ÕPIKUD JA ÕPETUSVAHENDID ÕPILASELE

KÕRGHARIDUSASUTUSED

V. N. KISLENKO

TÖÖTUBA

VETERINAAR

MIKROBIOLOOGIA

JA IMMUNOLOOGIA

Kinnitatud ministeeriumi poolt Põllumajandus RF sisse

kvaliteet õppejuhendülikooli üliõpilastele

õppeasutused eriala üliõpilased

"veterinaar"

MOSKVA "Koloss" 2005

UDC 619: 579 (075.8) BBK 48ya73 K44

Toimetaja T.S. Moyaochaeva
Arvustajad: veterinaarteaduste doktor, professor V. I. Plešakova(Veete Instituut

Omski Riikliku Põllumajandusülikooli ninameditsiin); veterinaariadoktor, professor IT. I. Ba

Rõšnikov(Altai Riikliku Põllumajandusülikooli veterinaarmeditsiini instituut)

Kislenko V. N.

K44 Veterinaarmikrobioloogia ja immunoloogia töötuba. - M.: KolosS, 2005.- 232 lk. l .: haige. - (Õpikud ja õpikud kõrgkoolide üliõpilastele). ISBN 5-9532-0332-2

Töötuba koosneb kahest osast. Jaotis "Üldmikrobioloogia" sisaldab teavet bakterioloogilise labori tööreeglite kohta, mikroorganismide uurimise peamiste mikrobioloogiliste, geneetiliste ja immunoloogiliste meetodite kirjeldust. Jaotises "Nakkushaiguste patogeenid" on loetletud laboridiagnostika meetodid, patogeenide eristamine ja kasutatud bioloogiliste preparaatide loetelu.

Antakse juhendid praktiliste tundide läbiviimiseks õpetajatele.

Lisatud on elektroonilise andmekandja (CD-ketta) testide komplektid üld- ja erimikrobioloogia, immunoloogia, samuti teoreetilise kursuse jaoks.

Kõrgkoolide üliõpilastele erialal "Veterinaar".

SISSEJUHATUS

Veterinaarlaborid on riikliku veterinaarteenistuse asutused, mille tegevus on suunatud heaolu tagamisele loomakasvatuses, loomade haiguste ja hukkumise ennetamisele ja likvideerimisele, samuti elanikkonna kaitsmisele loomadele ja inimestele levinud haiguste eest. Kokkuleppel on veterinaarlaborid rajooni-, rajoonidevahelised (tsoonid), piirkondlikud (territoriaalsed) ja vabariiklikud.

Veterinaarlaborite põhiülesanne on põllumajandusloomade, sealhulgas lindude, karusloomade, kalade ja mesilaste haiguste täpne diagnoos, samuti liha, piima ja muude loomse ja taimse päritoluga toiduainete uuringute läbiviimine. . Samuti teostavad laborid teaduslik töö, viia läbi mõnede biostimulantide, antibiootikumide jms tootmist.

Laboratoorsete uuringute materjaliks on veri, uriin, röga, piim, väljaheited, looma elu jooksul saadud abstsesside (mäda) sisu; parenhüümsete elundite või muude kudede tükid pärast nende surma, keskkonnaobjektide proovid (vesi, õhk, pinnas, sööt, taimed, hooldusvahendite pesuvedelikud). Laboris olevat materjali uuritakse bakterioloogiliste, seroloogiliste, histoloogiliste, biokeemiliste, mükoloogiliste ja toksikoloogiliste meetoditega, mille jaoks vajalikud tingimused(spetsiaalselt selleks ettenähtud ruumid, seadmed, mikrokliima jne).

Laboratoorium asub eraldi hoones, mis asub teedest eemal. Oleks pidanud vastuvõtu osakond, patoanatoomilised, bakterioloogilised, seroloogilised, biokeemilised ja viroloogilised osakonnad, samuti spetsiaalsed ruumid termostaatide, nõudepesu, autoklaavi jaoks. Nõudepesuruumis on lauad, kraanikausid, sooja ja külma veevarustus, gaasi- või elektripliit, restid pestud nõude jaoks, tõmbekapp, emailvannid, kraanikausid ja muud anumad, happelahus klaasanumates pipettide desinfitseerimiseks, liugused ja muud riistad. Eraldi ruum on eraldatud bakterioloogilisele köögile (keskkond-kivim), kus valmistatakse mikroorganismide kultiveerimiseks toitekeskkonnad ja steriliseerimiseks nõud. Siin hoitakse kappides steriilseid ja hästi pakitud nõusid keemilised ained, Komponendid kultuurimeedia.

Töö tegemiseks aseptilistes tingimustes on varustatud spetsiaalsed isoleeritud ruumid - kastid(inglise box - box), mis koosneb kastist endast ja eelkastist. Nad kasutavad ka lauabokse, esemeid ja õhku, milles desinfitseeritakse UV-lampidega, ning laminaarvoolukappe, kus kasutatakse ka aktiivset õhueemaldust.

Laboriloomad (valged hiired, merisead, valged rotid, küülikud jne) paigutatakse vivaariumid. Vivaariumis on reeglina ka terved doonorlambad, kelle verd kasutatakse komplemendi sidumise reaktsiooniks (CFR) ja toitekeskkonna valmistamiseks. Nakatunud laboriloomi hoitakse eraldatud ruumis.

Lisaks on majas ruumid spetsialistidele, teeninduspersonalile, juhataja kabinet, raamatukogu, kaalumisruum, riietusruum, ladu jne.

Korraliku puhtuse säilitamiseks on põrand tubades kaetud linoleumi või plaatidega. Seinad ja laed on reeglina siledad (ilma karniiside ja liistudeta), ümarate nurkadega, värvitud heledates toonides õlivärviga. Lagesid saab lupjaga lupjata. Seinad on soovitav spoonida plastmassi või plaatidega maast laeni.

Laboris peaks olema soe ja külm vesi, kanalisatsioon, jalakäitavad prügikastid, mida tühjendatakse, pestakse ja desinfitseeritakse igapäevaselt, käterätikud, seep ja desinfitseerimislahus. Ruumides on ainult kõige vajalikum tehnika: lauad, kapp pisitehnika hoidmiseks, värvid, reaktiivid, nõud, tööriistad jne. Lauad paigaldatakse tavaliselt akende ette. Need peaksid olema stabiilsed, mugavad, 80 cm kõrgused, veljega. Laudade pind on kaetud plastiku või linoleumi, klaasi või valge erivärviga. Lauale asetatakse mikroskoop, samuti bakterioloogiliseks tööks vajalikud esemed.

Bakterioloogiline uurimismeetod hõlmab reeglina mikroskoopiat, isoleerimist ja patogeeni puhaskultuuri omaduste uurimist ning laboriloomade nakatumist (bioloogiline proov). Bakterioloogilise analüüsi tulemused, millele on alla kirjutanud osakonnajuhataja või labori direktor, teatatakse ainult ametnikele: veterinaararstile, zooinsenerile, ettevõtte juhile.

Mikrobioloogilise labori seadmed.

Laboris töötamiseks on vaja järgmisi instrumente ja seadmeid: bioloogilised sukelmikroskoobid koos lisaseadmetega (illuminaator, faasikontrastseade, tumevälja kondensaator jne), luminestsentsmikroskoobid, termostaadid, steriliseerimisseadmed, pH-meetrid, seadmed

destilleeritud vee hankimine (destilleerija), tsentrifuugid, tehnilised ja analüütilised kaalud, filtreerimisseadmed (Seitzi filter jne), veevannid, külmikud, aparaat marli vatikorkide valmistamiseks, tööriistade komplekt (bakterioloogilised aasad, spaatlid, nõelad, pintsetid jne), laboriklaasid (katseklaasid, kolvid, Petri tassid, madratsid, viaalid, ampullid, Pasteur ja mõõtepipetid) jne.

Laboris on spetsiaalne mikroskoopiliste preparaatide peitsimise koht, kus on spetsiaalsete värvainete lahused, alkohol, happed, filterpaber jne Iga töökoht on varustatud gaasipõleti või piirituslambiga, purgiga desinfitseerimislahusega. Sest igapäevane töö laboris peavad olema vajalikud toitekeskkonnad, keemilised reaktiivid, diagnostilised preparaadid ja muud laborimaterjalid. Suurtes laborites on termostaatilised ruumid mikroorganismide massiliseks kasvatamiseks, seroloogiliste testide seadistamiseks.

Järgmised seadmed on ette nähtud kultiveerimiseks, kultuuride säilitamiseks, laboratoorsete klaasnõude steriliseerimiseks ja muudel eesmärkidel:

1. 
   Termostaat. Konstantset temperatuuri hoidev seade. Optimaalne temperatuur paljude mikroorganismide paljunemiseks on 37 "C. Termostaadid on õhk ja vesi.
2. 
   Mikroanaerostaat. Seade mikroorganismide kasvatamiseks anaeroobsetes tingimustes.
3. 
   Külmikud. Kasutatakse mikrobioloogilistes laborites mikroorganismide kultuuride, toitekeskkonna, vere, seerumite, vaktsiinide ja muude bioloogiliste preparaatide säilitamiseks temperatuuril umbes 4 °C. Valmististe hoidmiseks temperatuuril alla 0°C on ette nähtud madala temperatuuriga külmikud, milles hoitakse temperatuuri -20°C ja alla selle.
4. 
   Tsentrifuugid. Kasutatakse mikroorganismide, erütrotsüütide ja teiste rakkude settimiseks, mittehomogeensete vedelike (emulsioonid, suspensioonid) eraldamiseks. Laborites kasutatakse erinevate töörežiimidega tsentrifuuge.
5. 
   Kuivatus- ja steriliseerimiskapp (Pasteur ahi). Mõeldud laboratoorsete klaasnõude ja muude materjalide õhusteriliseerimiseks.
6. 
   Auru sterilisaator (autoklaav). See on mõeldud auruga steriliseerimiseks rõhu all. Mikrobioloogilistes laborites kasutatakse erineva mudeliga autoklaave (vertikaalsed, horisontaalsed, statsionaarsed, teisaldatavad).

Mikrobioloogialabori tööreeglid.

Mikrobioloog tegeleb eelkõige mikroorganismide puhaskultuuridega, mis on ühe raku järglased. Kuna õhus ja laboris olevate esemete pinnal (laudadel, instrumentidel, instrumentidel, aga ka riietel, kätel jne) on alati mitmesuguseid mikroorganisme, peaksite pidevalt hoolitsema selle puhtuse eest. uuritavad kultuurid. Seega, kui töötate sisse mikrobioloogiline labor tuleb rangelt järgida teatud reegleid, millest üks on puhtuse säilitamine, sealhulgas kõigi ruumide igapäevane hügieeniline koristamine.

Õhus ja pindadel olevate mikroorganismide hävitamiseks on erinevaid desinfitseerimismeetodeid.

Õhk laboris puhastatakse osaliselt ventilatsiooni abil. Ventilatsioon vähendab järsult õhus olevate mikroorganismide arvu, eriti kui ruumis ja väljas on oluline temperatuuride erinevus. Ventilatsiooni kestus on vähemalt 30 ... 60 minutit.

Tõhusam ja sagedamini kasutatav õhu desinfitseerimise meetod on kokkupuude ultraviolettkiirgusega (UVR), millel on kõrge antimikroobne toime ja mis põhjustab mitte ainult vegetatiivsete rakkude, vaid ka mikroorganismide eoste surma. Nõrga läbitungimisvõime tõttu ei läbi ultraviolettkiirgus tavalist klaasi ja tolmuosakesed neelavad kergesti. Seetõttu on steriliseerimiseks kokkupuuteaeg 30 minutist mitme tunnini, olenevalt õhusaaste astmest.

UV-kiirguse allikana kasutatakse bakteritsiidseid lampe (UFL). Nendes emitteriks on elavhõbeda madalrõhuaurudes tekkiv elektrikaar, mis kiirgab ultraviolettpiirkonnas lineaarset spektrit, mille energiast üle 80% langeb lainepikkusele 2,5 nm.

Bakteritsiidlamp on klaastoru, mis on paigaldatud kahe elektrikontakti vahele ja mis on drosseliga ühendatud võrku. Toru on valmistatud spetsiaalsest klaasist, mis laseb läbi kõik kiired lainepikkusega 2,5 nm ja viivitab kiirgust, mille lainepikkus on lühem kui 2 nm. Tuleb meeles pidada, et UV-kiirgus põhjustab vahetult pärast kiiritamist silma sarvkesta ägedat põletikku, millega kaasneb iseloomulik pisaravool ja valguskartus. Seetõttu kasutatakse otsese või peegeldunud ultraviolettkiirguse silmade mõjutamise vältimiseks kaitseprille. Väikestes ruumides on võimatu viibida, kui bakteritsiidne lamp on sisse lülitatud.

Mikrobioloogialaboris pühitakse põrand, seinad ja mööbel erinevate desinfektsioonivahendite lahustega. Tolmuimemisega eemaldatakse esemetelt tolm ja oluline osa mikrofloorast. Desinfitseerivate lahustena kasutatakse kõige sagedamini 0,5 ... 3%. vesilahus kloramiin. Eriti hoolikalt tuleks desinfitseerida laua pind, millel tehakse tööd mikroorganismidega. Seda tuleb desinfitseeriva lahusega pühkida nii enne kui ka pärast tööd. Täiendavad üksused pole töölaual lubatud. Kõik reaktiivid ja lahused peavad olema märgistatud ja rangelt määratletud kohtades. Laboris ei ole lubatud süüa, juua ja suitsetada. Töö peaks toimuma hommikumantlites.

Laboritingimustes kasvatatakse mikroorganisme tahkel ja vedelal toitainekeskkonnal, mis valatakse katseklaasidesse, kolbidesse või Petri tassidesse. Nõud ja söötmed on eelnevalt steriliseeritud. Mikroorganismirakkude viimist steriilsesse keskkonda nimetatakse külvamiseks või inokuleerimiseks. Mikroorganismide külvamine (või uuesti külvamine) nõuab teatud reeglite ranget järgimist, et kaitsta uuritavat kultuuri võõr mikroorganismidega saastumise eest.

Mikroorganismide inokuleerimine steriilses keskkonnas on kõige parem teha spetsiaalsetes ruumides - kastides. Boks on väike eraldatud ruum, mis on vaheseinaga jagatud kaheks osaks. Boksi põhitööruumi sisenetakse vestibüüli kaudu, millel on lükanduks, mis välistab õhu järsu liikumise ja sellest tulenevalt võõra mikrofloora sissetoomise väljastpoolt. Poksivarustusse kuuluvad kergesti puhastatava pinnaga laud, tool, gaasi- või piiritusepõletid, spetsiaalsesse alusele monteeritud või boksi lakke monteeritud bakteritsiidne lamp. Karbis on mugav omada abilauda, ​​millele töö käigus vajalikud esemed paigutatakse. Kogu kasti varustus, selle seinad, põrand ja lagi pestakse perioodiliselt ja pühitakse desinfitseerivate lahustega. Enne tööd kiiritatakse kasti bakteritsiidse lambiga 40...60 minutit.

Pärast külvi asetatakse katseklaasid või muud anumad, milles mikroorganisme kasvatatakse, termostaatidesse, kus termostaatide abil hoitakse ühtlast temperatuuri. Mikroobikultuure sisaldavad anumad, mis tuleb kõrvaldada, autoklaavitakse, et rakud enne pesemist tappa. Tiheda söötmega nõudesse valatakse desinfitseerimislahus, mis päeva pärast eemaldatakse ja nõud pestakse. Mikroorganismikultuuride hooletu ümberkäimine toob kaasa bakteriaalse aerosooli moodustumise, mis ohustab töötajate tervist.

Kõik laborite, aga ka mikrobioloogia osakondade töötajad, magistrandid, üliõpilased, kes tulevad tundidesse ja töötavad teaduslikes üliõpilasringides, enne nakkusohtliku materjaliga (patogeensete mikroobide kultuurid, katseliselt nakatunud loomade surnukehad, haigete loomade väljaheited) tööle asumist, veri jne) ) on kohustatud tutvuma ja rangelt järgima järgmisi tööreegleid ja ettevaatusabinõusids:

laboriruumidesse siseneda ainult spetsiaalsetes riietes: hommikumantlis, valges mütsis või sallis. Hommikumantel peaks olema tihedalt kinni nööbitud, juuksed mütsi alla lükatud;

Ärge tooge laborisse esemeid ega toitu. Portfellid ja kotid volditakse kokku spetsiaalselt selleks ettenähtud kohas;

laboris on rangelt keelatud süüa, juua ja suitsetada;

igale teatud arvu all olevale töötajale (õpilasele) eraldatakse töökoht, mikroskoop ja muud tarvikud;

töökohal peaks olema varustus ainult konkreetse ülesande jaoks. Tavaliselt on see värvide komplekt, destilleeritud veega kolb, äravoolutops, puhaste ja kasutatud klaasidega purgid, bakterioloogiline silmus, statiiv, purk desinfitseerimislahusega;

enne tööle asumist on vaja kontrollida seadmete, riistade, gaasipõletite (alkohollampide) jne saadavust ja töökõlblikkust. Täheldatud puudustest ja tõrgetest tuleb teatada vastutavale isikule ja klassiruumis - õpetajale;

plahvatuse vältimiseks ei ole võimalik ühte piirituslampi (või gaasipõletit) teisest süüdata; kasutage ainult tikke;

ärge puudutage elektrivõrgu juhtmeid ja kontaktosi metalli ja muude esemetega;

õpilased ei tohiks ilma õpetaja või saatjate teadmata elektriseadmeid ja -seadmeid sisse lülitada;

õpilased hakkavad ülesannet täitma ainult õpetaja loal; töö käik peab rangelt vastama uuritavale meetodile;

igaüks: töötaja ja õpilane peavad jälgima tööl puhtust, hoidma töökoha ja seadmed puhtana;

koolitustel kasutatud materjali peetakse eriti ohtlikuks;

uurimistööks saadetud materjali lahtipakkimisel tuleb olla ettevaatlik: purkide väliskülg pühitakse desinfitseeriva lahusega ja asetatakse ainult kandikutele või küvettidele;

saadud materjali uurimisel ja bakterikultuuridega töötamisel järgivad nad bakterioloogilises praktikas üldtunnustatud tehnilisi meetodeid, mis välistavad töötaja nakatumise võimaluse;

Nakkushaiguste patogeenide uurimise käigus peavad õpilased õppima konkreetsete patogeenidega töötamise ohutuseeskirjade tunnuseid;

katse(labori)loomade surnukehade lahkamine toimub spetsiaalsetes riietes varustatud laual kasutades vajalikud tööriistad kasutades selleks vahaga (või parafiiniga) täidetud küvetti. Pärast avamist on keelatud tööriistu lauale panna: need asetatakse desinfitseeriva lahusega klaasi või põletatakse põleti leegi kohal;

vedela nakatunud materjaliga töötamisel kasutage pipetiga ühendatud kummist õhupalle;

kui töö käigus patoloogiline materjal kogemata lauale satub, eemaldatakse see kohe desinfitseerimislahuses niisutatud tampooniga. Nakatunud materjaliga kokkupuutel nahal, konjunktiivil, suuõõnes võetakse desinfitseerimiseks erakorralisi meetmeid;

töö lõpus desinfitseeritakse patoloogiline materjal, kasutatud mikroorganismide kultuurid, instrumendid ja laua pind;

tunni lõpus peavad õpilased bakterikultuurid ja muu materjali õpetajale üle andma ning töökoha korda tegema. Rangelt on keelatud viia laborist välja tuubid koos kultuuride, preparaatide (äigetega) ja muude esemetega;

edasiseks tööks vajalikud patoloogilised materjalid ja bakterikultuurid jäetakse säilitamiseks suletud külmikusse või seifi;

enne laborist lahkumist peate eemaldama kitli, pesema käed põhjalikult ja ravima jodeeritud alkoholiga. Keelatud on väljuda laborist hommikumantliga;

tööreeglite ja ohutusnõuete järgimist mikrobioloogia koolitustel kontrollivad saatjad. Õpilased tutvuvad ohutusmeetmetega mikrobioloogia osakonnas töötades esimesel õppetunnil, mille nad allkirjastavad päevikusse.

Eeltoodud reegleid järgides tagab töötaja laboris manipulatsioonide steriilsuse ning hoiab ära laborisisese ja -välise saastumise.

Laboratoorsete dokumentide pidamine. Märkmik jaoks laboritööd toimib dokumendina, mis võimaldab kontrollida vastuvõetud andmete õigsust. See peaks sisaldama selle töö teostamiseks asjakohast teavet. Arvestust tuleb hoida korralikult, selgelt ja kindlas järjekorras, näiteks: 1) katse nimetus, selle tegemise ja lõpetamise kuupäev; 2) õppeobjekt; 3) katse läbiviimise tingimused; 4) kasutatava analüüsimeetodi aluspõhimõte; 5) katse tulemused.

Saadud tulemusi kirjeldatakse üksikasjalikult, digitaalne materjal võetakse tabelitesse, vajadusel graafikute, diagrammide, jooniste kujul. Iga laboritöö peaks lõppema oma tähelepanekute ja järeldustega, mis on kirja pandud töövihikusse.

Töö käigus omandavad õpilased mikroskoopia tehnikat ja meetodeid, tutvuvad erinevate mikroorganismide rühmade esindajate morfoloogiaga, omandavad lähenemise puhaskultuuride eraldamisele ja nende identifitseerimisele, uurivad keskkonnatingimuste ja -tegurite mõju kasvule. ja mikroorganismide erinevate jääkproduktide teket ning tutvuda mõne geeniuuringute meetoditega bakterid.

ÜLDMIKROBIOLOOGIA

Föderaalne Haridusagentuur

Riiklik õppeasutus

"Irkutsk Riiklik Ülikool»

VÄIKE MIKROBIOLOOGIA TÖÖTUBA

Õppevahend

Irkutsk 2009

UDC 579(076.5)

Avaldatud Irkutski Riikliku Ülikooli toimetuse ja kirjastusnõukogu otsusega

Zhilkini mikrobioloogia töötuba: õpik-meetod. toetus õpilastele. kõrgemale õpik asutused erialadel "Mikrobioloogia", "Bioloogia" ja "Füsioloogia".

6. Mikroobne mass ei tohi saastada käsi, lauda ega ümbritsevaid esemeid. Mahavalgunud mikroobide suspensioon neutraliseeritakse desinfektsioonivahenditega.

7. Peale töö lõppu antakse kultuurid üle õpetajale, külvatud katseklaasid ja tassid asetatakse termostaadi.

8. Bakterioloogilised aasad, nõelad, pintsetid ja muud metallesemed pärast kokkupuudet mikroorganismidega põletatakse alkohollambi leegis ja asetatakse spetsiaalsesse statiivi.

9. Kasutatud objektiklaasid ja katteklaasid, pipetid, spaatlid jms asetatakse 3–5% karboolhappe või muude desinfitseerivate lahuste lahusesse.

10. Katseklaasides, Petri tassides jne kulutatud kultuurid neutraliseeritakse päeva jooksul desinfitseerivate lahustega, seejärel keedetakse nõud ja pestakse.

11. Rangelt tuleb järgida isiklikku hügieeni – pärast töö lõpetamist peske käed põhjalikult seebi ja veega.

12. Elektriseadmete ja kemikaalidega töötamisel tuleb järgida ettevaatusabinõusid.

Föderaalne haridusagentuur

KARACHAYEV-CIRKASSI RIIKLIKU TEHNOLOOGIAAKADEEMIA

Loomsete saaduste tootmise tehnoloogia osakond

MIKROBIOLOOGIA

METOODILISED JUHISED

õpilastele mõeldud labori- ja praktilisteks tundideks

põllumajandusinstituut

Tšerkessk - 2010

Koostatud eeskujuliku ja tööprogrammid kursusel "Mikrobioloogia" vastavalt riigile haridusstandard erialane kõrgharidus erialal 110305 "Põllumajandussaaduste tootmise ja töötlemise tehnoloogia" ja 110201 "Agronoomia" (2000).

Arutati TPPZH osakonna koosolekul (2. juuli 2009 protokoll)

Kinnitatud Põllumajandusinstituudi metoodilise komisjoni poolt (01.01.2001 protokoll nr 6). Avaldatud Karatšai-Cherkessi Riikliku Tehnoloogiaakadeemia haridus- ja metoodikanõukogu otsusega (protokoll 01.01.2001)

Koostanud: Bioloogiateaduste kandidaat, dotsent , Põllumajandusteaduste kandidaat, dotsent , assistent

Arvustajad: – bioloogiateaduste kandidaat

agronoomiakateedri dotsent

TPPZh osakonna dotsent

Toimetaja: Ph.D. Teadused, dotsent
Sisu

Sissejuhatus…………………………………………………………………………….. 6

1. Mikroskoopia…………………………………………………………………….. 7

1.1. Valgusvälja mikroskoopia ……………………………………………. .7

1.1.1. Mikroskoobi seade…………………………………………………… 7

2. Töö mikroorganismidega …………………………………………………. 8

2.1.Valmististe valmistamise meetodid…………………………………………………………………………………………………………………

2.1.1. Valmististe jaoks kultuuri võtmise tehnika……………………………… 8

2.1.2. Mikroorganismide elusrakkude uurimine meetodil

purustatud tilk …………………………………………………………….. 8

2.1.3. Mikroorganismide püsipreparaadid…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Valgustussüsteem asub lava all. Peegel peegeldab sellele langevat valgust kondensaatorisse. Peegli üks pool on tasane, teine ​​nõgus. Kondensaatoriga töötamisel on vaja kasutada tasapinnalist peeglit. Nõgusat peeglit kasutatakse madala suurendusega objektiividega töötades ilma kondensaatorita. Kondensaator koosneb 2-3 lühifookusega objektiivist, kogub peeglist tulevad kiired kokku ja suunab need objektile. Sukeldussüsteemidega töötamisel on vaja kondensaatorit. Kondensaatoril on iirise (kroonlehtede) diafragma, mis koosneb poolkuukujulistest terasplaatidest.

Määrdunud preparaate käsitletakse peaaegu täielikult avatud diafragmaga, värvimata - vähendatud diafragma avaga.

Objektiiv- mitme objektiiviga süsteem, mille kvaliteet määrab objekti kujutise. Välist objektiivi nimetatakse esiläätseks, see annab suurenduse. Ülejäänud läätsed täidavad optiliste defektide korrigeerimise funktsioone.

Objektiivid on kuivad ja sukeldatud (immersioon). Kuivate läätsedega töötamisel on objektiivi esiläätse ja uuritava objekti vahel õhk. Töötades immersioonobjektiiviga V = 90x, on katteklaasi ja objektiiviläätsede vahel seedriõli, mille murdumisnäitaja on lähedane klaasi murdumisnäitajale vastavalt 1,515 ja 1,52. Objektiividel on 8x, 40x ja 90x suurendus.

Okulaar toimib inimsilma "läätsede" (läätsede) otseseks jätkuks.

Okulaar koosneb kahest läätsest - ülemisest - silmast ja alumisest - kollektiivsest, mis on suletud metallraamiga. Okulaari eesmärk on suurendada pilti, mille objektiiv annab. Okulaari suurendus on graveeritud selle raamile. Okulaaride töösuurendus on vahemikus 4x kuni 15x.

Okulaare on mitut tüüpi ja valik sõltub objektiivist. Pikaajalisel mikroskoobiga töötamisel kasutatakse binokulaarset kinnitust, kuna see parandab objekti nähtavust, vähendab pildi heledust ja säilitab seeläbi nägemise.

Töötamine mikroorganismidega

2.1. Ettevalmistusmeetodid

2.1.1. Ettevalmistuskultuuri tehnika

Leegis põlenud bakterioloogiline nõel võtab katseklaasist väikese koguse mikroobset massi. Kui kultuur on vedel, on parem kasutada selleks silmust, muudel juhtudel - nõela.

2.1.2. Mikroorganismide elusrakkude uurimine purustatud tilga meetodil

Uurige mikroorganismide elusrakke purustatud tilga meetodil, värvige objekt eelnevalt eluaegsete värvainetega - elutähtis värvimine(värvained: metüleensinine, neutraalne punane kontsentratsioonides 0,001 kuni 0,0001%).

Preparaadid on mikroskoobiga, vaatevälja veidi tumedamaks; kondensaator on veidi madalamal, valgusvoogu reguleerib nõgus peegel. Esiteks kasutavad nad madalat suurendust – 8x objektiivi, pärast tilga serva tuvastamist paigaldavad 40x või keelekümblusobjektiivi (90x).

Purustatud tilga meetodi puhul kantakse puhtale slaidile tilk kraanivett. Sellele lisatakse kultuur ja segatakse veega. Liigne vesi eemaldatakse filterpaberiga. Sukelläätse kasutamisel kantakse slaidile tilk seedriõli ja mikroskoobitakse.

2.1.3. Mikroorganismide fikseeritud preparaadid

Fikseeritud preparaadid hõlmavad sellist elusrakkude töötlemist, mis võimaldab kiiresti katkestada objekti eluprotsesside kulgu, säilitades samal ajal selle peenstruktuuri. Fikseerimise tulemusena kinnituvad rakud kindlalt klaasi külge ja määrduvad paremini. Fikseerimine on vajalik patogeensete mikroorganismidega töötamisel (ohutuse huvides).

Määri ettevalmistamine. Tilk kraanivett kantakse puhtale rasvavabale slaidile. Klaasi rasvatustamiseks kasutage etüülalkoholi ja vääveleetri segu vahekorras 1:1. Kaltsineeritud bakterioloogilise nõelaga võetakse kultiveerimiskatsutist väike kogus mikroobset massi ja lisatakse tilgale veele. Tilk määritakse ettevaatlikult silmusega klaasile umbes 4 cm2 suurusel alal.

Kui suspensioon on paks, lahjendatakse see kõigepealt veega. Selleks võetakse kaltsineeritud silmusega veidi suspensiooni ja kantakse teisele slaidile veetilgale. Normaalse tihedusega suspensioon määritakse õhukese kihiga klaasile, seejärel kuivatatakse määrdeaine õhu käes toatemperatuuril või madalal kuumusel, hoides preparaati kõrgel põleti leegi kohal. Ravimi tugevat kuumutamist kuivatamise ajal ei soovitata, et vältida valkude koagulatsiooni, mis moonutab rakkude struktuuri ja kuju. Kuivatatud preparaat on fikseeritud.

Määrde fikseerimine. Teda kantakse välja põleti leegi kohal või kemikaalide abilühtsused. Esimesel juhul manustatakse ravim aeglaselt kolm kuni neli korda põhjaga üle põleti leegi, teisel juhul kasutatakse kroomiühendeid: formaliini, osmiinhapet, atsetooni. Üks levinumaid fikseerimismeetodeid on preparaadi töötlemine 96% alkoholiga või võrdsetes kogustes etüülalkoholi ja eetri seguga (Nikiforovi vedelik). Selleks kastetakse preparaadid 10-30 minutiks fikseerivasse vedelikku.

Ravimi värvimine. Määrdile kantakse mõni tilk värvainet. Sõltuvalt värvaine tüübist ja uuringu eesmärgist varieerub värvimise kestus 1 kuni 5 minutit, mõnel juhul kuni 30 minutit. Värvimise lõppedes pestakse preparaat veega, eemaldatakse vesi filterpaberiga, kuivatatakse õhu käes ja uuritakse mikroskoobiga.

On olemas lihtsad ja diferentseeritud värvimismeetodid.

Kell lihtne värvimisel mis tahes värviga (metüleensinine, fuksia, emajuurviolett), värvitakse kogu rakk.

Kell diferentseeritud värvimisel värvitakse üksikuid rakustruktuure erinevate värvainetega (Grami peits, spoorivärv).

Mikroorganismide morfoloogia uurimine

3.1. raku kuju

3.1.1. bakterid

Kuju järgi jagunevad kõik bakterid sfäärilisteks (kokkide), pulgakujulisteks ja keerdunud.

Kerakujulised bakterid - kookid.

1. mikrokokid -üksikud sfäärilised rakud ( Mikrokokk agilis).

2. Diplokokid - sfäärilised kookid on paarikaupa ühendatud. ( Azotobakter krookokk).

3. Tetrakokid- sfäärilised kookid, mis on ühendatud neljaga.

4.streptokokid- ahelates ühendatud sfäärilised bakterid (peamiselt patogeensed, samuti piimhappebakterid Laktokokk lactis).

5. Sartsiinid- sfäärilised bakterid, mis on rühmitatud 8 rakku, tekivad rakkude jagunemise tulemusena kolmel üksteisega risti asetseval tasapinnal. Teatud tüüpi sarkiinid moodustavad suuri kuubikujulisi pakendeid, mille mõlemal küljel on 4 sarkiini. tüüpiline esindaja Sarcina flava(sarcina yellow) - õhu mikrofloora kõige levinum esindaja.

Kõik kerakujulised bakterid v.a Streptokokk lactis, vaadatuna fikseeritud ja magenta peitsiga preparaatidel.

pulgakujulised bakterid. Nende hulka kuuluvad vormid, mis ei moodusta eoseid (perekonnad Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillus jne) ja eoseid moodustav (perekonnad batsill, Clostridium ja jne).

Mitteeoseid moodustav batsill Pseudomonas stutzeri – selle tsütoplasma värvub ühtlaselt.

eoseid moodustavad vardad Bacillus mycoides Ja Bacillus mesentericus. Mikroskoobi all tunduvad need ebaühtlaselt värvitud. Eosed ei määrdu nagu tihedamad struktuurid. Rakud batsill mükoiidid ahelatesse paigutatud, need on streptobatsillid.

Vardakujulisi baktereid vaadeldakse fikseeritud ja värvitud preparaatidel.

Keerdunud vormid

1. Vibrid – kergelt kumerad rakud.

2. Spirillal võib olla üks lokk vene tähe C kujul, kaks lokki ladina tähe S kujul või mitu spiraalikujulist lokki.

3. Spirochetes - pikad ja õhukesed rakud, millel on suur hulk lokke; rakkude pikkus ületab nende paksuse 5-200 korda.

Vibriot ja spirillat on mugav vaadata fikseeritud ja peitsitud preparaadil, mis on valmistatud lägast, mida on eelnevalt mitu päeva termostaadis inkubeeritud. Sellise preparaadi paljudest mikroorganismidest leidub sageli keerdunud vorme.

Spiroheetidega saab tutvuda fikseeritud peitsitud hambakatu preparaadil, eriti edukad on kaariese hamba kraapimise ettevalmistused. Hambaspiroheedid on väga õhukesed, karvakujulised, lühikesed (ainult 2-3 pöörist).

3.1.2. aktinomütseedid

Aktinomütseedid on kiirgavad seened. Toitekeskkonnas asuv aktinomütseel on diferentseeritud: üks osa sellest on sukeldatud substraadi sisse (substraadi seeneniidistik), teine ​​on substraadi kohal (õhumütseel).

Paljud aktinomütseedi esindajad toodavad pigmente, seetõttu on nende õhust seeneniidistik ja eriti kolooniad värvitud siniseks, siniseks, lillaks, roosaks, pruuniks, pruuniks või mustaks. Aktinomütseedid värvivad toitainekeskkonda sobivates värvides.

Tükk aktinomütseedi kolooniat asetatakse koos söötmega slaidile. Teise klaasslaidiga surutakse see tükk tihedalt vastu klaasi, purustatakse ja määritakse klaasile. Ravim kuivatatakse, fikseeritakse, värvitakse, vaadeldakse mikroskoobi all, kus on osaliselt nähtavad mütseeli üherakulised niidid.

3.1.3. Pärm

Pärmseened on üherakulised erineva kujuga mikroskoopilised seened: ellipsoidsed, pirnikujulised, ümmargused, silindrilised. Nad paljunevad vegetatiivselt ja seksuaalselt.

Pagaripärmi kasutatakse laboriuuringuteks. Väike tükk pärmimassi paar tundi enne klassi asetatakse sooja suhkrustatud vette ja asetatakse sooja kohta. Tekib valkjas hägune vedelik. Tilk seda vedelikku kantakse slaidile, kaetakse katteklaasiga, peale kantakse tilk seedriõli ja preparaati vaadatakse immersioonisüsteemiga. Nähtavad tärkavad ja jagunevad rakud.

3.2. Keemilised meetodid uurimine

3.2.1. Mikroorganismide rakkude grammi värvimine

See mikroobirakkude diferentseerimise meetod põhineb rakumembraanide keemilise koostise erinevustel. Mõnda tüüpi mikroorganismide rakkudes moodustub põhivärviga alkoholis lahustumatu joodiühend, teiste liikide puhul ilmneb see ühend ajutiselt ja lahustub pärast alkoholiga töötlemist. Esimese rühma mikroorganisme nimetatakse grampositiivne teine ​​- gramnegatiivne.

Grami peitsitehnika. Kolm õhukest määrdumist erinevatest mikroorganismide kultuuridest kantakse rasvatustatud slaidile (neist kaks on kontrollproovid, millel on teadaolev seos Grami peitsiga). Määrd kuivatatakse õhu käes, fikseeritakse põleti leegi kohal ja värvitakse 1 minut emajuurvioletse (või kristallvioleti) fenoolilahusega, hoides slaidi veidi kallutatud asendis. Seejärel värvaine kurnatakse ja ilma preparaati veega pestes kantakse sellele 1 minutiks Lugoli lahust (kuni määrdumine on täielikult mustaks muutunud). Klaasi hoitakse kaldus asendis. Ravimit töödeldakse veega pesemata, pidevalt loksutades, 96% alkoholiga 15-20 sekundit. Värvimuutusajast on oluline kinni pidada, kuna määratud aja ületamisel muutuvad ka grampositiivsed rakud värvi.

Pärast veega pesemist värvitakse preparaati 1 min Pfeifer fuchsiniga. Gram-positiivsed mikroorganismid omandavad tumelilla värvuse ja gramnegatiivsed mikroorganismid värvivad lisavärviga (magenta).

Gram-värvimise tulemused sõltuvad kultuuri vanusest: vanades kultuurides värvuvad surnud rakud alati gramnegatiivselt. Seetõttu on parem kasutada noori ühepäevakultuure.

Pärmid on head sihtmärgid mikroobirakkude grammivärvimiseks. Bacillus mesentericus või Bacillus subtilis(gram-positiivne) ja Escherichia coli (gramnegatiivne).

Värvid ja reaktiivid Grami värvimiseks.

1. Egentianvioleti fenoollahus: emajuurviolett - 1 g, alkohol 96% - 10 ml, kristalne fenool - 2 g, destilleeritud vesi - 100 ml.

Mõnel juhul rakendage emajuure alkoholilahuslilla: emajuurviolet (või kristallviolet) - 1 g, alkohol 96% (rektifitseeritud) - 100 ml, glütseriin - 5 ml. Segu asetatakse 24 tunniks termostaadi, seejärel filtreeritakse.

2. Lugoli lahendus(kaaliumjodiit - 2 g, kristalliline jood - 1 g, destilleeritud vesi - 300 ml). Esiteks valmistatakse 5 ml vees kontsentreeritud kaaliumjodiidi lahus, lahustatakse selles jood, seejärel lisatakse 300 ml-ni vett.

3. Alkohol 96%.

4. Fuchsin Pfeiffer(Zieli karboolfuchsiini vesilahus): 1 ml Zieli karboolfuksiini ja 9 ml destilleeritud vett. See valmistatakse järgmiselt: 1 g fuksiini, 5 g kristalset fenooli, 96% alkoholi - 10 ml, mõni tilk glütseriini, 100 ml destilleeritud vett, fukssiin lahustatakse etanoolis, lisatakse vees lahustatud fenool. Lahust segatakse ja jäetakse mitmeks päevaks seisma. Enne kasutamist filtreeritakse.

3.2.2. Bakterite spooride värvus

Bakterite eosed on vegetatiivsete rakkudega võrreldes väga vastupidavad ebasoodsate keskkonnatingimuste suhtes. Need on ümmargused, ovaalsed või elliptilised moodustised. Kui eoste läbimõõt ei ületa selle raku läbimõõtu, milles eos on tekkinud, nimetatakse rakku nn. bakillaar, kui see ületab, siis sõltuvalt eose asukohast lahtri keskel või lõpus nimetatakse seda rakku vastavalt klostridiaal või plektriid . Baktsillaarrakus võib eos asuda raku keskel - keskne positsioon lõpus terminal ja ühele otsale lähemal - alamterminal positsiooni.

Elusaid eoseid moodustavaid baktereid jälgides saab nende eoseid eristada valguskiirte tugevama murdumise järgi. Eosed on happekindlad, seetõttu on neid raske värvainetega värvida. Seda seletatakse koore suure tihedusega, vaba vee madala kontsentratsiooniga selles ja lipiidide suure sisaldusega eostes. Valmististes peitsitud lihtsaid viise või Grami järgi jäävad eosed värvituks (negatiivne värv).

Kõik spooride värvimise meetodid põhinevad ühtne põhimõte: esiteks söövitatakse eosed erinevate ainetega: kroom-, vesinikkloriid-, väävel-, äädikhape, ammoniaak, seebikivi või vesinikperoksiid, seejärel eosega rakk värvitakse kuumutamisel ja lõpuks tsütoplasma värvus muutub ja värvitakse täiendavalt kontrastset värvi.

Mulleri poolt modifitseeritud Ziehl-Neelseni meetod. Enne bakterite määrdumise kinnitamist leegile valmistatakse preparaat tavalisel viisil. Järgmisena kantakse leegis fikseeritud ravimile 5% kroomhappe lahus ja jahutatakse. 5-10 minuti pärast pestakse see veega maha. Preparaat kaetakse filterpaberi ribaga ja paberit niisutatakse ohtralt Ziehl karboolfuksiiniga. Ravimit kuumutatakse leegi kohal, kuni tekivad aurud (mitte keemiseni), seejärel võetakse see kõrvale ja lisatakse uus osa värvainet. Seda protseduuri tehakse 7 minutit. Tähtis on, et värvaine aurustuks, aga paber ei kuivaks ära. Pärast jahutamist see eemaldatakse, preparaati pestakse veega ja kuivatatakse põhjalikult filterpaberiga. Selle töötlemise tulemusena värvuvad eostega rakud ühtlaselt.

Järgmisena muudetakse rakkude (kuid mitte eoste) tsütoplasma värvi, töödeldes 1% vesinikkloriid- või väävelhappe lahusega 15-30 sekundit. Eospreparaadi valmistamisel batsill mükoiidid või batsill mesentericus tsütoplasmast on soovitatav värvitustada 16-18 sekundit (mõõdetuna valjusti lugedes 21-st 37-40-ni). Kui see aeg ületatakse, võivad eosed ka värvi muuta. Seejärel pestakse preparaati veega ja värvitakse 2 minutit metüleensinisega.

Värvus on kontrastne ja tsütoplasma sinisel taustal paistavad selgelt esile erkpunased eosed.

Peškovi meetod. Metüleensinine Leffler valatakse leegis fikseeritud preparaadile, lastakse keema tõusta ja keedetakse 15-20 s, hoides klaasi leegi kohal. Määri pestakse veega ja värvitakse 30 0,5% neutraalse punase vesilahusega. Loputage uuesti, kuivatage ja seejärel uurige preparaati objektiivi õliimmersiooniga. Eosed värvuvad siniseks või siniseks, tsütoplasma on roosa.

Eoste uurimiseks võivad olla mugavad esemed batsill mesentericus või batsill mükoiidid 4 päeva vanuselt.

Reaktiivid bakterite spooride värvimiseks. 1. Karbol fukssiinTsilja(vt 3.2.1).

2. Metüleensinine Leffler(vt 3. 2. .1).

3. Metüleensinise küllastunud vesilahus. 2 g värvainet ja 100 ml destilleeritud vett.

4. kroomhape, 5% lahus.

5. soola(või väävelhape, 1% lahus.

4. Mikroorganismide kasvatamine

4.1. Toiteainekeskkond

4.1.1. Meedia ettevalmistamine

Liha-peptoonpuljong (MPB). Liha-peptooni söötme valmistamiseks kasutada lihapuljong, mis saadakse järgmiselt: 500 g värsket peeneks hakitud liha valatakse emailpannile 1 liitri kraaniveega, mis on kuumutatud temperatuurini 50 °C, ja lastakse tõmmata 12 tundi toatemperatuuril või 1 tund temperatuuril 50–55 ° C. . Liha pressitakse välja, ekstrakt filtreeritakse läbi marli vatikihiga, keedetakse 30 minutit kolloidvalkude koaguleerimiseks ja filtreeritakse kaks korda (esimesel korral läbi marli vatiga, teisel korral läbi paberfiltri). Filtraat täidetakse veega 1 liitrini, valatakse kolbidesse, suletakse vatikorkidega ja steriliseeritakse 120°C juures 20 min (kolbide korgid suletakse ülalt paberkorkidega).

Lihapuljongit saab söötme valmistamiseks kasutada igal ajal. Kui need keedetakse kohe, ei ole lihapuljongi eelnev steriliseerimine vajalik.

MPB valmistamiseks lisa 1 liitrile lihapuljongile 5-10 g peptoon(esimene valgu hüdrolüüsi saadus), et suurendada söötme kalorisisaldust ja 5 g lauasool osmootse aktiivsuse tekitamiseks. Söödet kuumutatakse pidevalt segades, kuni peptoon lahustub.

Söötme neutraalne või kergelt aluseline reaktsioon saavutatakse 20% Na2C03 lahuse lisamisega, kuni märg punane lakmuspaber muutub siniseks. Söötme pH kontrollimiseks on mugav kasutada indikaatorit. bromtymolblau: 1-2 tilka sellest segatakse portselantopsis tilga puljongiga. Bromothymolblau on neutraalses keskkonnas pudeliroheline, happelises keskkonnas kollane ja aluselises keskkonnas sinine.

Pärast pH määramist keedetakse söödet uuesti 5-10 minutit ja söötme reaktsiooni muutumisel kalgenenud valgud filtreeritakse läbi paberfiltri, ilma puljongit selgitamata või valguga selgitamata. Selleks vahustatakse värske munavalge kahekordse koguse veega ja segatakse 50 °C-ni jahutatud puljongiga. Segu keedetakse segades madalal kuumusel 10 minutit, seejärel filtreeritakse. Läbipaistev liha-peptoonpuljong valatakse katseklaasidesse, suletakse vatikorkidega ja steriliseeritakse 120 °C juures 20 minutit.

Liha peptoonagar (MPA). 1 liitrile MPB-le lisada 15-20 g agarit. Söödet kuumutatakse kuni agar lahustumiseni (sulamistemperatuur on 100°С, tahkumistemperatuur 40°С), sööde viiakse 20% Na2C03 lahusega kergelt leeliselisele reaktsioonile ja valatakse läbi lehtri katseklaasidesse ( umbes 10 ml agarit kolonnis, et seejärel valada Petri tassidesse ja iga 5 ml, et saada kaldus agar-parve).

Agarit maha puistades peavad katseklaaside servad kuivaks jääma, muidu jäävad korgid klaasi külge kinni. Söötmega torusid steriliseeritakse autoklaavis 120 °C juures 20 minutit.

4.2. Steriliseerimismeetodid

Steriliseerimine - see on mikroorganismide rakkude täielik hävitamine toitainetes, roogades jne.

On teada mitmeid steriliseerimismeetodeid. Sagedamini kasutatakse kuumsteriliseerimist.

4.2.1. Leegitamine või röstimine

Süütada võib vahetult enne kasutamist plaatinasilmuseid, nõelu, spaatleid, väikseid metallesemeid (käärid, lansetid, pintsetid), aga ka klaasvardaid, slaide, katteklaase jne.

4.2.2. Kuivsteriliseerimine kuumusel

Seda kasutatakse nõude ja kuivade materjalide, nagu tärklis, kriit, töötlemiseks. Samal ajal hoitakse steriliseeritavat eset 170 °C juures 2 tundi (alates vajaliku temperatuuri kehtestamisest) elektrikuivatuskappides. Temperatuuri tõstmine üle 170 ° C ei ole soovitatav: vatikorgid ja paber hakkavad kokku kukkuma.

Enne steriliseerimist suletakse klaasnõud vatikorkidega ja pakitakse paberisse. Tassid, katseklaasid, pipetid, vatt, marli mähitakse paberisse või asetatakse spetsiaalsetesse ümbristesse ja karpidesse, milles saab pärast steriliseerimist säilitada steriilseid nõusid.

Steriliseerimise lõpus avatakse kapp alles pärast temperatuuri langemist toatemperatuurini, vastasel juhul võib klaas lõhkeda.

4.2.3. Auruga steriliseerimine

Vedeliku auru (100 ° C) kasutatakse kuiva kuumuse tõttu riknevate esemete ja teatud toitainete töötlemiseks, mis ei talu kõrgemaid temperatuure (süsivesikud, NRM, piim). Steriliseerimine toimub Kochi katlas 30 minutit 3 päeva päevas. Seda steriliseerimist nimetatakse murdosaline.

Ühekordsel kuumutamisel temperatuuril 100 ° C 30 minuti jooksul surevad vegetatiivsed rakud, samas kui paljude mikroorganismide eosed jäävad elujõuliseks. Pärast sellist kuumutamist asetatakse keskkond 24 tunniks termostaadi temperatuurile 28–30 °C. Esimesel kuumutamisel säilinud eostel on selle aja jooksul aega idaneda vegetatiivseteks vormideks, mis järgneval kuumutamisel hukkuvad. Seejärel korratakse seda toimingut veel 2 korda.

4.2.4. Steriliseerimine küllastunud auruga rõhu all

See on kiireim ja usaldusväärseim steriliseerimismeetod, mis tapab kõige vastupidavamad eosed. Tema abiga steriliseeritakse enamik söötmeid ja nõusid.

Töötlemine küllastunud auruga toimub hermeetiliselt suletud paksuseinalises katlas - autoklaav. Autoklaavi kaanel või küljel on auru väljalaskeventiil, manomeeter ja kaitseklapp. Manomeeter näitab, kui palju on aururõhk katla sees tavapärasest kõrgem. Plahvatuse vältimiseks aktiveeritakse rõhupiiri ületamisel kaitseklapp, mis annab aurule väljavoolu.

Manomeetri näidik füüsikalistes atmosfäärides vastab teatud temperatuurile.

Usaldusväärne steriliseerimine saavutatakse kuumutamisel temperatuuril 120 °C ja rõhul 1 atm 20 minutit.

Steriliseerimine toimub järgmiselt. Autoklaavi valatakse vesi, sinna asetatakse steriliseeritavad esemed, keeratakse autoklaavi kaas peale ja käivitatakse kuumutamine. Segisti jäetakse lahti, kuni kogu õhk autoklaavis on veeauru poolt välja tõrjutud. Kui aur hakkab kraanist pideva joana välja tulema, kraan suletakse, aururõhk autoklaavis viiakse 1 atm-ni ja hoitakse sellel tasemel 20-30 minutit. Seejärel kuumutamine peatatakse, oodatakse, kuni manomeetri nõel langeb 0-ni, avage ettevaatlikult (aeglaselt) kraan ja vabastage aur. Alles seejärel keerake autoklaavi kaas lahti. Kui kraan avatakse enne rõhu langemist, läheb steriliseeritud anumates olev vedelik keema ja surub korgid neist välja.

Autoklaavi kasutatakse ka fraktsioneerivaks steriliseerimiseks voolava auruga. Sel juhul ei keerata kaant alla, et aur saaks vabalt välja pääseda.

4.2.5. Pastöriseerimine

Pastöriseerimine on mittetäielik või osaline steriliseerimine, mis tähendab kuumutamist 65-80°C juures vastavalt 30-10 minutit, millele järgneb kiire jahutamine temperatuurini 10-11°C. Pastöriseerige piim, õlu, vein ja muud tooted.

Materjalid ja seadmed

BCH, agar, lakmuspunane, bromthymolblau, portselantaldrikud süvendite või tassidega, klaaspulgad, 20% Na2C03 lahus, riiulitel olevad katseklaasid (agari valamiseks), lehtrid, vatt, Petri tassid, 1 ml Mohri pipetid, topsipaber ja pipetimähised, 250 ml kolvid, karmid niidid.

5. Mikroorganismide puhaskultuuri arvu ja isolatsiooni arvestamine

5.1. Mikroorganismide arvu loendamise meetodid

5.1.1. Mikroorganismide arvu (CFU) arvestamine pinnases toitainete plaatide meetodil kombineerituna järjestikuste lahjenduste meetodiga

Muld on mikroorganismide arenguks kõige soodsam keskkond. Selle koostise suure heterogeensuse tõttu võetakse selles uuritavast piirkonnast pärit mikroorganismide arvu arvessevõtmiseks keskel mullakatse.

Esiteks valmistatakse suspensioonid (lahjendusmeetodil), mis sisaldavad erinevas kontsentratsioonis mulda 1 ml vees. Selleks võetakse steriilsel kellaklaasil purgist või kotist 1 g mullaproov steriilse portselanist spaatli või alumiiniumist teelusikaga. Mulla kaalumisel kaetakse kellaklaas teise steriilse kellaklaasiga.

Pinnaseproov viiakse aseptilisi tingimusi järgides 250 ml kolbi koos 99 ml steriilse veega. Segu loksutatakse 5 minutit ilma korki niisutamata. 1 ml suspensiooni, mis sisaldab 10-2 g mulda, võetakse steriilse pipetiga ja kantakse 9 ml steriilse kraaniveega katseklaasi. Pipetti pestakse katseklaasis korduvalt veega, et võimalikult palju rakke selle seintelt ära pesta. Teise steriilse pipetiga võetakse kolvist veel 1 ml suspensiooni ja asetatakse teise kolbi, mis sisaldab samuti 99 ml steriilset kraanivett. Seda pipetti pestakse samamoodi nagu esimesel juhul. Loksutage katseklaasi ja teist kolbi 1 minut. Mulla kontsentratsioon katseklaasis on 10-3 g, teises kolvis - 10-4 g. Samamoodi uute steriilsete pipettide abil viige 1 ml suspensiooni teisest kolvist teise katseklaasi. 9 ml ja kolmandasse kolbi 99 ml steriilse kraaniveega ning valmistada uued suspensioonid, mis sisaldavad vastavalt 1 ml 10-5 ja 10-6 g mulda.

ärakiri

1 Haridus- ja Teadusministeerium Venemaa Föderatsioon Föderaalne Haridusagentuur Moskva Riiklik Inseneriökoloogia Ülikool Kustova N.A. MIKROBIOLOOGIA LABORI TÖÖTUBA Moskva 2005. aastal

2 Mikrobioloogia laboritöötuba on mõeldud erialade 3207 ja 3302 üliõpilastele erialal "Mikrobioloogia ja biotehnoloogia alused", samuti "Keskkonna- ja tööstusliku biotehnoloogia" osakonna üliõpilastele erialal "Keskkonna- ja tööstusmikrobioloogia". Töötuba koosneb kolmest osast. Esimene osa on pühendatud üldmikrobioloogia küsimustele. Selle jaotise töödes uuritakse erinevate mikroorganismide rühmade morfoloogilist ehitust, mikroskoopilise uurimise meetodeid, mikrobioloogilise külvamise tehnikat, steriliseerimismeetodeid ja meetodeid mikroorganismide kvantitatiivseks arvestuseks. Teine osa sisaldab töid mikroobide kasutamisest biotehnoloogias erinevate orgaaniliste hapete, alkoholide, antibiootikumide ja ensüümide ainete saamiseks. Kolmanda sektsiooni töödes uuritakse ökoloogilise mikrobioloogia küsimusi. Mõned tööd näitavad mikroorganismide rolli globaalsetes biogeokeemilistes tsüklites ja ülejäänud on pühendatud biotehnoloogilise kaitse probleemidele. keskkond. Iga teema sisaldab teoreetilist sissejuhatust ja praktilist osa, kus kirjeldatakse kasutatavaid meetodeid, tööde järjekorda, töö aruande sisu, aga ka kontrollküsimusi. 2

3 EESSÕNA Mikrobioloogia laboritöötuba on mõeldud erialade 3207 ja 3302 3. kursuse üliõpilastele erialal "Mikrobioloogia ja biotehnoloogia alused", samuti "Ökoloogilise ja tööstusliku biotehnoloogia" osakonna 4. kursuse üliõpilastele erialal " Biotehnoloogiline keskkonnakaitse" erialal "Ökoloogiline ja tööstuslik mikrobioloogia. Laboritöötuba põhineb Laboratoorsete tööde juhendil, toim. P.I. Nikolaev, mida on osakonnas "Mikrobioloogilise tootmise protsessid ja seadmed" kasutatud alates osakonna loomisest. Vanemteadur, Ph.D. N.V. Pomortseva. Juhendid koostasid tema juhendamisel osakonna teadlased: M.A.Boruzdina, I.E.Lomova, N.A.Kustova, T.A.Mahhotkina ja K.A. Muuda õppekava vastavalt uuele keskkonnainseneri erialale oli vaja mikrobioloogia kursust laiendada ja täiendada keskkonnakaitse biotehnoloogiliste meetodite alaste ülesannetega. Laboritöökoda koosneb kolmest sektsioonist. Esimene osa on pühendatud üldisele mikrobioloogiale: mikroorganismide morfoloogia, selle uurimise meetodid, mikrobioloogilise inokulatsiooni tehnika, mikroorganismide kvantitatiivse arvestuse meetodid. Teises osas on toodud mõned näited mikroobide kasutamisest tööstuses. Kolmas osa käsitleb mikroorganismide ökoloogia küsimusi, nende rolli elementide globaalsetes tsüklites, aga ka keskkonnakaitse biotehnoloogilistes meetodites. Selle töötoa ettevalmistamisel osalesid osakonna aspirant N. V. Zyabreva ja vanemteadur. E. S. Gorshina. Autor avaldab sügavat tänu doc. kohvik mikrobioloogia, Moskva Riiklik Ülikool N.N. Kolotilovale väärtuslike kommentaaride ja nõuannete eest, samuti vanemteadurile. P. P. Makeev abi eest teksti ja illustreeriva materjali ettevalmistamisel. 3

4 4 MIKROBIOLOOGIALABORI ÜLDISED TÖÖREEGLID Labori töö- ja käitumisreeglid Mikrobioloogialabori töö- ja käitumisreeglitel on palju ühist keemialabori tööreeglitega, kuid neil on oma spetsiifika. Mikrobioloog töötab enamikul juhtudel mikroorganismide puhaskultuuridega, s.t. mis tahes perekonna, liigi ja tüvega kuuluvate mikroorganismidega. Kuna võõrmikroobe on kõikidel ümbritsevatel objektidel ja õhus, kasutatakse spetsiaalseid töövõtteid, et vältida uuritava mikroorganismikultuuri või inimese enda saastumist. Selleks steriliseeritakse söötmed, riistad, töövahendid, labor ja töökohad hoitakse puhtad, mikroobidega töötamisel järgitakse teatud reegleid. Laboris ei tohiks olla mittevajalikke esemeid. Regulaarselt tuleks läbi viia märgpuhastus. Laboriruumide erinevaid pindu desinfitseeritakse perioodiliselt. Desinfitseerimine on desinfitseerimine, st. nakkushaiguste patogeenide hävitamine keskkonnaobjektidel. Selleks kasutage 0,5 3% klooramiini lahust või 3 5% fenooli (karboolhape) lahust. Töölauda tuleks desinfitseerida 70% etüül- või isopropüülalkoholi lahusega. Õhu desinfitseerimine saavutatakse lihtsa ventilatsiooniga (vähemalt min). Rohkem tõhus meetodõhu desinfitseerimine ruumi kiiritamine ultraviolettkiirtega bakteritsiidsete lampide abil. Eriti sageli kasutatakse kasti steriliseerimiseks ultraviolettkiirgust. Boxing on spetsiaalne väike ruum puhaskultuuride ümberkülvimiseks, mikroorganismide kvantitatiivseks arvestuseks Petri tassidel ja mõneks muuks eriti puhtaid tingimusi nõudvaks tööks. Enne tööd kiiritatakse kasti min. Laud pühitakse alkoholiga, seinu ja põrandat pestakse perioodiliselt. Poksimise asemel saab laborid varustada laminaarkappidega (joon. 1), mis samuti steriliseeritakse bakteritsiidsete lampidega. Kell

5 tööd sisaldavad ventilaatorit bakteritsiidsete filtrite kaudu juhitava steriilse õhu laminaarse voolu tekitamiseks. Mikrobioloogialabori põhivarustusse kuuluvad: mikroskoobid, termostaadid mikroorganismide kasvatamiseks, steriliseerimisseadmed (autoklaav ja kuivatuskapp), tsentrifuugid, destilleerija, külmkapp mikroorganismide muuseumikultuuride hoidmiseks, kapid klaasnõude ja reaktiivide paigutamiseks, vajalikud seadmed (fotoelektrilised elektriseadmed). kolorimeetrid, pH-meetrid jne). Igale õpilasele määratakse töökoht, kuhu ta asetab: kaanega kaetud mikroskoop, bakterioloogiline silmus, slaidid ja katteklaasid, steriilsed pipetid, piiritusepõleti, filterpaberi ribad, klaasimarker, anum desinfitseeriva vedelikuga. Laual ei tohiks olla midagi, mis pole otseselt seotud tehtava tööga. Mikrobioloogia laboritundides tuleb järgida ohutusreegleid. 5

6 6 Lühike teave ohutuse kohta laboris Mikrobioloogilises praktikas kasutatakse laialdaselt keemilisi klaasnõusid. Sellega töötades peate olema ettevaatlik. Puhastage katkised nõud põhjalikult. Analüüsis kasutatakse sageli tugevaid leeliste ja hapete lahuseid. Nendega tuleb töötada väga ettevaatlikult, kuna need ained kahjustavad käte ja riiete nahka. Kui hapet kogemata maha satub, tuleb see katta suure koguse soodaga ja seejärel mitu korda veega loputada. Mahavalgunud leelis tuleb põhjalikult pühkida ja esemeid, millele see on langenud, tuleb töödelda nõrga äädikhappe lahusega. Kui happed või leelised satuvad inimese nahale, tuleb need koheselt rohke veega maha pesta. Mikrobioloogilises laboris tegelevad nad elusate mikroorganismidega. Põhitöö toimub steriilselt, s.o. töötada ühe mikroorganismide kultuuriga, mis ei tohiks olla nakatunud võõraste mikroobidega. Põllukultuuride nakatumise vältimiseks kasutatakse spetsiaalseid steriliseerimismeetodeid. Lisaks on oluline hoida laboris puhtust. Mikroorganismide kultuuridega nõusid ei tohi lahti jätta. Mikroorganismide biomass, kui seda pole analüüsiks vaja, visatakse ära alles pärast steriliseerimist autoklaavis. Gaasi- või alkoholipõleti leegi läheduses tekivad mikroorganismid, seega peaksite olema ettevaatlik põletuste eest ja ennekõike püüdke hoolikalt pikki juukseid. Põleti peaks põlema ainult vajaduse korral. Kui külvi ajal süttib kogemata vatikork, piirituslamp või paber, kustutatakse tuli rätikuga. Suuremate tulekahjude korral kasutatakse tulekustuteid. Kasutatud pipetid, slaidid, katteklaasid, spaatlid jne. asetatakse desinfitseeriva vedelikuga anumasse. Õpilased peavad pidevalt meeles pidama, et tegemist on mikroorganismidega, mis ei pruugi alati olla ohutud, eriti töös mikroobide isoleerimisel keskkonnaobjektidest. Seetõttu peaksid õpilased tunni lõpus töökoha korda tegema ning käsi seebi ja veega pesema.

7 Elektrivõrgu rikke korral lülitage elektriseadmed ja nende tsentraliseeritud toide välja. OSA 1. ÜLDMIKROBIOLOOGIA TEEMA 1. Mikroorganismide morfoloogia ja selle uurimise meetodid Mikrobioloogias uuritakse organisme, millel on mikroskoopilised mõõtmed, s.o. mõõdetuna mikromeetrites või mikromeetrite osades. Üks mikromeeter võrdub 10-6 meetriga ja selle lühend on mikron. Mikroorganisme iseloomustab intensiivne ainevahetus ja nad on võimelised läbi viima erinevaid keemilisi muundumisi. Erinevad mikroorganismid erinevad nii oma struktuuri kui ka biokeemiliste protsesside poolest, mida nad läbi viivad. Nende ühendamist üheks rühmaks ei põhjusta mitte ainult nende väiksus, vaid ka viljelus- ja uurimismeetodite ühtsus. Uurida mikroorganismide ehitust, välimust, kuju, suurust, s.o. mikroorganismide morfoloogia uurimiseks kasutage mikroskoopi. Väikseimate osakeste, mida tänapäeva valgusmikroskoopides näha saab, suurusjärk on üle 1/3 valguse lainepikkusest, s.o. mitte vähem kui 0,2 mikronit, mis on seotud valguse nähtava osa kasutamisega, mille lainepikkus on 0,4 mikronit kuni 0,7 mikronit. Mikroskoobi seade Joonisel fig. 2 näidatud välimus levinud uurimistöös ja hariduspraktika mikroskoop MBI-3. Vaadeldav objekt, preparaat, asetatakse objektilauale ja valgustatakse altpoolt valguskiirtega, mis väljuvad illuminaatorist, langevad peeglile, läbivad seejärel kondensaatori ja keskenduvad preparaadile. Mikroskoobi põhiosad: okulaarid, toru, torn koos objektiividega, lava koos klambritega ettevalmistusteks, kondensaator, makro- ja mikrokruvid teravustamiseks ning lõpuks statiiv, millesse see kõik on kinnitatud. 7

8 Enne mikroskoopiat kontrollige valgustuse õiget paigaldamist (vastavalt Köhlerile). Selleks, liigutades illuminaatori kassetti lambipirniga, saavutatakse niidist selge pilt 8

9 lambi hõõgumine täielikult suletud kondensaatori membraanil, nii et see pilt täidab kondensaatori ava täielikult. Pärast illuminaatori membraani sulgemist avaneb kondensaatori membraan ning kondensaatori liigutamisel saavutatakse mikroskoobi vaateväljas illuminaatori diafragma terav kujutis. To ere valgus ei pimestanud silmi, kõigepealt vähendage lambi hõõgniidi hõõguvust. Ja lõpuks, diafragma ava kujutis seatakse vaatevälja keskele ja illuminaatori ava avatakse nii, et kogu vaateväli on valgustatud. Mikroskoop on kahe suurendusastmega optiline süsteem: esimese suurenduse teostab objektiiv, teise okulaar. Objektiiv annab suurendatud pöördkujutise objektist, mida vaadatakse läbi okulaari. Selle tulemusena näeb vaatleja silm objektist kõrgelt suurendatud pöördkujutist. Seetõttu tajub silm objekti liikumist vasakule kui liikumist paremale. Mikroskoobi summaarne suurendus, s.o. Suurendus, millega objekti mikroskoobi all vaadatakse, on defineeritud kui objektiivi ja okulaari suurenduste korrutis. Objektiivid annavad suurenduse 10, 40, 60, 90 korda, okulaarid kordades. Kui kasutatakse binokli kinnitust, annab see täiendava suurenduse. Joonisel fig. 3 näitab elektriskeemi optiline süsteem mikroskoop. Objektiiv O moodustab Z tasapinnal objektist A reaalse ümberpööratud kujutise A. Objektiivi poolt antud kujutist suurendatakse veelgi okulaari E abil. Kuna Z on okulaari E fookuses, näeb vaatleja suurendatud virtuaalset pilti. A X tasapinnas, mis asub tavaliselt silmast 25 cm kaugusel , s.o. lähedale nägemiseks sobival kaugusel. Tuleb meeles pidada, et selline idee kujutise moodustamise mehhanismist on väga lihtsustatud, kuna see eirab difraktsiooni ja mitmete muude tegurite mõju. Mikroskoobiga töötades uurivad õpilased mikroobide preparaate mitmekordse suurendusega. Optilise mikroskoobi suurim suurendus on 3000x. Väikseim osakese suurus, mida sellises mikroskoobis saab vaadata, on 9

10 võrdub 0,2 mikroniga, mis on tingitud spektri nähtava osa lainepikkusest. Mikroorganismide morfoloogia Mikroorganismide maailm sisaldab tohutult erinevaid vorme, mis ei moodusta ühtset süstemaatilist rühma. Mikrobioloogia põhiobjektid on bakterid, kuid lisaks neile uurivad mikrobioloogid ka pärmi, seeni, mikroskoopilisi vetikaid ja mõningaid algloomi. Joonisel fig. 4 on näidatud peamised mikroorganismide rühmad (välja arvatud algloomad); säilivad nende suuruste suhted. Kõik elusorganismid, välja arvatud viirused, on rakuline struktuur. Rakulise struktuuri järgi jagunevad nad prokarüootideks ja eukarüootideks. 10

11 Peamine erinevus eukarüootide ja prokarüootide vahel on sekundaarsete õõnsuste olemasolu, mis eraldavad tuuma ja muud rakustruktuurid tsütoplasmast. Just sekundaarsete õõnsuste tekkimine võimaldas eukarüootsete membraanide sisepinna suurenemise tõttu teha hüppe kogu elusmaailma evolutsioonis. See võimaldas vastavalt difusioonikiiruse suurenemisele üheaegselt läbi viia suuremat arvu membraanidel toimuvaid biokeemilisi reaktsioone. Prokarüootid on bakterid, sealhulgas aktinomütseedid ja tsüanobakterid. Eukarüootid on kõik taimed, loomad, pärmid, seened, algloomad. Prokarüootidest eristatakse praegu arhebakterite rühma, kuhu kuuluvad metanogeenid, äärmuslikud halofiilid (elavad väga soolases vees), ülimalt termofiilsed bakterid, mis oksüdeerivad ja vähendavad molekulaarset väävlit, aga ka rakuseinata termoplasmad. Võrdluse põhjal tehti uus jaotus nukleotiidjärjestused ribosomaalse RNA väikestes segmentides. üksteist

12 Arhebakterid erinevad rakuseinte koostise, lipiidide ja mõnede muude füsioloogiliste ja biokeemiliste tunnuste poolest (näiteks on neil erinev CO 2 fikseerimise mehhanism). Seega eristatakse rakulise organisatsiooni struktuuris praegu 3 rühma: arhebakterid (uue nomenklatuuri järgi Archaea, arhaea), eubakterid (uue nomenklatuuri järgi Bakterid, bakterid) ja eukarüootid (uue nomenklatuuri järgi Eukarya) . Töö 1. Bakterite mikroskoopiline uurimine Bakterite morfoloogia Teoreetiline sissejuhatus See mikroorganismide rühm on kõige arvukam, looduses laialt levinud ja suure tööstusliku tähtsusega. Mikroorganismide nimetamiseks kasutatakse binaarset nomenklatuuri, nagu zooloogias ja botaanikas. Selle nomenklatuuri kohaselt on igal liigil nimi, mis koosneb kahest nimest Ladinakeelsed sõnad. Esimene sõna tähendab perekonda ja teine ​​tüüp. Üldnimetus on alati suurtähtedega ja konkreetne nimi on alati väiketähtedega. Enamik baktereid on üherakulised organismid, mis on sfäärilised, vardakujulised või keerdunud. Bakterite hulgas on väike arv filamentseid vorme. Bakterid on väga väikesed, kerakujuliste bakterite raku läbimõõt on 1 2 mikronit. Bakterid paljunevad jagunemise teel (soodsates tingimustes toimub jagunemine minutitega). Mõned bakterid on liikuvad. Liikumisvõime on seotud spetsiaalsete flagellum organellide olemasoluga. Kõige lihtsama kujuga on sfäärilised bakterid (kokid). Need esinevad kas üksikute kuulide või omavahel ühendatud pallidena. Rakkude jagunemisjärgse paigutuse järgi jagunevad sfäärilised bakterid monokokkideks (üksikud kokid), tetrakokkideks (ühendatud 4-ga), sarkiinideks (8-ga), stafülokokideks (klastriteks), streptokokideks (kokkide ahelad). 12

13 Vardakujulised bakterid on kõige arvukam bakterirühm. Need on ümarate või teravate otstega silindrilised rakud, mille pikkuse ja laiuse suhe on väga erinev. Need võivad paikneda üksikult või moodustada lühikesi või pikki ahelaid. Vardad võivad olla erineva pikkusega, tavaliselt mõne mikroni pikkused ja umbes 1 mikroni laiused. Mõned pulgakujulised bakterid moodustavad raku sees spetsiaalsed spoorikehad. Iga rakk toodab ühte eost, mis talub ebasoodsaid tingimusi. Eos idaneb sobivatel tingimustel (temperatuur, niiskus, toitained), muutudes pulgaks. Bakterite eoste resistentsus ületab kõigi elusorganismide resistentsuse. Näiteks Bacillus subtilis heinabatsilli eos talub 3 tundi temperatuuri 100 ° C. Selline eoste resistentsus raskendab infektsioonidega võitlemist. Keritud mikroorganismid erinevad rakkude kõverusastme ja mähiste arvu poolest. Need jagunevad vibriodeks, spirilladeks ja spiroheediteks. Kui bakteril on üks mittetäielik spiraali mähis, siis nimetatakse seda vibrioks. Kui bakteril on mitu spiraalset lokke, nimetatakse seda spirillaks ja mikroobe, millel on keerdunud kuju ja palju väikeseid lokke, nimetatakse spiroheedideks. Filamentsed bakterid on niidid, mis koosnevad silindrilistest või kettakujulistest rakkudest. Mõnede liikide niidid on suletud limaskestaga, mida saab immutada raudhüdroksiidi või mangaani sooladega. Raskmetallide akumuleerumisprotsess lahustest toimub mõne rauabakteri rakkudes. Suured filamentsed bakterid r. Beggiatoa ladestub oma rakkudesse väävlit. Filamentsed bakterid elavad tavaliselt mere- ja magedad veed, leidub ka lagunevates orgaanilistes jäänustes, loomade soolestikus. Tsüanobakterid hõlmavad suurt hulka organisme, mis ühendavad raku prokarüootse struktuuri võimega läbi viia fotosünteesi. Tsüanobakterirakkude pigmendid sisaldavad lisaks klorofüll a-le (roheline) fükotsüaniini pigmenti 13

14 sinine. Sel põhjusel nimetati neid varem sinivetikateks. Enamik neist on mitmerakulised organismid, mis on pikad, enamasti hargnemata niidid (trihhoomid). Filamentides olevaid rakke ühendab ühine välissein. Mõnikord moodustavad nad limaskestade kogunemist "matid". Paljundamine toimub niidi jagamisega eraldi osadeks. Mõned liigid liiguvad libisedes (r. Spirulina). Aktinomütseedid (hargnevad bakterid, kiirgavad seened) on suur rühm prokarüootseid mikroorganisme, mis moodustavad õhukesi hargnevaid filamente, mille pikkus on mitu mm ja läbimõõt on 0,5-1,5 mikronit. Need on omapärane mikroorganismide rühm, mis on morfoloogiliselt sarnane hallitusseentega (joon. 5). Märkimisväärse osa selle rühma esindajate rakud on võimelised hargnema, mis on tunnusmärk seened. Aktinomütseedi hargnevate filamentide pikkus ulatub aga mitme millimeetrini, seeneniidistiku pikkus aga mitu sentimeetrit. Seente hüüfid on tavaliselt mitu korda paksemad kui aktinomütseedi niidid. Morfoloogia ja arengu järgi jagunevad aktinomütseedid kõrgemateks ja madalamateks vormideks. Kõrgemate organismide hulka kuuluvad organismid, millel on hea 14

15 arenenud vaheseintega või vaheseinteta mütseel ja spetsiaalsed eoselundid. Eosed moodustuvad ahelate kujul õhumütseeli spetsiaalsetel spoore kandvatel hüüfidel. Sporulatsiooniorganite ehitus on eri liikidel erinev: pikad või lühikesed, sirged või spiraalsed (joon. 6). Mütseeli olemasolu ja sporulatsiooniorganite struktuuri järgi meenutavad kõrgemad aktinomütseedid mütseeli seeni. Mõnel aktinomütseedil on seeneniidistik ainult noores kultuuris, mis vananedes laguneb pulgakujuliste ja kokkide rakkude moodustumisega. Aktinomütseedi madalamatel vormidel puudub tõeline seeneniidistik. Mütseeli moodustumise võime väljendub neis ainult rakkude kalduvuses hargneda. Alumised aktinomütseedid hõlmavad näiteks perekonna Mycobacterium liike, millel on võime kultuuri vanusega rakkude kuju muuta (joonis 7). Seda omadust nimetatakse pleomorfismiks. Kõrgematest aktinomütseedidest on looduskeskkonnas esineva arvukuse osas juhtival kohal perekonna Streptomyces liigid. Aktinomütseedid mängivad olulist rolli 15

16 mulla teke ja mullaviljakuse loomine. Aktinomütseedid hävitavad keerulisi orgaanilisi ühendeid (tselluloos, huumus, kitiin, ligniin jne), mis on paljudele teistele mikroorganismidele kättesaamatud. Peaaegu kõik perekonna Streptomyces liigid moodustavad spetsiifilisi antibiootiliste omadustega jäätmeid. Mõned liigid on taimede, loomade ja inimeste patogeenid. Lisaks peamistele bakterivormidele leidub vars- ja tärkavabaktereid, mis kannavad välja kasvu, mida nimetatakse prostekiks. (joon.8) 16

17 Prosteki funktsioonid on erinevad. Mõnes bakteris on need ülesandeks paljuneda, teistes aga raku substraadi külge kinnitamiseks. 17

18 18 Praktiline osa Töö eesmärk on uurida bakterite esindajate morfoloogiat Töö järjekord Esimese töö sooritamisel õpitakse kasutama mikroskoobi, vaadeldakse bakterite esindajate valmispreparaate, seejärel iseseisvalt. valmistada elusbakterite preparaate ja neid mikroskoopida. Esiteks uurivad õpilased mikroskoopiliselt valmis bakterite fikseeritud preparaate. Fikseeritud preparaadid on mikroorganismid, mis on suspendeeritud veekeskkond kuivatati klaasklaasil ja värviti aniliinvärvidega. Mõnede elusate mikroorganismide preparaadid valmistavad õpilased ise. Selleks kantakse puhtale klaasklaasile väike tilk kraanivett, millesse viiakse kaltsineeritud ja jahutatud bakterioloogilise silmusega väike kogus uuritavaid mikroobe, segatakse põhjalikult ja kaetakse katteklaasiga. Liigne vesi eemaldatakse filterpaberiga. Ravim asetatakse teemalauale ja kinnitatakse klambritega. Esiteks okulaari vaadates ja makrokruvi keerates saavutatakse 10x objektiiviga väikese suurendusega objektist terav pilt. Seejärel kantakse mikroskoop 40-kordse objektiiviga suurele suurendusele. Kruvide pööramine peab toimuma ettevaatlikult, kuna liiga järsult langetades võib objektiiv muljuda. Mikroskoopimisel tuleb meeles pidada, et mikroskoop, eriti suure suurenduse korral, ei jäädvusta kogu objekti sügavust, seetõttu on toru mikrokruviga järk-järgult allalaskmisel objekt esmalt nähtav ülalt ja seejärel. optilises osas. 1. Mikroorganismide fikseeritud preparaatide vaatamine. Lactococcus lactis on piimhappekäärimise põhjustaja; rakkude kuju on sfäärilised kookid; rakud on ühendatud ahelates. Seda kasutatakse piimhappetoodete saamiseks.

19 Lactobacillus acidophilum pulgakujulised bakterid; piimhappekäärimise põhjustaja. Seda kasutatakse piimhappetoodete saamiseks. Acetobacter aceti on vardakujulised bakterid, mis oksüdeerivad etanooli äädikhappeks. Kasutatakse toiduäädika saamiseks. Streptomyces griseus actinomycete, rakukuju õhukeste hargnenud filamentide kujul; antibiootikumi streptomütsiini tootja. Saccacharopolyspora erythrae aktinomütseet, rakukuju õhukeste hargnenud niitide kujul; antibiootikumi erütromütsiini tootja. 2. Bacillus subtillis rakkude eluspreparaatide vaatamine õhukeste liigutatavate varraste kujul; moodustab vaidlusi; ensüümpreparaatide tootja. Spirulina platensis tsüanobakterid; lahtrite kuju ühe keerme kujul, mis koosnevad üksteisega tihedalt külgnevatest silindrilistest rakkudest; on libiseva liikumisega. Kasutatakse toidulisandina. Aruande sisu 1. Mikroorganismi ladinakeelne nimetus. 2. Raku morfoloogia (andke joonis, mis näitab mikroskoobi suurendust ja hoiab rakkude suuruste suhet). 3. Uuritud bakterite kasutamine tööstuses. Testi küsimused 1. Kirjeldage mikroskoobi ehitust. 2. Kuidas määrata mikroskoobi suurendust? 3. Milline on bakterirakkude kuju. 4. Nimeta aktinomütseedi morfoloogia tunnused. 5. Milliseid bakterite esindajaid teate ja milline on nende praktiline tähendus? Töö 2. Eukarüootsete mikroorganismide morfoloogia Teoreetiline sissejuhatus 19

Mikrobioloogide poolt uuritud 20 eukarüootsete mikroorganismide hulka kuuluvad seened, pärmid, mikrovetikad ja mõned algloomad. Seente morfoloogia Seened on niitjate rakkudega klorofüllivabad mikroorganismid. Nende moodustatud pikki hargnenud filamente nimetatakse hüüfideks. Hüüfid moodustavad koos seeneniidistiku. Suuruse poolest on seenhüüfid palju suuremad kui aktinomütseedid. Paljude hallitusseente seeneniidistik on jagatud vaheseintega (vaheseintega), samas kui muud tüüpi vaheseinad puuduvad. Biotehnoloogias kasutatakse hallitusseened peamiselt tootjatena. "Hallitusseente" nime all on ühendatud mõned fükomütseedi, marsupiaalide ja ebatäiuslike seente esindajad. Tihedatel aluspindadel moodustavad hallitusseened ümarad kohevad, ämblikuvõrgutaolised, puuvillataolised või pulbrilised rohelised, kollakad, mustad või valged kolooniad. Hallitusseente kolooniad koosnevad suurest hulgast hüüfidest. Suurem osa hüüfidest areneb õhus ja osa substraadi paksuses. Hüüfidel moodustuvad sageli konidiofoorid, millele moodustuvad eosed kas sporangiumi sees või ahelatena paiknevate eksospooride kujul. Konidiospoorid ehk koniidid on mõeldud mittesuguliseks paljunemiseks (joonis 10). Soodsatesse tingimustesse sattudes idanevad koniidid seeneniidistikuks. Hallitusseened on looduses väga levinud ja neil on võimas ensümaatiline aparaat. Seetõttu on nad peamised hävitajad orgaanilised ühendid looduses. Hallitusvorme kasutatakse laialdaselt ka tööstuses orgaaniliste hapete, antibiootikumide ja ensüümide tootmiseks. 20

21 Pärmseene morfoloogia Pärmseened on omaette rühm suure praktilise tähtsusega üherakulisi mikroskoopilisi seeni. Pärmirakud on suured ümmargused või ovaalsed rakud (joonis 11). Mõned pärmseened võivad moodustada algelise mütseeli, mida nimetatakse pseudomütseeliks. Rakkude suurus on vahemikus 3 µm kuni 10 µm ja laius 2 kuni 8 µm. Enamik pärmi paljuneb pungudes. Samal ajal, 21

Raku pinnale ilmub väike neeru punn (mõnikord mitte üks, vaid mitu), mis suureneb järk-järgult ja eraldub lõpuks seda tootvast rakust. Emarakust eraldatud pungast saab uus pärmirakk. Mõned pärmseened paljunevad lõhustumise teel. Eluspärmi peeneteralises sisus (protoplasmas) on suured vakuoolid selgelt näha. Vakuoolid on protoplasma sees olevad õõnsused, mis on täidetud rakumahlaga. See koosneb vees lahustunud elektrolüütidest, valkudest, süsivesikutest ja ensüümidest. Noortel pärmirakkudel on protoplasma homogeenne ja hilisemates arenguetappides tekivad protoplasmas vakuoolid, mis on täidetud ainevahetusproduktidega rakumahlaga. Kui toitainekeskkond on ammendunud, tekib paljudel pärmseentel eoste teke. Mõnel pärmitüübil on eosed ümarad ja kaetud sileda kestaga. Soodsates tingimustes idanevad eosed. Pärmid on looduses laialt levinud. Neid leidub viinamarjadel, teistel marjadel ja puuviljadel, piimas, vees ja mullas ning inimese nahal. Paljud pärmid viivad läbi alkohoolset kääritamist ja neid kasutatakse alkoholi tootmiseks küpsetamisel, veinivalmistamisel ja õllepruulimisel. 22 Algloomade morfoloogia Algloomad on loomariigi üherakulised organismid. Mikroorganismide hulgas on need kõige keerukamad, neil on primitiivsed elundid, mis on iseloomulikud mitmerakulistele loomadele. Mõnel neist on suu ja päraku, kokkutõmbumis- ja seedevakuoolid. Algloomad paljunevad aseksuaalselt (rakkude jagunemise teel) ja sugulisel teel. Algloomade klassifikatsioon põhineb liikumismeetoditel. 1. Sarkood. Nad liigutavad ja püüavad toitu pseudopoodia ehk valejalgade abil. Tüüpiline esindaja on Amoeba. Amööbide suurused ei ületa mikroneid.

23 2. Flagella. Neil on tihe plasmamembraan ja nad liiguvad lippude abil. Lipuliste mullavormid on väga väikesed (2-5 µm), veevormid aga suured (kuni 20 µm). Tüüpiline esindaja on Euglena. 3. Ripsmed. Kõige paremini organiseeritud algloomad. Rakkude suurus on vahemikus 20 kuni 80 µm. Tüüpiline esindaja on parametsiumi kingaprill, mida kasvatatakse kalamaimude toiduna. 4. Eosloomad. fikseeritud vormid. Paljud patogeenid, näiteks malaaria põhjustaja Plasmodium. Lihtsamad on looduses laialt levinud. Neid leidub veekogudes, mudas ja pinnases. Algloomade väärtus looduses on väga mitmekesine. Nad elavad erinevate loomade seedetraktis, osaledes seedimises taimne toit, osalevad orgaaniliste jääkide mineraliseerumisel pinnases ning on ka oluline osa reoveepuhastite biotsenoosist. Toitudes bakteritest ja hõljuvatest ainetest, aitavad need kaasa vee selginemisele. Lihtsaim täidab indikaatorite funktsiooni: reoveepuhastuse kvaliteedi hindamiseks saab kasutada teatud vormide väljatöötamist. Seega viitab amööbide ülekaal ja ripslaste puudumine aktiivmuda koostises puhastusseadmete halvale töötulemusele. Ripslooma Tetrahymena kasutatakse laialdaselt esmase toksilisuse hindamiseks. Erinevat tüüpi algloomad on näidatud joonisel fig. 12. Vetikate morfoloogia Vetikad on ulatuslik taimeorganismide rühm. Kõigile neile omase klorofülli olemasolu ja sellest tulenev fotoautotroofne toitumine, võime sünteesida orgaanilisi aineid kasutades päikesevalguse ja süsihappegaasi energiat. Paljudes vetikates varjavad klorofülli rohelist värvi teised pigmendid. Nende hulgas on mikroorganismideks klassifitseeritud väga väikeseid ühe- ja mitmerakulisi vorme, samuti 23

24 mitmerakulist organismi, mis elavad meredes ja ookeanides ja ulatuvad mõnikord hiiglaslikesse suurustesse .. Mikrobioloogia uurimisobjektid on mõned mikroskoopilise suurusega vetikad. Nad on mitmesuguse kujuga ja elavad nii maismaal kui ka veekeskkonnas (joonis 13). 24

25 Praktiline osa Töö eesmärk on uurida erinevate eukarüootide rühmade esindajate morfoloogiat. Töö sooritamise järjekord Õpilased valmistavad iseseisvalt seente, pärmi, vetikate ja algloomade esindajate eluspreparaate; neid mikroskoobitakse x40 objektiiviga ja visandatakse mikroskoobi suurenduse näit. Hallitusseened Aspergillus niger moodustavad vaheseintega mütseeli kujul rakke; osadel hüüfidel on eostega hargnemata konidiofoorid. Konidiofoorid on üherakulised, sfääriliselt paistes, turse pinnal on lühikesed nõelakujulised rakud (sterigmad), millest igaüks katkeb musta värvi koniidide ahelast. Seda kasutatakse orgaaniliste hapete ja ensüümide saamiseks. Penicillium chrysogenum hyphae on vaheseintega; osadel hüüfidel on eostega hargnenud konidiofoorid. Koniidid moodustuvad keerdunud hargnenud konidiofooride otstes. Seda kasutatakse antibiootikumi penitsilliini tootmiseks. 25

26 Pärm Saccharomyces cerevisiae üksildane ovaalsete ja ümarate rakkudega pärm; paljunevad pungumise teel. Neid kasutatakse pruulimisel, küpsetamisel, alkoholi tootmisel. Looduses leidub neid marjade ja muude puuviljade pinnal. Saccharomyces vini rakukuju on ovaalne ja ümmargune; paljuneda pungumise teel; pärast tärkamist ei eraldu nad mõnda aega, moodustades väikesed "oksad". Kasutatakse veinivalmistamisel. Rhodotorula glutinis rakukuju on elliptiline; üksikud rakud; paljunevad pungudes. Need on värvunud oranžiks tänu karotenoidide sisaldusele rakkudes. Võib kasvada keskkondades, kus süsinikuallikaks on õli süsivesinikud. Kasutatakse söödapärmina. Candida tropicalis pärmseen, millel on ovaalsed ja väga piklikud rakud, mis moodustavad "pseudomütseeli". Võib kasvada mineraalsetes keskkondades, kus süsinikuallikaks on süsivesinikud. Kasutatakse söödapärmina. Tööstuslikus mastaabis kasvatatakse neid alkoholi ja paberi tootmise jääkainetel. Vetikas Chlorella vulgaris on mikroskoopiline ümarate rakkudega rohevetikas (läbimõõt 5-10 mikronit); paljunevad autospooride abil, mis moodustuvad emaraku sees koguses 4–32 ja vabanevad pärast selle membraani purunemist. Neid saab kasutada massviljelusel söödavalgu saamiseks, samuti õhu regenereerimiseks suletud süsteemides (allveelaevad, kosmosejaamad jne.). Scenedesmus sp. kuulub rohevetikate rühma; on ovaalse raku kujuga; välisrakkudel on sageli teravad otsad; rakud on omavahel ühendatud neljakaupa. Seda kasutatakse toiduvalgu saamiseks. 26

27 Algloomad Preparaat valmistatakse aeratsioonipaagi aktiivmudast. Uurida avastatud algloomade esindajate morfoloogiat ja joonistada neid. Aruande sisu 4. Mikroorganismi ladinakeelne nimetus. 5. Raku morfoloogia (andke joonis, mis näitab mikroskoobi suurendust ja hoiab rakkude suuruste suhet). 6. Uuritud mikroorganismide kasutamine tööstuses. Kontrollküsimused 1. Kirjeldage seente esindajate rakkude kuju ja nende praktilist kasutamist. 2. Kirjeldage pärmirakkude kuju; nimetada esindajaid ja rääkida nende praktilisest kasutamisest. 3. Rääkige mikrovetikate morfoloogiast ja nende praktilisest kasutamisest. 4. Nimeta algloomade esindajad ja räägi nende kasutamisest biotehnoloogias. Töö 3. Mikroorganismide morfoloogia uurimise meetodid Kõige levinum meetod bakterite morfoloogia uurimiseks on mikroorganismide puhaskultuuridest või uuritavast proovist valmistatud fikseeritud preparaatide mikroskoopia. Elusas olekus mikroorganismide uurimist kasutatakse suuremate vormide uurimisel ja rakkude liikuvuse jälgimisel. Mikroorganismide fikseeritud preparaatide valmistamine Mikroorganismide fikseeritud preparaatide valmistamiseks valmistatakse esmalt äigepreparaadi, kuivatatakse, fikseeritakse ja seejärel värvitakse. Määrdused valmistatakse täiesti puhastele alusklaasidele. Klaasi saab rasvatustada etüülalkoholi, võrdses koguses alkoholi ja eetri seguga ja muuga.

28 vedelikku. Lihtsaim ja mugavaim viis klaasi rasvatustamiseks on pühkida seda mõlemalt poolt pesuseebitükiga. Seep eemaldatakse klaasilt kuiva vatitüki või salvrätikuga. Agarisöötmel kasvatatud bakterikolooniast määrdumise valmistamisel kantakse rasvatustatud klaasile esmalt tilk vett või soolalahust. Seejärel kaltsineeritakse bakterioloogiline silmus põleti leegis. Pärast seda, pärast katseklaasi siseseinal oleva silmuse jahutamist, haaratakse silmusega osa kolooniast ilma agarita. Kultuuriga silmus viiakse klaasil olevasse vee- või soolalahusesse ja tehakse 2 3 ringikujulist liigutust. Osa baktereid on vedelikus suspendeeritud. Kontuurile jäänud üleliigsed bakterid põletatakse põleti leegis, kuumutades aasa kuumaks. Seejärel kantakse tilk suspensiooni jahutatud silmusega üle klaasi. Määrimisala läbimõõt peaks olema 1,5-2 cm.Mägu peaks olema õhuke, materjali ühtlase jaotumisega. Kui vedelal toitesöötmel kasvatatud kultuurist valmistatakse äige, siis kogutakse samu steriilsusreegleid järgides silmuse või pipetiga tilk kultuuri ja kantakse rasvavaba klaasi keskele. Ülejäänud kultuuriga pipett kastetakse desinfitseerimislahusega anumasse. Tilk jaotub bakterioloogilise silmusega ühtlaselt üle klaasi. Aas põletatakse põleti leegis ja asetatakse statiivi või klaasi sisse. Säde kuivatatakse õhus või sooja õhuvoolus, hoides seda pikisuunalistest ribidest kõrgel põleti leegi kohal. Äärise piirid on vahapliiatsiga piiritletud tagakülg klaasist ja määrdumise küljele klaasi ühte otsa panna ravimi number. Nende märkide järgi saate hõlpsalt navigeerida klaasil oleva määrdumise asukohas. Kuivatatud määrimine on fikseeritud. Fikseerimisel on järgmised eesmärgid: 1) hävitada mikroobid, mis muudab ravimi edasiseks tööks ohutuks; 2) kinnitada mikroobid klaasile, et need värvimisel ja veega pestes maha ei uhtuks; 3) parandada värvide tundlikkust. 28

29 Lihtsaim, peaaegu kõikidele mikrobioloogilistele objektidele sobiv ja praktikas levinuim meetod on fikseerimine põleti leegis. Selleks lastakse klaasklaas 3-4 korda läbi põleti leegi kuumima ülemise osa, vältides preparaadi liigset ülekuumenemist, et mitte põhjustada valkude denaturatsiooni ning rikkuda bakterite struktuuri ja morfoloogiat. Eristage lihtsat ja keerukat diferentsiaalmeetodid värvimine. Lihtvärvimist kasutatakse uuritavas materjalis mikroobide tuvastamiseks, nende arvu, kuju ja asukoha määramiseks. Lihtne värvimine seisneb ühe aniliinvärvi kandmises preparaadile. Kõige sagedamini kasutatakse nendel eesmärkidel magenta punast värvi, aga ka metüleensinise (Leffleri sinise) sinise leeliselist lahust. Värvimistehnika: hästi fikseeritud preparaat asetatakse määrdiga ülespoole vanni kohal olevale klaassillale. Üks näidatud värvidest kantakse määrdumise pinnale pipeti või tilguti abil. Fuchsini hoitakse määrdil 1 3 minutit ja sinisel 3 5 minutit. Värv nõrutatakse määrdumisest, preparaat pestakse veega, kuivatatakse õhu käes või kuivatatakse õrnalt filterpaberiga. Kuivatatud äigepreparaadile kantakse tilk immersiooniõli, preparaat asetatakse mikroskoobi staadiumile ja mikroskoobitakse immersioonobjektiiviga (90) läbiva valguse käes. Bakterite värvimise diferentseeritud meetodid. Keerukad värvimismeetodid on suur tähtsus määratlemisel ja eristamisel erinevat tüüpi mikroobid. Need põhinevad mikroobiraku füüsikalis-keemilise struktuuri tunnustel ja neid kasutatakse raku struktuuri üksikasjalikuks uurimiseks ja tuvastamiseks. tunnusmärgid mõne värvaine jaoks. Nende meetoditega värvitakse määrdumine mitme värviga ja töödeldakse täiendavalt peitside või pleegitusainetega, alkoholi, happega jne. Nende meetodite hulgas on kõige olulisem bakterite eristamiseks mõeldud värvimismeetod Grami peits. See meetod paljastab 29

30 bakterite võime säilitada alkoholis värvainet või värvimuutust, mis on seotud rakuseina keemilise struktuuriga. Kõik bakterid jagunevad rakuseina struktuuri järgi kahte rühma: 1) Gram-värvivad Gram-positiivsed ja 2) Gramnegatiivsed mitte-Gram-värvivad. Seos Grami peitsiga on bakterite nii oluline erinevus, et seda mainitakse tingimata nende iseloomustuses ja see toimib taksonoomilise tunnusena. 30 grammi peitsitehnika Eelnevalt emajuurvioletiga immutatud filterpaberi riba asetatakse fikseeritud määrdumisele. Kandke ribale 3-5 tilka kraanivett. 1-2 minuti pärast eemaldatakse paber pintsettidega ja preparaadile valatakse Lugoli lahus. 30 sekundi ja 1 minuti pärast tühjendatakse Lugoli lahus. Kandke paar tilka 96 O alkoholi. Värvige 1 minut, kuni hallikasvioletsed ojad kaovad. Ravimit pestakse veega. Fuchsin valatakse määrimisele ja hoitakse 1-2 minutit. Värv nõrutatakse, preparaat pestakse veega, kuivatatakse filterpaberiga. Mikroskoopiliselt sukeldussüsteemiga. Grampositiivsed bakterid värvivad lillakassiniseks (näiteks võihappeline fermentatsioonibatsill Clostridium pasteurianum) ja gramnegatiivsed bakterid roosakaspunaseks (Escherichia coli). Lisaks sellele traditsioonilisele Grami peitsitehnikale on olemas kiire ja lihtne meetod Grami eristamiseks ilma värvimiseta. Bakterirakud (eelistatult 1-2-päevased) asetatakse 3% KOH tilgaga klaasklaasile, segatakse ringjate liigutustega ja 5-8 sekundi pärast tõstetakse silmus järsult üles. Gramnegatiivsete bakterite suspensioon muutub viskoosseks ja venib silmuse taha, moodustades limaskestade ribasid. Grampositiivsed bakterid jaotuvad leelistilgas ühtlaselt (nagu vees). Reaktsioon loetakse negatiivseks, kui 60 sekundi jooksul ei täheldata limaskestade moodustumist. Viskoossuse suurenemine on tingitud gramnegatiivsete bakterite rakuseinte lüüsist lahuses

31 leelise ja DNA vabanemine. Bakterite gramdiferentseerimist ilma värvimiseta tuleks kasutada ainult esialgseks diagnoosimiseks või grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite kolooniate ligikaudse suhte arvutamiseks. Elus- ja surnud rakkude identifitseerimine metüleensinisega värvimise teel Elus- ja surnud rakkude arvu saab määrata metüleensinise lahusega värvides. Meetod põhineb mikroorganismide elus- ja surnud rakkude erineval läbilaskvusel. Surnud rakkudes on rakkude läbilaskvus halvenenud, mistõttu värvaine läbib vabalt tsütoplasmamembraani ja adsorbeerub protoplasma poolt. Mikroskoobi all tunduvad surnud rakud sinised, elusad on värvitud või kahvatusinised. Värvimine toimub järgmiselt: alusklaasile kantakse tilk 2% metüleensinise lahust, kaetakse katteklaasiga, liigne värv tõmmatakse filterpaberiga maha. Ravimit vaadatakse mikroskoobi all, 10 vaateväljas loendatakse elusate ja surnud rakkude arv; surnud rakkude arvu väljendatakse protsentides. Näide: keskmine elusrakkude arv ühes vaateväljas on 10, surnud rakkude keskmine arv ühes vaateväljas on 5, koguarv rakke ühes vaateväljas rakud 100% 5 rakku X X 33,3% 15 Seega oli surnud rakkude arv uuritud mikroorganismide suspensioonis 33,3%. Rakkude suuruste määramine Mikroorganismirakkude suuruse määramiseks on vajalik spetsiaalne skaalaga okulaar (okulaarne mikromeeter) ja objekt-mikromeeter. Silma mikromeeter, 31

32 on kõige lihtsamal juhul tegemist klaaskettaga, millele on trükitud lineaarskaala, mis sisestatakse okulaari (joon. 14a). Objekt-mikromeeter on klaasplaat, mille keskele on graveeritud 1 mm pikkune lineaarne skaala jaotuse väärtusega 10 µm. Enne mõõtmist on vaja määrata silma mikromeetri jaotusväärtus iga mikroskoobi suurenduse kohta. Selleks asetatakse mikromeetri objekt mikroskoobi lavale ja käsitletakse preparaadina; sel juhul joondub üks objekt-mikromeetri nähtavatest jaotustest silma mikromeetri skaala nullmärgiga ja mõlema skaala jaotus langeb kokku (joon. 15). Loendage, mitu okulaari ja objektiivi jaotust sellele segmendile langeb, ja arvutage silma mikromeetri jaotuste väärtus. Kui pärast seda asetatakse objekt-mikromeetri asemel objektilauale mikroorganismide preparaat ja seda uuritakse 32

33 sama suurendusega on võimalik mõõta mikroobiraku suurust kasutades joonlauana silma mikromeetri skaalat. Täpse mõõtmise jaoks kasutatakse spetsiaalset libiseva nullmärgiga okulaarset mikromeetrit, mis on seotud mõõtetrumliga (joonis 14b). See võimaldab teil määrata mikroorganismide suurust kümnendiku mikroni täpsusega. Nullmärk on topelt vertikaalne joon, mille keskkoht vastab kahe peenikese joone ristumiskohale risti kujul. Enne mõõtmisi on vaja välja selgitada mõõtetrumli skaala jaotuse väärtus. Võrdlusobjektiks on mikromeeter. Mõõtetrumlit pöörates tõmmatakse objekti-mikromeetri skaala mitu jaotust ümber nullmärgiga. Topelt vertikaalne joon näitab mõõtetrumli täispöörete arvu. Mikroorganismide mõõtmiste läbiviimisel liigutage nullmärki mööda objekti ja lugege mõõtetrumli näidud. Praktiline osa Töö eesmärk on omandada mikroorganismide morfoloogia uurimise põhimeetodid. 33

34 Töökäsk 1. Valmistage piimhappebakterite fikseeritud preparaadid biokefiirist ja atsidofiilidest. 2. Gram-värvitud Bacillus subtilis (gram+) ja Escherichia coli (gram-) rakud. 3. Määrake Saccharomyces cerevisiae pärmirakkude suurus. 4. Määrake Saccharomyces cerevisiae elavate ja surnud rakkude arv pärmisuspensioonis. 34 Aruande sisu 1. Piimhappebakteri rakkude morfoloogia (piimhappebakterite fikseeritud preparaatide joonised koos mikroskoobi suurendusega). 2. Gramnegatiivsete ja grampositiivsete bakterite fikseeritud preparaatide joonised. 3. Silma mikromeetri mõõtetrumli jaotusväärtuse määramine. 4. Saccharomyces cerevisiae pärmiraku mõõtmed. 5. Elus- ja surnud rakkude arv pärmisuspensioonis. Kontrollküsimused 1. Kuidas valmistada fikseeritud bakteripreparaati? 2. Mis on bakterite erinevuse põhjus Grami pleki puhul? 3. Mis on Grami peitsimeetod? 4. Kuidas määrata mikroorganismide suurust? 5. Kuidas metüleensinisega värvides määrata mikroorganismide elusate ja surnud rakkude arvu? Teema 2. Mikroorganismide kasvatamine: toitekeskkonna valmistamise põhimõtted; steriliseerimismeetodid; põllukultuuride ja mikroorganismide subkultuuride meetodid. Toitekeskkonna klassifitseerimine ja valmistamine Mikroorganismide kasvatamine tähendab kunstlikku tingimuste loomist nende kasvuks. Kasvatamiseks

35 mikroorganismi laboris või tööstuses kasutatakse toitekeskkondi, mis sisaldavad kõiki mikroorganismide elutegevuseks vajalikke aineid. Keskkonnast satuvad toitained mikroorganismi rakku ja ainevahetusproduktid eemaldatakse rakust keskkonda. Mikroorganismide elutegevuseks on vajalik vesi, süsinik, hapnik, lämmastik, väävel, fosfor, kaalium, kaltsium, magneesium, raud ja mikroelemendid. Kõik need ained peavad sisalduma toitainekeskkonnas. Isegi ilma üheta neist kasv kas puudub või on see tühine. Süsinikku, vesinikku, lämmastikku, fosforit ja väävlit nimetatakse biogeenseteks elementideks, kuna need moodustavad umbes 90–95% rakkude kuivmassist. Kaaliumi, magneesiumi, kaltsiumi ja naatriumi nimetatakse makrotoitaineteks ehk tuhaelementideks. Need moodustavad kuni 5-10% rakkude kuivmassist. Rauda, ​​mangaani, molübdeeni, koobaltit, vaske, vanaadiumi, tsinki, niklit ja mõningaid teisi raskmetallide katioone nimetatakse mikroelementideks ja need moodustavad osa rakkude kuivmassist. Süsinik on iga elusorganismi jaoks kõige olulisem. See sisaldub kõigis orgaanilised molekulid rakus ja moodustab umbes 50% kuivast biomassist. Süsiniku suhtes jagunevad kõik organismid autotroofseteks ja heterotroofseteks. Autotroofid kasutavad süsinikdioksiidi süsinikuallikana. Heterotroofid vajavad valmis orgaanilisi ühendeid. Enamiku mikroorganismide jaoks võivad süsinikuallikaks olla mitmesugused orgaanilised ained: valgud ja nende lagunemissaadused, süsivesikud, rasvad, süsivesinikud. Lämmastiktoitumine on oma väärtuselt süsiniku järel teisel kohal. Lämmastik on osa aminohapetest ja muudest rakukomponentidest, mis tagavad organismide elujõulisuse. Lämmastik moodustab 14% rakkude kuivainest. Lämmastiku allikaks on lämmastikku sisaldavad orgaanilised või mineraalsed ühendid. Kõige levinumad mineraalse lämmastiku allikad on ammooniumisoolad ja nitraadid. Orgaaniliste lämmastikuallikatena kasutatakse valke, aminohappeid, nukleotiide. Mõned prokarüootid võivad kasutada õhulämmastikku. 35

36 Fosfor ja väävel on osa olulistest raku biopolümeeridest. Fosfor (3% raku kuivainest) on osa nukleotiididest ja ATP-st ning väävel (alla 1%) on osa mõnedest aminohapetest. Fosfori allikana kasutatakse tavaliselt fosfaate ja väävlid on sulfaadid. Fosforit ja väävlit saab kasutada ka orgaaniliste ühendite kujul. Mikroorganismide kasvuks on väikestes kogustes vaja makrotoitaineid: ioone leelismetallid(Na+, K+) ja leelismuldmetallid(Mg 2+, Ca 2+), mis mängivad oluline roll mikroorganismide tegevuses. Mikroobirakkudes olevad makrotoitained on vajalikud läbilaskvuse, osmootse rõhu ja pH reguleerimiseks. Lisaks nendele metallidele on mikroobide kasvuks vaja mitmeid mikroelemente (mikroelemente). Mineraalne koostis toitainekeskkond moodustab elektrilaengute jaotuse raku pinnal. Rakkude elektrilise potentsiaali muutmine võib muuta nende füsioloogilist aktiivsust. Mikroelementide üks peamisi funktsioone on osalemine ensümaatilises katalüüsis. Praegu on kõigi ensüümide neljanda osa toime rakus seotud metallidega. Lisaks toitekeskkonna põhikomponentidele on mõne mikroobi normaalseks arenguks vaja ka lisaaineid, mida nimetatakse "kasvufaktoriteks". Kasvufaktorid on erinevate ühendnimetused keemiline olemusühendused. Need on peamiselt orgaanilised ained, mille lisamine väga väikestes kogustes stimuleerib mikroorganismide kasvu ja paljunemist. Need on mikroobidele samad, nagu vitamiinid kõrgematele organismidele. Kasvufaktoriteks on peamiselt B-vitamiinid, mis täidavad mikroobide ainevahetuse regulaatorite ja stimulaatorite ehk aminohapete rolli. Kasvufaktoritena kasutatakse pärmi autolüsaati, pärmiekstrakti, looduslikke valke (veri, seerum) jne Mikroorganismide toitumisvajadused on väga mitmekesised. Sel põhjusel pole universaalset 36

37 sööde, mis sobib võrdselt kõigi mikroorganismide kasvatamiseks. Sõltuvalt kasvatamise eesmärkidest ja antud mikroorganismi vajadustest erinevad toitainekeskkonnad kolmel viisil: koostiselt, füüsiline seisund ja kohtumine. Koostise poolest jagunevad toitekeskkonnad kahte rühma: 1) looduslikud (looduslikud); 2) tehislik (sünteetiline). Looduslikud keskkonnad on need, millel on määramatu keemiline koostis, kuna need hõlmavad taimset või loomset päritolu tooteid, orgaanilisi ühendeid sisaldavad erinevate tööstusharude jäätmed. Looduslik toitainekeskkond tagab paljude erinevate mikroorganismide intensiivse kasvu. Need sisaldavad rikkalikku orgaaniliste ja anorgaaniliste ühendite komplekti, sealhulgas kõiki vajalikke elemente ja lisaaineid. Näiteks kasutatakse laboris kõige sagedamini järgmisi söötmeid. 1. Liha-peptoonpuljongi (MPB) ekstrakt lihast, sisaldab mittetäieliku valgu lagunemise peptoone, mis sisaldavad orgaanilist süsinikku, orgaanilist lämmastikku, fosforit sisaldavaid, väävlit sisaldavaid orgaanilisi aineid. BCH sisaldab ka kõiki mikroorganismidele vajalikke mineraale. MPB-d kasutatakse mitut tüüpi bakterite kasvatamisel. 2. Õllevirre ekstrakt idandatud odra teradest, sisaldab süsinikuallikana suhkrut (peamiselt maltoosi), lämmastikku sisaldavaid aineid, tuhaelemente, erinevaid kasvufaktoreid ja B-vitamiine.Õllevirre on hea keskkond paljude mikroorganismide, eelkõige pärmi arenguks , hallitusseened. Head looduslikud söötmed on piim, kartul, puu- ja juurviljade keetmine. Tööstuses kasutatakse tavaliselt poolsünteetilisi või looduslikke kandjaid. Väga sageli kasutatakse süsinikuallikana mikrobioloogilisi või toiduainetööstuse jäätmeid: melass (suhkrutootmise jäätmed), 37

Vene Föderatsiooni Põllumajandusministeerium Föderaalne kalapüügiagentuur Kamtšatka RIIKLIKU TEHNILISE ÜLIKOOLI BIOLOOGIA JA KEEMIA OSAKOND KEEMIA JA VEEMIKROBIOLOOGIA ETTEVALMISTAMINE

Perekonnanimi Kood Nimi Töökoht Piirkonnakood Kokku: XXXII ülevenemaalise piirkonnaetapi praktilise vooru ülesanded. BIOKEEMIA. EKSTRAKTIDE IDENTIFITSEERIMINE Varustus: Katseklaasid (3 katseklaasi ekstraktidega

Perekonnanimi Kood Nimi Linnaosa/linn Töökoha kood Kokku: Piirkonnaetapi praktilise vooru ÜLESANDED XXVIII Ülevenemaaline olümpiaad bioloogia õpilased. 2011-12 õppeaasta aastal. 11. klass BIOKEEMIA. Varustus,

MIKROBIOLOOGIA SELETUSKIRI KURSUSE "Mikrobioloogia" 9. klass" TÖÖPROGRAMMILE valikkursuse "Mikrobioloogia" autoriprogrammi alusel Averchinkova O.E. Bioloogia. valikkursused. Meditsiiniline

ÜLESANDED MIKROBIOLOOGIA (max 20 punkti) Töö eesmärk: Valmistada ja analüüsida preparaate kahest teadaolevast fermenteeritud piimatootest. Varustus: mikroskoobid, põletid või piirituslambid, slaidid,

KINGDOM OF PROKARYOOES BACTERIA SUBKINGDOM OF BACTERIA Bakterid on prokarüoodid. Need on kõige lihtsamad, väikseimad ja levinumad organismid, mis on Maal eksisteerinud üle 2 miljardi aasta, kuid koos

Süsteem MAHEMAAILMAS Kõik Maal eksisteerivad organismid on jagatud nelja kuningriiki: Drobyanki, Seened, Taimed, Loomad. Haavlid kuuluvad prokarüootidele (tuumaeelsetele organismidele), seentele, taimedele,

Projekti teema Moskva Butovski metsa seisvas veehoidlas elavate mikroorganismide uurimine Autor(id): Diana Kasaeva, Kristina Kasaeva, Alisa Tkachenko Kool: GBOU SOSH 1945 Hinne: 5. klass Juhendaja:

Laboratoorsed tööd "Kütseseente kehade ehitus" Eesmärk: uurida kübaraseente kehaehitust Varustus: kübaraseened (puravikud, rusikas, šampinjon, puravikud, võikakk, mesieseen jt), valmis.

LIITRIIGI KUTSEKÕRGE KÕRGE HARIDUSASUTUS "OMSKI RIIK PÕLLUÜLIKOOLI NIMI P.A. STOLYPINI JÄRGI" VETERINAARMEDITSIINI- JA BIOTEHNOLOOGIA INSTITUUT

Kinnitan Venemaa Föderatsiooni riikliku sanitaararsti asetäitja - Venemaa tervishoiuministeeriumi riikliku sanitaar- ja epidemioloogilise järelevalve föderaalse keskuse peaarsti E.N. BELYAEV 20. veebruar 2004 N 24FTs / 900 Kuupäev

Uurimine Pärm: väikeste seente põnev elu Töö autor: GBOU Gümnaasiumi 5 "B" klassi õpilane 1748 "Vertikaalne" Kutaytsev Georgi Valerievich Juhataja: Nosova Jelena Vladimirovna,

Pärm- ja hallitusseente tuvastamise meetod toiduainetes METOODILISED SOOVITUSED Pärm- ja hallitusseente tuvastamise meetodid toidus Juhised.- M.: föderaalne keskus

Teema 4. Bakterid. Seened. Samblikud. Osa A. 1. Sinivetikate esinemine samblikus tagab 1) õhu- ja mullaniiskuse imendumise 2) valguse kasutamise toitainete moodustamiseks

BIOLOOGIA ELUSLOODUSE TEADUS Bioloogiaõpingud: MIS BIOLOOGIA UURINGUD z elusorganismide ehitust ja elutähtsaid funktsioone; z seadused üksikisiku ja ajalooline areng organismid. 3 ORGAANILINE SÜSTEEM

1. Nitrifitseerivad bakterid liigitatakse 1) kemotroofide 2) fototroofide 3) saprotroofide 4) heterotroofide TEEMA "Fotosüntees" 2. Päikesevalguse energia muundub rakkudes keemiliseks energiaks 1) fototroofid.

MIKROBIOLOOGIA JA GENEETIKA Ülesanne 1. Valmistage ja analüüsige preparaate kahest teadaolevast fermenteeritud piimatootest. (max 10 punkti) Varustus: mikroskoobid, põletid või piirituslambid, slaidid,

Kvalifikatsioonitestid erialal "Bakterioloogia" Testiobjektide pank sertifitseerimiseks valmistumiseks Valige üks või mitu õiget vastust

Ülesanded 3. Ühe- ja mitmerakulised organismid. Seeneriik 1. Mida sisaldavad mucora seene pikkade okste otstes olevad mustad pallikesed? 1) mikroskoopilised puuviljad 2) toitained 3)

Föderaalosariigi eelarveline KÕRGHARIDUSASUTUS "ORENBURG STATE AGRARIAN UNIVERSITY" Üliõpilaste iseseisva töö juhend

Mikroorganismide morfoloogia Variant 1 1. Gratsilikuudid on: A. õhukese seinaga bakterid B. paksuseinalised bakterid C. defektse rakuseinaga bakterid. Õrna rakuseinaga G. bakterid. 2. K

Ülesanne õpilastele: on vaja valida õiged vastused (võib olla ühest mitmeni). Mikroorganismide morfoloogia Variant 1 1. Gratsilikaadid on: A. õhukese seinaga bakterid B. paksuseinalised

Vetikad Vetikad madalamad taimed Vetikad on ulatuslik ja heterogeenne madalamate taimede rühm. Vetikad on planeedi kõige arvukamad ja üks olulisemaid fotosünteetilisi organisme. Nad kohtuvad

Vallaeelarveline õppeasutus Alar kesk üldhariduslik kool"Ülevaadatud" Kaitseministeeriumi juhataja protokoll 0 a. "Kokkulepitud" Asedirektor veevarude majandamise alal MBOU 0 a "Kinnitan"

1 Mikroorganismidega töötamise põhimeetodid Ülesanne 1. Sissejuhatus mikrobioloogiasse Ohutusabinõud töötamisel mikroorganismidega Ülesande eesmärk. See ülesanne tutvustab teile ohutu töötamise reegleid

Ülesanded 2. Organismide rakuline ehitus 1. Mis keemiline element on osa raku elutähtsatest orgaanilistest ühenditest? 1) fluor 2) süsinik 3) vask 4) kaalium 2. Säilitusainena

Hallitusseente füüsikaliste tegurite mõju seente kasvule ja arengule. Logunov Stepan 7g Projektijuht Bulycheva M.B. Uuringu asjakohasus Seeneeosed on kahjulike mõjude suhtes väga vastupidavad

Test 5 Variant 1. Teema "Seened" Ülesanded ühe õige vastuse valikuga. 1. Peamine erinevus seente ja taimede vahel seisneb selles, et neil on rakuline struktuur, nad imavad mullast vett ja mineraalsooli,

1. Selgitus Programm on mõeldud FGBOU VPO BSU magistriõppesse kandideerijatele erialal 03.02.03 - Mikrobioloogia Kõrge kvalifikatsiooniga spetsialistide koolitamise programm suunal

ÜLDMIKROBIOLOOGIA
I peatükk. Mikroskoop ja mikroskoopia tehnika
1. Valgus-optiline mikroskoopia
2. Tumevälja mikroskoopia
3. Faaskontrastmikroskoopia
4. Luminestsents- (fluorestsents) mikroskoopia
II peatükk. Üldine arusaam kultiveerimisest, külvitehnikast ja mikroorganismidega töötamiseks vajalikest seadmetest
III peatükk. Mikroorganismide preparaatide valmistamise meetodid
IV peatükk. mikroobirakkude uurimine
1. Mikroorganismide rakkude vormid
2. Mikroorganismirakkude struktuur (tsütokeemilised uurimismeetodid)
3. Mikroorganismirakkude värvimine grammidega
4. Eoste värvumine bakterites
5. Kapsli värvimine
6. Lipude värvimine
7. Bakterite tuumaaine värvumine
8. Mikroorganismide rakusulgude värvimine
V peatükk. Mikroorganismide toitumine
1. Üksikute toitainete tähtsus
2. Kultuurisöötme valmistamine
3. Steriliseerimismeetodid
VI peatükk. Bakterite arvu arvestamine ja puhaskultuuri eraldamine
1. Mulla bakterite arvu arvestamine
2. Bakterite kvalitatiivse koostise määramine
3. Vees ja muudes vedelikes leiduvate mikroorganismide arvu arvestamine
4. Õhus leiduvate bakterite arvu arvestamine
5. Puhaste bakterikultuuride eraldamine
VII peatükk. Bakterite tüübi määramine
VIII peatükk. Lämmastikuvabaks muutmine mikroorganismide poolt orgaaniline aine
Käärimisprotsessid
1. Alkohoolne kääritamine
2. Piimhappe kääritamine
3. Võikäärimine
4. Pektiinainete kääritamine
5. Tselluloosi kääritamine
6. Kiudude oksüdatsioon
7. Rasvade oksüdatsioon
8. Süsivesinike oksüdatsioon
IX peatükk. Orgaaniliste ja mineraalsete lämmastikuühendite muundamine mikroorganismide poolt
1. Ammonifikatsioon
2. Nitrifikatsioon
3. Denitrifikatsioon (nitraatide hingamine)
4. Atmosfäärilämmastiku bioloogiline fikseerimine
X peatükk
1. Väävliühendite muundamine mikroorganismide toimel
2. Mikroorganismide osalemine raua muundamises
3. Fosforiühendite muundumine mikroorganismide poolt
PÕLLUMAJANDUSE MIKROBIOLOOGIA
XI peatükk. Pinnase üldine mikrobioloogiline analüüs
1. Uurimismeetodid
2. Mikroorganismide rühmad, söötmete koostis ja valmistamine
3. Keskmise mullaproovi võtmine ja proovi ettevalmistamine mikrobioloogiliseks analüüsiks
4. Pinnase suspensiooni valmistamine
5. Erinevate mikroorganismide rühmade arvestus
6. Mikroskoobi all otsese loendamisega mullas leiduvate mikroorganismide üldarvu määramine
XII peatükk. Mikroorganismide tsenooside uurimine
1. Klaasi saastumise meetod vastavalt N. G. Kholodnyle
2. Mikroobide tsenooside uurimine pinnases Perfilievi ja Gabe meetodil
3. Aristovskaja modifitseeritud Perfilievi kapillaarmeetod
4. Humiinainete lagundamisel osalevate autohtoonse rühma mikroorganismide tuvastamine vastavalt Winogradsky meetodile Tepperi modifitseerimisel
5. Huumusainete lagundamisel osalevate mikroorganismide tuvastamine Tepperi meetodi järgi
XIII peatükk. Mulla bioloogilise aktiivsuse määramine
1. Pinnase bioloogilise aktiivsuse määramine lõuendi lagunemise intensiivsuse järgi (Mishustini, Vostrovi ja Petrova meetod)
2. Mulla kogumikrobioloogilise aktiivsuse määramine ekskretsiooni teel süsinikdioksiid
3. Pinnase ammoniseeriva aktiivsuse määramine
4. Mikroorganismide ammoniseeriva aktiivsuse määramine
5. Mulla nitrifitseerimisaktiivsuse määramine
6. Pinnase denitrifikatsiooni aktiivsuse määramine
7. Mikroorganismide lämmastikku siduva aktiivsuse määramine
XIV peatükk. Bakterite uurimine taimede juurtevööndis ja juurtel
1. Bakterite arvestus risosfääris Krasilnikovi meetodil
2. Risosfääri ja juure mikrofloora arvestamine juurte järjestikuse pesemise meetodil vastavalt E. 3. Tepper
3. Mügarbakterite puhaskultuuride eraldamine, kvantitatiivne arvestus mullas, nende aktiivsuse ja virulentsuse määramine
XV peatükk. Bakteripreparaatide analüüs
XVI peatükk. Sööda mikrobioloogia
1. Teravilja epifüütne mikrofloora ja selle muutumine sööda säilitamisel
2. Siloanalüüs
3. Sööda pärmimine
XVII peatükk. Piima ja piimatoodete mikrofloora
1. Piima bakterioloogiline analüüs
2. Meetodid piimhappebakterite isoleerimiseks puhaskultuuri
3. Või mikroflooraga tutvumine
Kirjanduse indeks