkva).

Az AFM analízist az IBMC RAMS Nanobiotechnológiai Laboratóriumában végeztük. Az AFM chip felületén lévő fehérjék és antigén/antitest komplexek számítását a megfelelő fehérjék és komplexeik képeinek AFM segítségével mért magasságainak korrelációja alapján végeztük el, a -ban leírt módszer szerint. Az ACM NTEGRA (NT-MDT, Oroszország) használta. Az AFM méréseket félkontaktus módban végeztük. Szondákként az NT-MDT NSG10 sorozatú konzoljait használtuk. A tűk tipikus görbületi sugara 10 nm, a rezonanciafrekvencia 190 és 325 kHz között mozgott. A chip letapogatási területe 400 µm2 volt. Minden mérést legalább 3 alkalommal végeztünk el.

A fehérjék és aptamerek immobilizálását az AFM chip felületén a következő eljárás szerint végeztük.

Egy 2 µl térfogatú fehérjeoldathoz (0,1 µM) 8 µl NHS/EDC keveréket (v/v=l/l) adtunk, és alaposan összekevertük. A kapott keveréket felvisszük a szilanizált chip felületére, és 2 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A chipet ezután kétszer mostuk termoshakerben 1 ml ionmentesített vízzel 800 fordulat/perc sebességgel és 37 °C-on. A fehérje immobilizáció minőségét az AFM chip felületén atomerő mikroszkóppal követtük.

Az aptamerek immobilizálását az AEM chip kémiailag aktivált felületén az alábbiak szerint végeztük. A DSP 1,2 mM koncentrációjú törzsoldatához DMSO/etanolban (v/v=l/l)4 hozzáadtunk 50 mM PBS-pufferoldatot (pH 7,4), szintén 1/1 térfogatarányban. Az így kapott munkaoldatot az AFM chip felületére vittük fel és 10 percig inkubáltuk. Ezt követően 1 ml térfogatú 50%-os etanol vizes oldattal 15 °C-on 10 percig mossuk. 3 JIM koncentrációjú aptamer oldatot vittünk fel az AFM chip aktivált zónájára, és 4 percig inkubáltuk keverés közben 800 fordulat/perc sebességgel. A DSP térhálósító szer el nem reagált aminocsoportjainak blokkolását 5 mM Tris-HCl-oldat jelenlétében 10 percig 37 °C-on végeztük, A végső mosási lépést kétszer végeztük el. vizesoldat 1 ml térfogatú 10 percig 25 C-on.

150 mM NH4HCO3 pufferoldatot, acetonitrilt, 0,5 M guanidin-hidrokloridot és glicerint (pH 7,4) tartalmazó tripszinolitikus keveréket vittünk fel az AFM chip felületére immobilizált próbamolekulákkal. Ezután 0,5 μl módosított sertés tripszin oldatot adtunk 0,1 μM koncentrációban a pufferoldathoz. Az AFM chipet 2 órán át nedves környezetben, 45 °C-on állandó hőmérsékleten inkubáltuk, majd ismét 0,5 µl tripszin oldatot (0,1 µM) adtunk a felületére, és az inkubálást további 12 órán át folytattuk. A tripszinolitikus elegyet 70% acetonitrilt 0,7% trifluor-ecetsavban (TFA) tartalmazó 10 µl elúciós oldattal mostuk le az AFM chip felületéről. Az AFM chip felületéről így kapott hidrolizátumot vákuum-bepárlóban szárítottuk 45 °C-on és 4200 fordulat/perc sebességgel. Ezután a peptidkeveréket feloldottuk 10 µl 5%-os hangyasav-oldatban vagy 10 ul 0,7%-os TFA-oldatban a további MS analízishez.

A MALDI típusú ionizációs MS analízis során a mintákat az alábbiak szerint készítettük el. A 10 µl térfogatú 0,7%-os TFA-oldatban feloldott mintákat ZipTip C18 mikrotippekkel (Millipore, USA) betöményítettük és sómentesítettük a gyártó protokollja szerint, majd HCCA-t vagy DHB-t tartalmazó mátrix telített oldatával összekevertük 50%-os acetonitril-oldatban 0,7%-os TFA-val. A kapott keveréket egy MTP méretű MALDI targetre vittük fel.

- "kémiai halászattal" kifogott fehérjék azonosítása egy AFM chip felületén analitikus oldatból

Tovább ezt a szakaszt kísérleti munka Az AFM chipek felületére analitikus oldatból kémiailag immobilizált modellfehérjék MS spektrumát kaptuk. A vizsgált fehérjék koncentrációtartománya az avidin, HSA, anti-aFP analit oldatban 10"-10"9 M, troponin, aFP és P450 VMZ - 10"6-10"8 M.

Az MS analízist 6 féle, eredetükben, molekulatömegükben, a tripszinolízis helyek számában és térbeli elérhetőségükben, az aminosavszekvencia hidrofób jellegében (hidrofób és hidrofil aminosavak aránya) eltérő fehérjékre végeztük, amelyeket kovalensen rögzítettünk az AFM-oldat felületén (a T-analitból). Ezekben a kísérletekben AFM chipeket használtunk, amelyek tartalmazták a munka- és kontrollzónákat. A munkazóna az AFM chip felületének kémiailag aktivált területe volt, amelyen a modellfehérjéket „kémiailag halászták”; a kontrollzóna a forgács felületének kémiailag inaktív része volt. A megjelenített befogott molekulák számát AFM segítségével rögzítettük. A fenti modellfehérjékre kapott AFM-analízis kísérleti adatait, nevezetesen az AFM chip munkazónájának felületén megfogott molekulák számát a 2. táblázat mutatja be. A 2. táblázat "fehérjemolekulák koncentrációja az oldatban" oszlopban a megfelelő fehérje analitikus oldatban mért minimális koncentrációjára vonatkozó adatok láthatók.

Amint a 2. táblázatból látható, az AFM chip munkaterületén regisztrált molekulák száma az összes bemutatott fehérje esetében -1040 molekula volt. Az MS detektorok érzékenységi határa körülbelül 105 molekula. Így a bemutatott modellfehérjék esetében sikeres irreverzibilis immobilizációt hajtottunk végre az AFM chip felületén, és az AFM-regisztrált fehérje objektumok száma elegendő volt a későbbi MS azonosításhoz. Ugyanakkor a modellfehérjék minimális regisztrált koncentrációja az inkubációs oldatban meglehetősen alacsony volt, 10"-10" M.

A minták tömegspektrometriás analízisét MALDI és ESI típusú ionizációval végeztük. AFM chip a 10"9 M koncentrációjú avidin megfelelő oldatában történő inkubálás után. Ezen spektrumok elemzése lehetővé tette számunkra, hogy megbízhatóan azonosítsuk az avidint (Gallus Gallus) két proteotípusos peptidje alapján: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) és VGINIFTR (m/z=618,6) és VGINIFTR (m/z=460 peptidcsúcsok (m/z=460 jól meghatározott peptidek). Az AFM-chip kémiailag aktivált munkazónájának AFM-MS analízise 10"8 M koncentrációjú analit fehérjeoldatában végzett inkubálás után egy másik kis fehérjét - troponin I-t - mutatott ki.

Az 5. ábra egy globuláris fehérje, a humán szérumalbumin (HSA) tandem fragmentációs spektrumait mutatja, amely transzport funkciókat lát el a vérplazmában. A spektrumokat az AFM chip kémiailag aktivált munkazónájából kaptuk, miután inkubáltuk a megfelelő albumin oldatban, 10"9 M koncentrációban. Ezen spektrumok elemzése lehetővé tette a humán albumin megbízható azonosítását annak két proteotípusos peptidje alapján: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756,5) és mindkét peptid csúcsa (m/z=756.5) (m/z=756.5)/3-4. ly töltött ionok (MS).

Humán szérumalbumin oldatban (C=10 9 M) inkubált AFM chip kémiailag aktivált felületéről származó tripszinezett objektumok MS/MS spektrumai. VPQVSTPTLVEVSR peptid m/z = 756,5 (A), YLYEIAR peptid m/z = 464,3 (B). Kísérleti körülmények: a méréseket LC/MSD Trap XCT Ultra tömegspektrométeren (Agilent) végeztük.

Így az MS analízis lehetővé tette az AFM segítségével kimutatott fehérjék azonosítását. A kapott adatok alapján összefüggést tártak fel az AFM chip felületén azonosított proteotípusos peptidek száma és a vizsgálandó oldat kívánt fehérje tartalma között. Ilyen függőséget például az AFM chip kémiailag aktivált felületén kovalensen immobilizált VMZ és HSA P450 fehérjék esetében a 6. ábra mutat. A 6. ábrán látható módon minél nagyobb a fehérjekoncentráció az analit oldatban (-KG6 M), annál nagyobb számú peptidet lehet megbízhatóan azonosítani mind az ESIAL-DIMS-ben, mind az MSI-MS analízisben. A 10"6-10"9 M koncentráció-tartományban azonosított peptidek száma között nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a vizsgált fehérjék között az analitoldatban.

Az analit molekulák azonosított peptidjei számának függése az inkubációs oldat fehérjekoncentrációjától. (A) - HSA, VMZ modellfehérjék peptidkeverékének elemzése tömegspektrométereken MALDI típusú ionizációs Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Németország) és Autoflex III (Bruker Daltonics, Németország) készülékkel; (B) - HSA, VMZ modellfehérjék peptidek keverékének elemzése tömegspektrométeren ESI-típusú ionizációs LC/MSD Trap XCT Ultra készülékkel (Agilent, USA).

A kapott eredmények alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az AFM-MS (MALDI és ESI) lehetővé teszi az AFM chip felületén a vizsgálandó oldatból kovalensen kivont fehérjemolekulák kimutatását és azonosítását, amelyek fizikai-kémiai tulajdonságaikban különböznek egymástól.

Ugyanakkor az AFM chip (nem aktivált) kontrollzónájában az elemzőoldatban való inkubálása után az AFM módszer nem észlelte a fehérjemolekulák magasságának megfelelő objektumok jelenlétét a chip felületén. Az MS-analízis sem tárt fel fehérje jellegű objektumokat. Így kísérletileg bebizonyosodott, hogy az AFM megfelelően regisztrálja a kívánt objektumokat - az analit fehérje molekuláit.

A munka következő szakasza egy AFM-MS kombinációs séma kifejlesztése volt a za oldatából kinyert fehérjék azonosítására. biospecifikus kölcsönhatásokon keresztül.

A tömegspektrometriás analízis sémája fehérjék biospecifikus AFM-halászatánál oldatból a 7. ábrán látható. A fenti séma szerint először az AFM chipek munkaterületének felületén rögzítették azokat a próbamolekulákat, amelyek a vírusos hepatitis B és C fehérje markerei elleni monoklonális antitestek, míg a HIV-1 gplt2 fehérje felületi kontroll zónája nem tartalmazott hrombinteint és gplt20. immobilizált próba molekulák . A próbamolekulák immobilizálásának minőségellenőrzését AGM-vizualizációval végeztük. Ezután egy ilyen chipet inkubáltunk a vizsgált fehérjét tartalmazó analitikus oldatban. A chip felületén a nem specifikusan adszorbeált molekulák lemosása, valamint az AFM chip felületén a későbbi tömegspektrometriás analízishez szükséges minta előkészítés szakasza után elvégeztük az AFM-mel detektált fehérjék MS analízisét.

Ennek a szakasznak a kísérleti része két elemzési szakaszból állt. Az első szakaszban az AFM chipen kovalensen immobilizált fehérje próba molekulák MS azonosítását, a második szakaszban pedig a megfelelő partnermolekulákra biospecifikus kölcsönhatások miatt oldatból vagy vérszérummintákból megfogott célfehérjéket kellett elvégezni. Ebből a célból az AFM chipek felületére kovalensen immobilizált MCA MS analízisét végeztük HCV és HBV marker fehérjék: anti-HCVcore és anti-HBVcore ellen. Az anti-HCVcore és anti-HBVcore fehérjék elleni mAb-k esetében ebben a munkában először kaptunk tandem fragmentációs spektrumot és peptidtérkép-spektrumot.

nagy tárolási kapacitás, amely garantálja az aktív biológiai elvüket.

IRODALOM

1. Klychkova G.Yu. A tintahal, a lazac és a tokhal porcszövetéből készült komplex készítmény technológiájának fejlesztése // Vseros anyagai. Internet konf. fiatal tudósok. - Vlagyivosztok: TIN-RO-Center, 2004. - S. 164-170.

2. Metzler D. Biokémia. T. 2. - M., 1980. - 605 p.

3. Sukhoverkhova G.Yu. A hidrobionok porcos szövetének biokémiai jellemzői és a táplálékkiegészítők technológiája: Dis. ... cand. tech. Tudományok. - Vlagyivosztok, 2006. - 157 p.

4. Sytova M.V. Az amuri tokhal komplex feldolgozásának tudományos alátámasztása: Az értekezés kivonata. dis. ... cand. tech. Tudományok

M.: VNIRO, 2005. - 24 p.

Élelmiszer Biotechnológiai Tanszék

Beérkezett: 07.02.07

A KERATIN ENZIMATIKUS HIDROLIZÁTUM FEHÉRJE KOMPONENSÉNEK AZONOSÍTÁSA

Ch.Yu. SAMCHANOV, L.V. ANTIPOVA

Groznij Állami Olajintézet Voronyezsi Állami Technológiai Akadémia

A hús- és baromfifeldolgozó ipar másodlagos erőforrásainak feldolgozásának egyik leghatékonyabb módja a modern biotechnológiai módszerek alkalmazása élelmiszer-hidrolizátumok előállítására. A kapott termékek funkcionális és technológiai tulajdonságai fehérjekomponenseinek biokémiai összetételétől és molekulatömegétől függenek.

A fehérjék molekulatömegének fiziko-kémiai módszerekkel történő meghatározásakor az eredmény nemcsak a tömegtől, hanem a fehérjemolekula elektromos töltésétől és alakjától is függ, különösen a fehérje diffúziós sebességének, az ülepedési sebességnek a gravitációs térben történő megváltoztatásakor. Ebben a tekintetben a fehérjék molekulatömegének meghatározásakor célszerű használni statisztikai módszerek amikor a fehérjeoldat egyensúlyban van, például ha géllel töltött oszlopon vezetjük át.

A munka célja a keratin enzimatikus hidrolizátum fehérje komponenseinek M molekulatömegének és biokémiai összetételének meghatározása.

A keratin-hidrolizátum fehérje komponenseinek molekulatömegének meghatározására gélszűrési módszert alkalmaztunk. Sephadex v-100-at (közepes, részecskeátmérő 40-120 µm) használtunk 4000-150000 Da frakcionálási határértékkel.

Egy 46,0 x 1,9 cm-es oszlopot 0,02 M univerzális pufferrel (pH 7,0) kezelt Sephadex-szel töltöttünk meg. 1,5 cm3 -7 mg/cm3 - keratin-hidrolizátum oldatot vittünk fel rá, és ugyanazzal az univerzális pufferrel eluáltuk 12 cm3/h sebességgel. 3 cm3-es frakciókat gyűjtöttünk össze, majd SF-46-on 280 nm-en spektrofotometriásan meghatároztuk a fehérjetartalmat. A keratin-hidrolizátum-frakciók molekulatömegének meghatározásához a Sephadex oszlopot ugyanilyen körülmények között előkalibráltuk, több, ismert M-értékű tiszta (marker) fehérjét használva. A kalibrációs görbét a ^ M és a térfogat közötti lineáris összefüggés alapján állítottuk össze.

eluátum Ye, kiszabadul az oszlopból. táblázatban. Az 1. ábra a markerfehérjék néhány fizikai-kémiai jellemzőjét mutatja be.

Asztal 1

Marker protein M, Igen 1§ m V, cm3

Lizozim 13930 4,143 54

Tripszin 25700 4,409 48

Peroxidáz 34000 4,531 45

Szarvasmarha albumin 68000 4,832 36

Kék dextrán 2000000 6.301 21

Vízoldható frakció

keropeptid<10000 2,845 72

A keratin-hidrolizátum vízoldható frakciója sokkal kisebb térfogatban hagyja el az oszlopot, mint a legalacsonyabb molekulatömegű marker fehérje-lizozim. Ezért a keratin-hidrolizátumban (keropeptidben) nincsenek olyan fehérjefrakciók, amelyek M > 13930 Da. A hidrolízistermékek hozzávetőleges tömege 10 000 Da alatt van, Sephadex B-100 markerfehérjéken végzett gélszűréssel meghatározva. Lineáris függőségábrán látható ^ M fehérje és az oszlopról felszabaduló Ye eluátum térfogata. 1 (1 - kék dextrán; 2 - szarvasmarha albumin; 3 - peroxidáz; 4 - tripszin; 5 - lizozim; 6 - a keropeptid vízoldható frakciója).

A vizsgált 10000-5000 Da közötti markerfehérjék hiánya miatt a vízoldható fehérjefrakció keresése porózus módszerrel történt.

2. táblázat

M, Igen Oldható fehérje és peptidek, mg/cm3 Összes peptid és aminosav, µg/cm3 Tirozin, µmol/cm3 Redukáló anyagok, µg/cm3

0-10000 5,64 7337 7,835 2815

0-5000 4,21 5278 5,960 2272

kiindulási érték %-a 74,6 71,9 76,1 80,7

UPM-100 és UAM-50 minőségű membránok laboratóriumi ultraszűrő egységen (CJSC NPO Tekhkon). A séma magában foglalta magát a telepítést egy 5%-os keropeptid oldattal, amelyet mágneses keverőre helyeztek a folyamatos keverés érdekében. A fehérjeoldat hatékony elválasztása érdekében a berendezés felső részébe nyomás alatt sűrített levegőt vezettünk, melyből a hidrolízistermékek porózus membránokon keresztül, az ultraszűrlet kívánt molekulatömegétől függően váltakozva cserélve a készülék alsó részébe kerültek, majd egy fogadóedénybe gyűjtötték. Az így kapott ultrafiltrátumokban számos olyan biokémiai paramétert határoztunk meg, amelyek lehetővé tették a hidrolízistermékek molekulatömeg szerinti eloszlásának értékelését (2. táblázat).

A keropeptid kis molekulatömegű fehérjéket tartalmaz, M 5000-10000 Da értékkel. Tömeghányadukat a 0-10000 és 0-5000 Da frakciók leolvasási különbségeként becsülik, és 1,43 mg/cm3. Ez a frakció pozitív reakciót adott a ninhidrinreakcióra (2059 µg/cm3), a tirozinra (1,875 µmol/cm3) és a redukáló anyagokra (543 µg/cm3). A hidrolízistermékek fő része azonban a kisebb molekulatömegű frakcióban koncentrálódik, М.< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.

A keropeptid vízoldható fehérjefrakcióinak molekulatömegének további meghatározását Sephadex B-25-ön végeztük (átlagos, részecskeátmérő 50-150 μm), amely lehetővé teszi, hogy az 1000-5000 Da frakcionálási tartományba kerüljön. A gélszűrés körülményei változatlanok maradtak. Által

A frakciók fehérjemeghatározásának eredményeit az elúciós profil felépítéséhez használták fel. Valamennyi frakcióban a fehérje mellett ninhidrin módszerrel határoztuk meg a kis molekulatömegű anyagok, tirozin és redukáló anyagok (RS) tartalmát, valamint meghatároztuk a fehérjefrakciók mennyiségi eloszlását is. ábrán. A 2. ábra egy enzimes keratin-hidrolizátum gélkromatogramját mutatja Sephadex B-25-ön keresztül (1. görbe - fehérje; 2 - ninhidrin teszt; 3 - tirozin; 4 - PB).

Ebben az esetben a fehérjét két kis csúcs formájában mutatják ki szinte a legelső frakciókban. A fehérje tömeghányada az 1-8. számú frakciókban 3-24 cm3 között

meglehetősen magas értékekkel rendelkezik, és 0,12-0,18 mg/cm3 (1. görbe).

A termék nagy része a maximális fehérjecsúcsként került ki az oszlopból 27 cm3 eluátum térfogattal (9. számú frakció, egyenként 3 cm3 eluátum). A fehérje tömeghányadát ebben a frakcióban 0,66 mg/cm3 szinten regisztráltuk, ami 3-4-szer magasabb, mint a többi vizsgált frakcióban.

A keropeptid további eluálása 36-96 cm3 térfogattartományban három csúcsot mutatott ki, amelyekben a fehérje tömeghányada legfeljebb 0,08 mg/cm3-rel csökkent. A teljes keropeptid oldatot 96 cm3 végtérfogatban eluáljuk.

A 9. számú frakcióban a rendelkezésre álló RS teljes mennyiségét, 66 μg/cm3 tömegfrakciót találtunk (4. görbe). A ninhidrin reakciót gélkromatográfiában használták a hidrolízistermékek molekulatömeg szerinti eloszlásának azonosítására. Megállapítást nyert, hogy ha több ninhidrin és fehérjetermék lép kölcsönhatásba egy szabad MH2 csoporttal, és e csoportok számától függően lehetséges a fehérje lokalizálása.

RV, μg/cm3 175 co D 5 o l s; .7 0

100 125 X - 3 co o o. 0.5

80. § 100 2 _ n 0.4

60 1 isin, 7 sl 0,3

40 1 l 5 o - (P 2 o I- 0,2

20 25 _ 2 ai O 0,1

6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, cm

származékok Sephadexen keresztüli eluálással. Így a ninhidrin kis tömegű frakciója (4–6 µg/cm3) nagyon pontosan tükrözi a szabad aminocsoportok mennyiségét, és meghatározza a nagy molekulatömegű, М 3000–5000 Da molekulatömegű peptidek jelenlétét a J# 1–8 frakciókban (2. görbe). Ismeretes, hogy a hidrolízistermékek molekulatömegének mérési tartományában< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Igen. A ninhidrin minta (12-36. számú frakció) elúciós profiljának további elemzése olyan csúcsot mutatott ki, amely nem felelt meg a fehérjekoncentrációnak, ahogy azt a korábbi frakciókban a peptideknél megfigyelték. A kis molekulatömegű anyagok tömeghányada a 23. frakcióban 157 μg/cm3 volt, ami több mint 2-szerese a 9. frakcióban lévő peptidekének. A 9. és 23. frakcióban a fehérje és ninhidrin tesztparaméterek fordított arányos függése a 9. és 23. frakcióban az aminosavak minőségileg az utolsó frakciójának szabad termékeinek jelenlétét jelzi. A hozzátartozás és a tirozin aminosav (0,06 µmol/cm3) egy másik bizonyítéka a megfogalmazott helyzetnek.

Így a keratin-hidrolizátum gélszűrése Sephadex G-100-on és G-25-ön keresztül alacsony molekulatömegű oldott anyag jelenlétét jelzi.

a fehérjém (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Igen. Ebben az esetben a fehérjeláncok 5-20 aminosavból állnak. Fontos hangsúlyozni, hogy a 9. számú frakció egyszerre reagál a biuretkötésre, a ninhidrinre, a tirozinra és az RV-re. Ez a jellemző arra utal, hogy szénhidrátok jelen vannak a keratin fehérjében, és közvetlen kapcsolatban állnak a fehérjével, egyetlen komplex részeként.

IRODALOM

1. Antipova L.V., Pashchenko L.P., Shamkhanov Ch.Yu., Kurilova E.S. Élelmiszer-keratin-hidrolizátum beszerzése és jellemzése // Mezőgazdasági nyersanyagok tárolása és feldolgozása. - 2003. - 7. sz.

2. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S., Pozhalova N.A. Keratintartalmú nyersanyagok enzimatikus hidrolízisének folyamatának biokémiai jellemzői a baromfifeldolgozó iparban Izv. egyetemek. Élelmiszer-technológia. - 2003. - 5-6.

3. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S. Co -

pehelypehely alapanyagokból keropeptid előállításának technológiájának fejlesztése // Húsipar. - 2004. - 3. sz. - S. 44-47.

4. Rogov I.A., Antipova L.V., Dunchenko N.I., Zhereb-cov N.A. Az élelmiszer kémiája. 2 könyvben. Könyv. 1. Fehérjék: szerkezet, funkció, szerep a táplálkozásban. - M.: Kolos, 2000. - 384 p.

5. Osterman L.A. Fehérjék és nukleinsavak kromatográfiája. - M.: Nauka, 1985. - 536 p.

6. Kochetov G.A. Gyakorlati útmutató az enzimológiához. - 2. kiadás, átdolgozva. és további - M.: Feljebb. iskola, 1980. - 272 p.

Élelmiszertechnológiai Tanszék Hús- és Hústermékek Technológiai Tanszék

Megkapta a 0S.02.0-t? G.

A DOHÁNYKIVONAT ÖSSZETEVŐI MEGŐRÍTŐ HATÁSÁNAK MECHANIZMUSÁNAK ELMÉLETI MEGÁLLAPÍTÁSA

S.V. ZOLOTOKOPOVA, I.A. PALAGINA

Asztraháni Állami Műszaki Egyetem A Szaratovi Állami Társadalmi-gazdasági Egyetem asztraháni fiókja

Az elmúlt évek egyik fontos kutatási területe a különféle élelmiszer-adalékanyagok nemcsak ízre és aromára gyakorolt ​​hatásának vizsgálata, hanem az élelmiszerek eltarthatóságának növelésére is. Ősidők óta a fűszeres növényeket konzervgyártáshoz használták, asztali só, dohányzás, stb. Az elemzés azt mutatja, hogy jelenleg a piacot a füstkivonatok hódítják meg. A lakosság körében különösen népszerűek a füstölt ízű élelmiszerek, a hagyományos dohányzás pedig a füstmentessé válik.

Környezetbarát és ígéretesek a kíméletes körülmények között nyert kivonatok.

G.I. évtizedek óta dolgozik az extrakciós technológia fejlesztésén. Kaszjanov - az Orosz Föderáció tudományos és technológiai munkása, az Orosz Föderáció tiszteletbeli feltalálója, a műszaki tudományok doktora, professzor, a Kubai Állam Hús- és Haltermékek Technológiai Tanszékének vezetője műszaki egyetem. A KubGTU-ban és a vezetése alatt működő Krasznodari Mezőgazdasági Termékek Tárolási és Feldolgozási Kutatóintézetében működő „Növényi és állati eredetű nyersanyagok cseppfolyósított és sűrített gázokkal történő feldolgozásának elmélete és gyakorlata” tudományos és pedagógiai iskola a különféle nyersanyagok feldolgozásának hatékonyságának növelésének problémájával foglalkozik, ami javíthatja a termékek minőségét, csökkentheti a feldolgozási folyamatok időtartamát és egyúttal az energiaköltségeket.

kisózva: kicsapás lúgok, alkáliföldfémek (nátrium-klorid, magnézium-szulfát), ammónium-szulfát sóival; ugyanakkor a fehérje elsődleges szerkezete nem sérül;

csapadék: víztelenítő szerek használata: alkohol vagy aceton alacsony hőmérsékleten (kb. -20°C).

Ezen módszerek alkalmazásakor a fehérjék elveszítik hidratáló héjukat, és oldatban kicsapódnak.

Denaturáció- a fehérjék térszerkezetének megsértése (a molekula elsődleges szerkezete megmarad). Lehet reverzibilis (a fehérje szerkezete a denaturálószer eltávolítása után helyreáll) vagy irreverzibilis (a molekula térszerkezete nem áll helyre, például amikor a fehérjéket koncentrált ásványi savakkal, nehézfémek sóival kicsapják).

Fehérjeleválasztási módszerek Fehérjék elválasztása kis molekulatömegű szennyeződésektől

Dialízis

Speciális polimer membránt használnak, amely bizonyos méretű pórusokkal rendelkezik. A kis molekulák (kis molekulatömegű szennyeződések) áthaladnak a membrán pórusain, míg a nagy molekulák (fehérjék) megmaradnak. Így a fehérjéket lemossák a szennyeződésektől.

A fehérjék szétválasztása molekulatömeg szerint

Gélkromatográfia

A kromatográfiás oszlop gélgranulátummal (Sephadex) van megtöltve, amely bizonyos méretű pórusokkal rendelkezik. A fehérjék keverékét adjuk az oszlophoz. A Sephadex pórusok méreténél kisebb méretű fehérjék az oszlopban maradnak, mivel „beszorulnak” a pórusokba, a többi pedig szabadon hagyja el az oszlopot (2.1. ábra). A fehérje mérete a molekulatömegétől függ.

Rizs. 2.1. Fehérjék szétválasztása gélszűréssel

Ultracentrifugálás

Ez a módszer a különböző sűrűségű oldatokban (szacharóz-puffer vagy cézium-klorid) lévő fehérjemolekulák különböző sebességű ülepedésen (kicsapódásán) alapul (2.2. ábra).

Rizs. 2.2. Fehérjék elválasztása ultracentrifugálással

elektroforézis

Ez a módszer a fehérjék és peptidek elektromos térben a töltéstől függően eltérő sebességű migrációján alapul.

A gélek, a cellulóz-acetát, az agar hordozóként szolgálhatnak az elektroforézishez. A szétválasztandó molekulák méretüktől függően mozognak a gélben: a nagyobbak visszatartják a gél pórusait. A kisebb molekulák kisebb ellenállásba ütköznek, ezért gyorsabban mozognak. Ennek eredményeként az elektroforézis után a nagyobb molekulák közelebb kerülnek a kiinduláshoz, mint a kisebbek (2.3. ábra).

Rizs. 2.3. Fehérjék szétválasztása gélelektroforézissel

A fehérjék molekulatömeg alapján elektroforézissel is elválaszthatók. Erre a használatra elektroforézis PAAG-ban nátrium-dodecil-szulfát (SDS-Na) jelenlétében.

Az egyes fehérjék izolálása

Affinitáskromatográfia

A módszer azon alapul, hogy a fehérjék képesek nem kovalens kötésekkel erősen kötődni különböző molekulákhoz. Enzimek, immunglobulinok, receptorfehérjék izolálására és tisztítására használják.

Azok az anyagok (ligandumok) molekulái, amelyekhez bizonyos fehérjék specifikusan kötődnek, kovalensen egyesülnek egy inert anyag részecskéivel. A fehérjék keverékét hozzáadjuk az oszlophoz, és a kívánt fehérje szilárdan kapcsolódik a ligandumhoz. A fennmaradó fehérjék szabadon távoznak az oszlopból. A visszatartott fehérjét ezután kimoshatjuk az oszlopról a szabad ligandumot tartalmazó pufferrel. Ez a rendkívül érzékeny módszer lehetővé teszi nagyon kis mennyiségű tiszta fehérje izolálását egy több száz más fehérjét tartalmazó sejtkivonatból.

Izoelektromos fókuszálás

A módszer a fehérjék különböző IEP értékein alapul. A fehérjéket elektroforézissel választják el egy lemezen amfolinnal (ez egy olyan anyag, amelynek előre kialakított pH-gradiense 3 és 10 között van). Az elektroforézis során a fehérjéket IEP értékük szerint választják el (IEP-ben a fehérje töltése nulla lesz, és nem mozdul el az elektromos térben).

2D elektroforézis

Ez az izoelektromos fókuszálás és az SDS-Na-val végzett elektroforézis kombinációja. Először az elektroforézist vízszintes irányban, amfolinnal ellátott lemezen végezzük. A fehérjék a töltéstől (CEP) függően különülnek el. Ezután a lemezt SDS-Na oldattal kezeljük, és függőleges irányban elektroforézist hajtunk végre. A fehérjék osztályozása a molekulatömeg alapján történik.

Immunelektroforézis (Western-blot)

Egy mintában lévő specifikus fehérjék meghatározására használt analitikai módszer (2.4. ábra).

Fehérjék izolálása biológiai anyagokból.

Fehérjék molekulatömeg szerinti elválasztása elektroforézissel PAAG-ban SDS-Na-val.

A fehérjék átvitele a gélből a polimer lemezre a további munka megkönnyítése érdekében.

A lemez kezelése nem specifikus fehérjeoldattal a megmaradt pórusok kitöltésére.

Így e szakasz után egy lemezt kaptunk, amelynek pórusai elválasztott fehérjéket tartalmaznak, és a köztük lévő teret egy nem specifikus fehérje tölti ki. Most meg kell határoznunk, hogy az általunk keresett fehérjék között van-e felelős valamilyen betegségért. A kimutatásra antitestkezelést alkalmaznak. Az elsődleges antitestek alatt a kívánt fehérje elleni antitesteket értjük. A másodlagos antitestek alatt az elsődleges antitestek elleni antitesteket értjük. A másodlagos antitestek összetételéhez további speciális címkét (ún. molekuláris próbát) adnak, hogy később az eredmények láthatóvá váljanak. Jelölőként radioaktív foszfátot vagy a másodlagos antitesthez szorosan kötődő enzimet használnak. A primer, majd a másodlagos antitestekhez való kötődésnek két célja van: a módszer szabványosítása és az eredmények javítása.

A primer antitestek oldatával történő feldolgozás  a kötődés a lemez azon helyén történik, ahol van egy antigén (a kívánt fehérje).

A meg nem kötött antitestek eltávolítása (mosás).

Kezelés jelzett másodlagos antitestek oldatával a későbbi fejlesztéshez.

A meg nem kötött másodlagos antitestek eltávolítása (mosás).

Rizs. 2.4. Immunelektroforézis (Western-blot)

Abban az esetben, ha a kívánt fehérje jelen van a biológiai anyagban, egy sáv jelenik meg a lemezen, amely jelzi ennek a fehérjének a megfelelő antitestekhez való kötődését.

A fehérjék legjellemzőbb fizikai-kémiai tulajdonságai: az oldatok nagy viszkozitása, enyhe diffúzió, nagymértékű duzzadási képesség, optikai aktivitás, elektromos térben való mobilitás, alacsony ozmotikus nyomás és magas onkotikus nyomás, UV sugárzás elnyelési képessége 280 nm-en (ez utóbbi tulajdonság az aromás fehérjék determinációja miatt a fehérje kvantitatív, aminosavak determinációja).

A fehérjék, mint az aminosavak, amfoterek a szabad NH2 és COOH csoportok jelenléte miatt, és a savak és bázisok összes tulajdonsága jellemzi őket.

A fehérjék kifejezett hidrofil tulajdonságokkal rendelkeznek. Oldataik nagyon alacsony ozmózisnyomásúak, nagy viszkozitásúak és csekély a diffúziós képességük. A fehérjék nagyon nagy mértékben képesek duzzadni.

A rad a fehérjék kolloid állapotához kapcsolódik. jellemző tulajdonságok, különösen a fényszórás jelensége, amely a fehérjék nefelometriás kvantitatív meghatározásának hátterében áll. Ezt a hatást is alkalmazzák modern módszerek, biológiai tárgyak mikroszkópos vizsgálata. A fehérjemolekulák nem képesek átjutni a félig áteresztő mesterséges membránokon (celofán, pergamen, kollódium), valamint a növényi és állati szövetek biomembránjain, bár szerves elváltozásokkal, például vesékkel, a vese glomerulusának kapszula (Shumlyansky-Bowman) átjárhatóvá válik a vérszérum albuminjaiban, és a vizeletben megjelennek.

A fehérjék denaturációja Különböző fizikai és kémiai tényezők hatására a fehérjék koagulálódnak és kicsapódnak, elveszítve natív tulajdonságaikat. Így a denaturációt az általános terv megsértéseként kell érteni - a natív fehérjemolekula egyedi szerkezete, amely jellemző tulajdonságainak (oldhatóság, elektroforetikus mobilitás, biológiai aktivitás stb.) elvesztéséhez vezet. A legtöbb fehérje denaturálódik, ha 50-60 ° C feletti oldattal hevítik. A denaturáció külső megnyilvánulásai az oldhatóság elvesztésére, különösen az izoelektromos pontra, a fehérjeoldatok viszkozitásának növekedésére, a szabad funkcionális SH-rpypp mennyiségének növekedésére és a röntgenszórás természetének megváltozására csökkennek. A denaturáció legjellemzőbb jele a fehérje biológiai (katalitikus antigén vagy hormonális) aktivitásának éles csökkenése vagy teljes elvesztése. peptid kötések A polipeptid lánc gerincének része Ezzel egyidejűleg a natív fehérjemolekulák globulusai bontakoznak ki, és véletlenszerű és rendezetlen struktúrák képződnek.